本發(fā)明涉及一種啟動子，尤其涉及一種大豆圣豆9號GmNAC15基因的ABA誘導(dǎo)啟動子。

背景技術(shù)：

大豆，豆科(Fabaceae)，大豆屬(Glycine)，一年生草本，原產(chǎn)中國，中國各地均有栽培，亦廣泛栽培于世界各地。大豆(Glycine max(L.)Merr)是重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，富含高質(zhì)量的蛋白質(zhì)、脂肪和多種對人體有益的活性物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值。此外，大豆也是是食品、飼料等多種加工工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料，在國民經(jīng)濟(jì)中處于重要的地位。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，對大豆需求量也將不斷增大，然而大豆增產(chǎn)受環(huán)境惡化的限制日益明顯。干旱、鹽、極端溫度、化學(xué)毒害和氧化脅迫是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素，其中干旱和鹽害限制了大豆種植業(yè)的發(fā)展。

植物在復(fù)雜的自然環(huán)境中要維持正常生長，需要對內(nèi)外界刺激因子作出相應(yīng)的響應(yīng)，對植物自身各種功能基因作出精確的調(diào)控。目前已知，植物在抵抗干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫時存在4條信號傳導(dǎo)途徑：其中的2條屬于依賴ABA信號傳遞系統(tǒng)，而另外2條則不依賴ABA信號傳遞系統(tǒng)。在依賴ABA信號途徑I中需要MYC和MYB轉(zhuǎn)錄因子的生物合成從而激活下游抗逆基因表達(dá)。另一個依賴ABA信號途徑II則是激活bZIP類轉(zhuǎn)錄因子，由bZIP類轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子中的ABA反應(yīng)調(diào)節(jié)元件(ABRE PyCGTGGC)結(jié)合，從而調(diào)控下游抗逆基因表達(dá)。對于不依賴ABA信號傳導(dǎo)途徑III則通過激活DREB類轉(zhuǎn)錄因子，通過它識別下游基因啟動子區(qū)的DRE順式反應(yīng)元件從而調(diào)控下游目的基因表達(dá)。

利用逆境誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動抗逆基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)是培育抗逆作物新品種的有效方法。目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動子仍然很少，對于新的抗逆相關(guān)啟動子的發(fā)現(xiàn)、克隆、順式作用元件分析以及與順式元件相互作用的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后研究的重點，將功能明確的抗逆啟動子成功應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控抗逆基因的表達(dá)是植物抗逆基因工程的研究方向。NAC家族中逆境相關(guān)基因往往對多種逆境脅迫響應(yīng)，這大部分歸功與基因啟動上含有多種逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，通過對逆境相關(guān)的NAC家族基因啟動子研究可以得到多種與脅迫相關(guān)的關(guān)鍵DNA片段和順式作用元件，對構(gòu)建有效的逆境誘導(dǎo)型啟動子有重要意義。目前研究較深入的有：脫落酸響應(yīng)元件(ABA-responsive element,ABRE)、乙烯響應(yīng)元件(ethylene-responsive element,ERE)、茉莉酸類物質(zhì)應(yīng)答元件(jasmonate-responsive element,JRE)、低溫響應(yīng)元件(low-temprature reponsive element，LTRE)和干旱應(yīng)答元件(dehydration-responsive element，DRE)等。對植物啟動子的研究有助于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式和其調(diào)控機(jī)制，而對特異性及誘導(dǎo)性啟動子功能的研究，有助得到正常高效的特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。

本實驗室前期工作中已經(jīng)證明來源于耐鹽品種——圣豆9號的GmNAC15基因為鹽和ABA響應(yīng)基因，且對鹽脅迫為正調(diào)節(jié)作用(專利ZL2012101285907)。通過比較耐鹽大豆圣豆9號在鹽和非鹽條件下的基因表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)了GmNAC15基因在鹽處理下上調(diào)表達(dá)，將該基因的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，使轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得了非轉(zhuǎn)基因擬南芥所不具備的抗鹽/耐旱性的能力。同時在ABA處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率和葉氣孔導(dǎo)度高于非轉(zhuǎn)基因植株(對照)，表明GmNAC15基因通過ABA依賴途徑參與擬南芥抗旱/耐鹽性。通過大豆萌動胚真空滲透輔助的外源基因轉(zhuǎn)化方法將該基因的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大豆中，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因大豆植株比非轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽/耐旱性顯著地提高。同時在ABA處理下，轉(zhuǎn)基因大豆萌發(fā)率和氣孔導(dǎo)度均高于非轉(zhuǎn)基因植株(對照)，表明GmNAC15基因通過ABA依賴途徑參與大豆抗旱/耐鹽性。目前，GmNAC15基因參與ABA信號通路的機(jī)制并不明確，研究GmNAC15基因的ABA誘導(dǎo)啟動子可以幫助更好地闡釋GmNAC15基因的功能，同時研究GmNAC15啟動子的ABA誘導(dǎo)特性可為獲得通用型的ABA誘導(dǎo)型啟動子提供重要參考，將來可用于轉(zhuǎn)基因耐鹽作物的培育。但檢索發(fā)現(xiàn)，目前還未見有關(guān)于GmNAC15基因ABA誘導(dǎo)啟動子的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種大豆圣豆9號GmNAC15基因的ABA誘導(dǎo)啟動子及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的大豆圣豆9號GmNAC15基因的ABA誘導(dǎo)啟動子，其特征在于：所述ABA誘導(dǎo)啟動子的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

a)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列；

與序列表中SEQ ID No:1的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。

本發(fā)明還提供了一種含上述大豆圣豆9號GmNAC15基因ABA誘導(dǎo)啟動子的報告基因GUS表達(dá)載體pGmNAC15::pKGWFS7，該表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；以及一種含上述大豆圣豆9號GmNAC15基因ABA誘導(dǎo)啟動子的報告基因LUC表達(dá)載體pGmNAC15::pGreenII-0800LUC，該表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。

本發(fā)明所述大豆圣豆9號GmNAC15基因的ABA誘導(dǎo)啟動子在受ABA誘導(dǎo)高效啟動目標(biāo)基因表達(dá)中的應(yīng)用。

申請人首先在大豆圣豆9號植株中克隆到了GmNAC15基因啟動子；利用Gateway系統(tǒng)，經(jīng)過BP、LR反應(yīng)，將GmNAC15基因啟動子連接到GUS報告基因表達(dá)載體pKGWFS7(見圖2)上；將pGmNAC15::pKGWFS7載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，通過轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，以驗證GmNAC15基因啟動子功能。

申請人還通過酶切連接將GmNAC15基因啟動子連接到pGreenII-0800LUC載體中，通過擬南芥和大豆葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染體系，驗證GmNAC15基因啟動子受ABA誘導(dǎo)的功能。

實驗證實：本發(fā)明所述圣豆9號GmNAC15基因的ABA誘導(dǎo)啟動子能夠在ABA誘導(dǎo)條件下上調(diào)目標(biāo)基因的表達(dá)，可望用于轉(zhuǎn)基因抗逆植物的培育。其中所述植物優(yōu)選大豆或擬南芥。

本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在：利用PCR克隆技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了大豆圣豆9號GmNAC15基因啟動子，并驅(qū)動GUS報告基因在擬南芥中進(jìn)行表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因擬南芥獲得了非轉(zhuǎn)基因擬南芥所不具備表達(dá)GUS基因的能力，且在ABA誘導(dǎo)條件下能更高地表達(dá)。預(yù)示本發(fā)明所述的大豆圣豆9號GmNAC15基因及其ABA誘導(dǎo)啟動子可廣泛用于培育抗逆的植物品種。

附圖說明

圖1為PCR克隆大豆圣豆9號GmNAC15基因啟動子電泳圖，其中：M為Marker，泳道1、2為啟動子DNA。

圖2為pKGWFS7.0載體示意圖。

圖3為GmNAC15::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色結(jié)果

其中：A為轉(zhuǎn)基因擬南芥培養(yǎng)2天后全株的染色結(jié)果，在頂端分生組織、下胚軸的維管組織及根尖部位有GUS信號表達(dá)；B為種子萌發(fā)后7天，GUS基因在子葉葉脈、真葉、真葉基部、頂端分生組織、主根根尖部位及側(cè)根根尖中高表達(dá)；C為葉片；D為真葉基部、生長點；E為根尖；F為花序；G為角果。

圖4為GmNAC15::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥在有ABA(B)和無ABA(A)處理下GUS染色對比圖。(B顯示：ABA處理下在轉(zhuǎn)基因擬南芥中子葉的GUS信號增強(qiáng))。

圖5為pGreenII-0800LUC載體T-DNA插入?yún)^(qū)示意圖。

圖6為GmNAC15啟動子在ABA和非ABA條件下相對熒光素酶測定結(jié)果，其中，MOCK為轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體正常培養(yǎng)24h的相對熒光素酶活性，實驗組(ABA)為轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體用50mM ABA處理24h的相對熒光素酶活性。

具體實施方式

實施例1大豆GmNAC15基因啟動子的獲得

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上查到的GmNAC15基因轉(zhuǎn)錄起始位點ATG上游2026kb序列，設(shè)計啟動子引物(F：5’-CGCGTCGACCATGATTGCGAATTATTTATC-3’：5’-ACTGCAGGGGGGAAGACAGAGGGA-3’)利用CTAB法提取圣豆9號基因組DNA，將提取的基因組DNA稀釋到100ug/ul，用作擴(kuò)增啟動子模板。利用高保真酶HIFI(Takara)，擴(kuò)增GmNAC15基因啟動子。

1.1圣豆9號基因組DNA提取

(1)預(yù)先將CTAB提取液放到65℃水浴中預(yù)熱；

(2)將圣豆9號植物材料放入研缽中，在液氮的保護(hù)下將其研磨成粉末；

(3)等液氮揮發(fā)后，立即將100-200mg植物粉末轉(zhuǎn)入到1.5ml離心管中，然后迅速地加入65℃預(yù)熱的2％CTAB提取液650μl，迅速翻轉(zhuǎn)混勻，置于65℃水浴30min，期間每5min顛倒混勻一次；

(4)拿出材料冷卻至室溫，加入等體積酚/氯仿/異戊醇，混勻至乳白色，室溫12000rpm離心10min；

(5)將上清轉(zhuǎn)移至新的滅菌離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，室溫，12000rpm，離心10min；

(6)再將上清轉(zhuǎn)移至新的滅菌離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，-20℃放置20min；

(7)4℃，12000rpm，離心10min，棄上清，70％乙醇洗兩次，在超凈臺中吹干；

(8)沉淀溶于40μl雙蒸水(含0.1％RNase A)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 GmNAC15基因啟動子克隆

高保真酶HIFI擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下(50μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

PCR結(jié)束后，克隆產(chǎn)物于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結(jié)果如圖1所示。

1.3克隆基因片段的純化回收(天根試劑盒)

1)取500μl平衡液(BL)，添加到回收柱(CB2)中，12000rpm，離心1min；

2)將切下帶有目的片段的凝膠放入1.5ml離心管中，加入3倍體積的溶膠液，50℃溶膠10min，期間不時地翻轉(zhuǎn)；

3)凝膠完全融化后，轉(zhuǎn)移至平衡過的回收柱(CB2)中，12000rpm，離心1min；

4)向吸附柱(CB2)中加600μl的漂洗液(PW)，室溫2-5min，12000rpm，離心1min；

5)重復(fù)步驟4；

6)空柱，12000rpm，離心2min；

7)將回收柱子開蓋，在超凈臺中吹數(shù)分鐘干燥后，放入滅菌的1.5ml離心管，加入40μl預(yù)熱到60℃的EB緩沖液，放置1min；

8)12000rpm離心1min，所得溶液即含有回收片段。

1.4連接GmNAC15啟動子與pMD19-T載體

反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

16℃過夜連接。(pMD19-T載體購買自TAKARA公司)。

1.5大腸桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(無菌操作)

(1)將1-5μl連接產(chǎn)物加入50μl的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，在冰上放置30min；

(2)42℃水浴熱激90sec，立即放置冰上2-3min；

(3)在超凈臺中加入1ml LB培養(yǎng)基，37℃搖床上培養(yǎng)40-50min；

(4)室溫，5000rpm，離心3min；

(5)倒掉LB培養(yǎng)基，將菌涂布于含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平皿上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.6大腸桿菌PCR驗證

反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

PCR結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 DNA測序

用含有Amp(50mg/L)的液體LB搖PCR檢測為陽性的單菌落，37℃搖過夜，然后送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序，得到測序結(jié)果，啟動子DNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

經(jīng)過序列比對分析，上述DNA序列(SEQ ID No.1)與大豆Williams 82的核苷酸同源99.69％，三次生物學(xué)重復(fù)證明所述DNA序列(SEQ ID No.1)就是大豆圣豆9號GmNAC15基因啟動子，命名為大豆圣豆9號GmNAC15基因的ABA誘導(dǎo)啟動子。

1.8提取陽性大腸桿菌中pGmNAC15::pMD19-T質(zhì)粒(天根試劑盒)

(1)將測序正確的菌接種于10ml含有Amp(50mg/L)的液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖過夜；

(2)將菌液加入滅菌的1.5ml離心管中，12000rpm，離心1min，收集菌體；

(3)棄上清，加入250μl 4℃的P1溶液，用1ml的移液槍輕柔懸浮菌體；

(4)再加入250ul的P2溶液輕柔顛倒混勻，靜置5min；

(5)溶液澄清后加入350μl的P3溶液，輕輕混勻后放置5min；

(6)室溫，12,000rpm，離心10min，同時在吸附柱中加入600μl BL平衡液，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體；

(7)將離心后的上清轉(zhuǎn)移到平衡過的吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm，離心1min,倒掉收集管中的液體；

(8)在吸附柱中加入600μl漂洗液PW，室溫放置2min，12000rpm，離心1min，倒掉收集管中的液體，再重復(fù)一次；

(9)吸附柱空管12000rpm，離心5min；

(10)將吸附柱置于一個無菌的1.5ml離心管中，向吸附柱的中間部位滴加55μl預(yù)熱到65℃的EB洗脫液，室溫放置2min，12000rpm，離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.大豆圣豆9號GmNAC15基因啟動子序列分析

利用在線啟動子分析軟件PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對克隆得到的GmNAC15基因啟動子進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)在GmNAC15基因啟動子區(qū)域內(nèi)中預(yù)測的順式元件有34個可能與脅迫相關(guān)(如下表所示)，包括(2個)4個GT1GMSCAM4、6個ARE、1個DRE、3個GRE以及一些MYB、MYC和WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點表明該啟動子上含有豐富的脅迫相關(guān)順式作用元件，可能受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，參與植物對多種生物和非生物脅迫響應(yīng)。

實施例2，穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因技術(shù)分析GmNAC15啟動子活性

2.1.報告基因GUS表達(dá)載體pGmNAC15::GUS構(gòu)建

利用Gateway系統(tǒng)構(gòu)建啟動子pGmNAC15::GUS表達(dá)載體的流程如圖2所示，根據(jù)GmNAC15啟動子序列設(shè)計分別含有attB接頭的引物(引物對為5’-AAA AAG CAG GAC CGT CGT GTT CAC AAA TC-3’，R：5’-AGA AAG CTG GGT TTT TTC A AA AAC ACA ATT TCG-3’，下劃線處分別為attB1接頭和attB2接頭)。

2.1.1 PCR擴(kuò)增含有attB接頭的GmNAC15基因啟動子片段

(1)高保真酶HIFI進(jìn)行Gateway系統(tǒng)的第一輪擴(kuò)增(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

(2)高保真酶HIFI進(jìn)行Gateway系統(tǒng)的第二步擴(kuò)增。

attb引物序列：

attb-F：5’-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3’

attb-R：5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3’

反應(yīng)體系如下(50μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

2.1.2克隆基因片段的純化回收(天根試劑盒)(同1.3)

2.1.3克隆基因片段的BP反應(yīng)

BP反應(yīng)(Gateway系統(tǒng))體系如下：

25℃反應(yīng)8小時-過夜。

2.1.4大腸桿菌感受態(tài)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(同1.5)

2.1.5大腸桿菌PCR驗證(同1.6)

2.1.6 DNA測序(同1.8)

驗證連接到pDONR221中的GmNAC15啟動子克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.1.7大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取得到pGmNAC15::pDONR221質(zhì)粒(同1.7)

2.1.8克隆基因片段的LR反應(yīng)

LR反應(yīng)(Gateway系統(tǒng))體系如下：

25℃反應(yīng)8小時-過夜。pKGWFS7載體示意圖如圖2所示(pKGWFS7購買自Invitrogen公司)。

2.1.9大腸桿菌感受態(tài)的制備和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(同1.5)

2.1.10大腸桿菌PCR驗證(同1.6)

2.1.11大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取(同1.8)

驗證轉(zhuǎn)入pKGWFS7載體的陽性質(zhì)粒的pGmNAC15::pKGWFS7即pGmNAC15::GUS克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.1.12農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備(無菌操作)

(1)取農(nóng)桿菌GV3101菌種接種于10ml YEP液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)過夜；

(2)按1：50接種于50ml YEP液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)3-4小時，至OD₆₀₀值為0.4-0.6；

(3)4℃，4200rpm，離心10min，收集菌體；

(4)棄上清，加入10ml預(yù)冷的0.15M的NaCl懸浮菌體；

(5)重復(fù)步驟3；

(6)棄上清，加入2ml預(yù)冷的20mM的CaCl₂懸浮菌體，分裝于1.5ml離心管中，現(xiàn)用或加入終體積7％DMSO經(jīng)液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.13農(nóng)桿菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(無菌操作)

(1)將10μl質(zhì)粒DNA加入50μl的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈離心管混勻，冰浴30min；

(2)液氮速凍1min；然后37℃水浴5min，立即冰浴2-3min；

(3)加入1ml YEP培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2-4h；

(4)室溫，4000rpm，離心3min，收集菌體；

(5)將菌涂布于含有相應(yīng)抗生素的YEP培養(yǎng)平板上，28℃倒置培養(yǎng)48h。

2.1.14轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的PCR驗證

反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.2在擬南芥中驗證圣豆9號GmNAC15基因啟動子的功能驗證

2.2.1花侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥

(1)擬南芥(Col-0野生型)生長至抽苔1cm時，將頂端減掉以誘導(dǎo)側(cè)生花序的生成；

(2)在轉(zhuǎn)化前一天，取1ml活化過的含有表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101加到含相應(yīng)抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至OD600約為1.0-1.2；

(3)室溫，4200rpm,離心10min，收集菌體，用浸染液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)重懸菌體，使OD600約為0.8；

(4)用移液器將農(nóng)桿菌滴到花序上進(jìn)行浸染，待所有花序都被侵染后，將擬南芥放入真空干燥器中抽真空1min；

(5)用保鮮袋覆蓋花序，至于20-22℃避光培養(yǎng)一天剪開頂部露出花序，再培養(yǎng)一天后揭去保鮮袋，培養(yǎng)至種子成熟。

2.2.2擬南芥種子的表面消毒

將適量待滅菌的擬南芥中子放入1.5ml離心管中，加入1ml 75％的乙醇(含有0.03％體積比的TritonX-100)震蕩消毒1min，再用70％的乙醇震蕩消毒1min(兩次)，最后用吸頭將種子吸到無菌濾紙上吹干，然后用無菌的牙簽將其點入培養(yǎng)基中。

2.2.3轉(zhuǎn)基因植株的篩選

利用花侵染法通過農(nóng)桿菌將pGmNAC15::GUS載體轉(zhuǎn)入擬南芥中。將收獲的T0代種子播在含有50mg/L卡鈉霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，種子萌發(fā)10天后，將葉片為綠色，根較長的小苗移入土中，待苗快抽苔時取少量葉片粗提基因組DNA，采取PCR方法驗證轉(zhuǎn)基因植株，引物為att B1/2。待陽性植株成熟并收獲T1代種子。T1代種子用含有50mg/L卡鈉霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，選取抗性：

非抗性比為3:1的單拷貝插入株系，種植陽性植株，成熟后即收獲T2代種子。T2代種子經(jīng)過卡鈉霉素抗性篩選得到轉(zhuǎn)基因純合系。

2.2.4轉(zhuǎn)基因擬南芥分析GmNAC15啟動子

為了分析GmNAC15啟動子的活性和組織特異性，對pGmNAC15::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行GUS組織染色。結(jié)果顯示，pGmNAC15::GUS在萌發(fā)兩天時，GUS基因在頂端分生組織、下胚軸的維管組織及根尖部位表達(dá)(圖3-A)；種子萌發(fā)后7天，GUS基因在在子葉葉脈、真葉、真葉基部、頂端分生組織、主根根尖部位及側(cè)根根尖中高表達(dá)(圖3-B/C/E/G)，。轉(zhuǎn)基因植株的花器官中有強(qiáng)GUS基因表達(dá)：雄蕊部分，花瓣、花絲和萼片中GUS表達(dá)水平較高，在花藥中未檢測到GUS信號(圖3-G)；雌蕊部分，GUS信號主要集中在花柱和柱頭中；在成熟的角果中，果皮和果柄處都檢測到顯著的GUS信號(圖3-H)。實驗結(jié)果表明克隆得到的GmNAC15啟動子具有較強(qiáng)的啟動子活性，還具有時空特異性，能啟動外源基因在擬南芥特定發(fā)育時期的特定組織中高表達(dá)。

實施例3.利用擬南芥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化技術(shù)驗證GmNAC15啟動子受ABA誘導(dǎo)。

3.1 GmNAC15啟動子pGreen II-0800LUC載體的構(gòu)建

3.1.1克隆含有酶切位點的GmNAC15啟動子片段

利用雙酶切-連接法構(gòu)建GmNAC15啟動子的雙熒光報告載體pGreen II-0800LUC。利用Primer 5對圣豆9號GmNAC15啟動子上的限制性酶切位點分析，與pGreen II-0800LUC的多克隆位點(pGreen II-0800LUC載體T-DNA插入?yún)^(qū)如圖5所示)進(jìn)行比較，篩選出可用酶切位點為Sal I和Pst I。

利用GmNAC15含有酶切位點的引物(F：5’-ACG CGT CGA CAC CGT CGT GTT CAC AAA TC-3’，R：5’-AAC TGC AGT TTT TCA AAA ACA CAA TTT CG-3’)PCR擴(kuò)增GmNAC15啟動子，

高保真酶HIFI擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下(20μl體系)：

擴(kuò)增條件如下：

反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于0.8％TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3.1.2膠回收PCR產(chǎn)物(同1.3)

3.1.3 Sal I和Pst I分別雙酶切PCR產(chǎn)物和pGreen II-0800LUC載體過夜。

反應(yīng)體系如下：

37℃過夜充分酶切。

3.1.4第二天膠回收酶切產(chǎn)物及pGreen II-0800LUC載體。(同1.3)

3.1.5將回收的酶切產(chǎn)物和載體進(jìn)行連接反應(yīng)過夜。(同1.4)

3.1.6大腸桿菌感受態(tài)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。(同1.5)

3.1.7大腸桿菌PCR驗證。(同1.6)

3.1.8 DNA測序(同1.7)。

驗證連接到pGreenII-0800LUC中的GmNAC15啟動子克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.1.9大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取得到pGmNAC15::pGreenII-0800LUC質(zhì)粒：無內(nèi)毒素質(zhì)粒純化DNA純化體系(NucleoBond Xtra Midi EF)(MACHEREY-NAGEL)

(1).菌體培養(yǎng)收集：4500g，15min，4℃

(2).菌體裂解：8ml Buffer RES-EF徹底重懸菌體，加入8ml Buffer LYS-EF裂解菌體，輕柔混勻，常溫裂解5min；

(3).平衡柱子和濾頭：15ml Buffer EQU-EF

(4).中和:8ml NEU-EF,輕柔混合10-15次，冰上放置5min

(5).凈化和裝柱裂解液：顛倒試管3次，將裂解液倒入柱子中

(6).1st洗：5ml Buffer FIL-EF

(7).去除過濾柱：去除Nucleobond Xtra Column Filter

(8).2ed洗：35ml Buffer ENDO-EF

(9).溶解：5ml ELU-EF

(14).沉淀：3.5ml異丙醇，15000g，4℃，30min

(15).清洗和干燥DNA沉淀：2ml 70％乙醇常溫，5min，15000g，常溫，5min

(16).溶解DNA：加入適量體積的H2O-EF，使DNA濃度達(dá)到1000ug/ml，-20℃保存。

3.2 GmNAC15啟動子對ABA的響應(yīng)情況

為了分析GmNAC15基因啟動子對脅迫的響應(yīng)情況，對pGmNAC15::GUS擬南芥進(jìn)行脅迫處理，通過GUS染色檢測GUS基因的表達(dá)變化。將在1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周的pGmNAC15::GUS轉(zhuǎn)基因幼苗，移植到含有多種脅迫分子的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行脅迫處理，分別進(jìn)行了不同濃度梯度的ABA和MOCK處理，在3h、6h和24h時取材進(jìn)行GUS染色。結(jié)果表明，GUS染色強(qiáng)度僅在ABA處理24h時具有顯著增強(qiáng)，且增強(qiáng)區(qū)域主要在子葉，根尖GUS染色程度的增強(qiáng)不明顯(圖4)。實驗結(jié)果表明，GmNAC15啟動子具有ABA處理誘導(dǎo)表達(dá)的特性，且其誘導(dǎo)表達(dá)主要發(fā)生在子葉中。

3.3利用LUC報告基因定量檢測GmNAC15啟動子不同5’缺失片段的活性

利用Promega Luciferase Assay System檢測啟動子LUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體相對熒光素酶活性，操作參照說明書。將-80℃的原生質(zhì)體拿出放在冰上融化，取20ul原生質(zhì)體溶液+20ul Luciferase Reagent，25℃反應(yīng)10min后測定螢火蟲發(fā)光值，加入20ul Stop& Reagent測定，25℃反應(yīng)10min，測定海腎發(fā)光值。計算相對熒光素酶活性值，相對活性值＝螢火蟲發(fā)光值/海腎發(fā)光值。GmNAC15啟動子的相對活性值和受A BA誘導(dǎo)情況如圖6所示，結(jié)果證明，在ABA誘導(dǎo)下，GmNAC15啟動子能上調(diào)驅(qū)動報告基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆原生質(zhì)體中的表達(dá)，GmNAC15啟動子具有ABA誘導(dǎo)功能，能夠用于今后GmNAC15基因耐鹽/旱調(diào)控機(jī)制研究，預(yù)示著將來廣泛地應(yīng)用于培育耐鹽/旱轉(zhuǎn)基因植物。

序列表

<110>山東大學(xué)

<120>一種大豆圣豆9號GmNAC15基因的ABA誘導(dǎo)啟動子

<141> 2016-11-30

<160> 3

<210> 1

<211> 2004

<212> DNA

<213>大豆屬大豆（Glycine max.）

<221>大豆圣豆9號GmNAC15基因的ABA誘導(dǎo)啟動子

<222>（1）…（2004）

<400>1

catgattgcg aattatttat catttaaaca aattgcctag aatgagttac aactttaaat 60

tgaccgaatt gtatgggtta aattgattaa aaaaattatt aactaactat ttaagttgaa 120

agtattcaat aaagttatct aactttcttt tgataaaata aaattaacta actagccaat 180

gcatataaat taatgtaaaa aggtaaaacc atgtgtacgc gtatataata attttaaaaa 240

aatggaaaaa aaaactgtaa agttcccagt ttataaaaaa tacattattt ttattaactt 300

atgaaaaaaa attaaaatta aaattttctt taaaaaaatc tctgtaatta aactcccctg 360

ataacttatt ttttgtcaaa taaagtaatt aattaactta taattttccc aacacacaca 420

taaacgtaag acacagaata ctaaataata atttgagctg agtaatgtgg tgtttgacta 480

gtgcttaatt taatttaaaa acacttgttc cacactccca agtaacttag acgtttccat 540

tattttgaga ataaactggg aaaataaaca acaaattagg cccacataga aatataatat 600

gactggaaaa cacacgatca tgtctgatat agaatagatt ttctcattgg ttttatatgg 660

ctatagtttt tatgcatgta gctttaataa gaatatatgc caatttgtat ggttagtcga 720

tttcagcgta atttagaccc ttaagttatt gaaaagctaa cagaatattt taattgatct 780

gaaaatgatt tcgcaagtgt atgtttacgt tcacggctcc ttaaatcaat gtggtacaat 840

aaattaattt ttcatttgag tctcagaaac ataattaatt atttgtgatc taaaaaaaat 900

cttgagcaag cgtaaacctt aaaaatgaaa agcttactca aagctaaaaa gtaaatggta 960

aagtagaaac atatggagta gtaaatcttt gttaaaataa ataatattat tttcaggaga 1020

ctttttataa gaaaaaatga aagagaagtg aggaaataaa aatttacatc tataattatt 1080

aataacaaat aattatccta tttggtgtat acatcttatt agacaattta atccttaaat 1140

tatttctttt aacttagatt aacttttata cttttacatt taacttctat tatagtatta 1200

atcttgtaaa tgtagaagct aacagaagag agagagagag agagagagag gggaaggggt 1260

aagtaaaggt aataccgaca gaaaggggtg tgtctgaaga agttacgtta ggagcaccaa 1320

aacgaaacgg cagaggagag actagtggtt gggtaagggt tgagtttccg tacaaattaa 1380

ctgttgcttc ttttaagggg ccagggtgag ttgcgttgca aaatctgata gtattcatct 1440

catttcattt gttccccgtt aagggagaga cagggttact tgtgtacttt cactcactca 1500

ctcactcact cactctccag ctgtatccaa tcacataagc tgacttcatt gcattctctc 1560

gcctcatttt tattttaact aacaaaaatc cttacttttt ttacatttca taaaacatac 1620

tctacttttc tttctttttg ttttgttcaa ggaaggaaca ctgtgacagt agaagcaagc 1680

aagaattgga attggaattg gaattggaat gaattctcct cctcctccaa gaccaagagt 1740

ggagaggtcg agcggaacta ggctagcagc agtttccaca caagccaaaa ccaaaaccaa 1800

aaccaaaacc aaaataaaaa ctgtagttgt caaagtaaaa gaaaggttga gtctagttta 1860

cgccaaatgt gtcttcttat tcttctcctt cttgtcagac ccattactat aaaagaagcc 1920

acactgcatc cttctccata cccttttact ttctttatcc aataataata actccatttt 1980

ccctctgtct tccccccctc ctct 2004

<210> 2

<211> 13046

<212> DNA

<213>人工序列

<221>報告基因GUS表達(dá)載體pGmNAC15::pKGWFS7

<222>（1）…（13046）

<400>2

tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc 60

atccgtgttt caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga 120

gcaaagtctg ccgccttaca acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc 180

ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctggtg 240

gcaggatata ttgtggtgta aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga 300

cgtttttaat gtactgaatt aacgccgaat tgaattatca gcttgcatgc cggtcgatct 360

agtaacatag atgacaccgc gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt 420

tctatcgcgt attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat 480

aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag aaattatatg 540

ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga aactttattg ccaaatgttt 600

gaacgatctg cttgactcta gctagagtcc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg 660

tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg 720

aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct 780

atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg 840

ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccgt gggtcacgac gagatcctcg 900

ccgtcgggca tccgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc 960

tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg 1020

atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc 1080

cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga 1140

tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg 1200

agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct 1260

tggagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc 1320

gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag 1380

ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc 1440

atgcctcgat cgagttgaga gtgaatatga gactctaatt ggataccgag gggaatttat 1500

ggaacgtcag tggagcattt ttgacaagaa atatttgcta gctgatagtg accttaggcg 1560

acttttgaac gcgcaataat ggtttctgac gtatgtgctt agctcattaa actccagaaa 1620

cccgcggctg agtggctcct tcaacgttgc ggttctgtca gttccaaacg taaaacggct 1680

tgtcccgcgt catcggcggg ggtcataacg tgactccctt aattctcatg tataattcga 1740

gctcggtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagctct cccatatggt 1800

cgacctgcag gcggccgcac tagtgatatc acaagtttgt acaaaaaagc tgaaccatga 1860

ttgcgaatta tttatcattt aaacaaattg cctagaatga gttacaactt taaattgacc 1920

gaattgtatg ggttaaattg attaaaaaaa ttattaacta actatttaag ttgaaagtat 1980

tcaataaagt tatctaactt tcttttgata aaataaaatt aactaactag ccaatgcata 2040

taaattaatg taaaaaggta aaaccatgtg tacgcgtata taataatttt aaaaaaatgg 2100

aaaaaaaaac tgtaaagttc ccagtttata aaaaatacat tatttttatt aacttatgaa 2160

aaaaaattaa aattaaaatt ttctttaaaa aaatctctgt aattaaactc ccctgataac 2220

ttattttttg tcaaataaag taattaatta acttataatt ttcccaacac acacataaac 2280

gtaagacaca gaatactaaa taataatttg agctgagtaa tgtggtgttt gactagtgct 2340

taatttaatt taaaaacact tgttccacac tcccaagtaa cttagacgtt tccattattt 2400

tgagaataaa ctgggaaaat aaacaacaaa ttaggcccac atagaaatat aatatgactg 2460

gaaaacacac gatcatgtct gatatagaat agattttctc attggtttta tatggctata 2520

gtttttatgc atgtagcttt aataagaata tatgccaatt tgtatggtta gtcgatttca 2580

gcgtaattta gacccttaag ttattgaaaa gctaacagaa tattttaatt gatctgaaaa 2640

tgatttcgca agtgtatgtt tacgttcacg gctccttaaa tcaatgtggt acaataaatt 2700

aatttttcat ttgagtctca gaaacataat taattatttg tgatctaaaa aaaatcttga 2760

gcaagcgtaa accttaaaaa tgaaaagctt actcaaagct aaaaagtaaa tggtaaagta 2820

gaaacatatg gagtagtaaa tctttgttaa aataaataat attattttca ggagactttt 2880

tataagaaaa aatgaaagag aagtgaggaa ataaaaattt acatctataa ttattaataa 2940

caaataatta tcctatttgg tgtatacatc ttattagaca atttaatcct taaattattt 3000

cttttaactt agattaactt ttatactttt acatttaact tctattatag tattaatctt 3060

gtaaatgtag aagctaacag aagagagaga gagagagaga gagaggggaa ggggtaagta 3120

aaggtaatac cgacagaaag gggtgtgtct gaagaagtta cgttaggagc accaaaacga 3180

aacggcagag gagagactag tggttgggta agggttgagt ttccgtacaa attaactgtt 3240

gcttctttta aggggccagg gtgagttgcg ttgcaaaatc tgatagtatt catctcattt 3300

catttgttcc ccgttaaggg agagacaggg ttacttgtgt actttcactc actcactcac 3360

tcactcactc tccagctgta tccaatcaca taagctgact tcattgcatt ctctcgcctc 3420

atttttattt taactaacaa aaatccttac tttttttaca tttcataaaa catactctac 3480

ttttctttct ttttgttttg ttcaaggaag gaacactgtg acagtagaag caagcaagaa 3540

ttggaattgg aattggaatt ggaatgaatt ctcctcctcc tccaagacca agagtggaga 3600

ggtcgagcgg aactaggcta gcagcagttt ccacacaagc caaaaccaaa accaaaacca 3660

aaaccaaaat aaaaactgta gttgtcaaag taaaagaaag gttgagtcta gtttacgcca 3720

aatgtgtctt cttattcttc tccttcttgt cagacccatt actataaaag aagccacact 3780

gcatccttct ccataccctt ttactttctt tatccaataa taataactcc attttccctc 3840

tgtcttcccc ccctcctctc agctttcttg tacaaagtgg tgatatcccg cggatggtga 3900

gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg 3960

taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc 4020

tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga 4080

ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg 4140

acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg 4200

acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc 4260

gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg 4320

agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca 4380

aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact 4440

accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga 4500

gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg 4560

agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag cccggcatgt 4620

tacgtcctgt agaaacccca acccgtgaaa tcaaaaaact cgacggcctg tgggcattca 4680

gtctggatcg cgaaaactgt ggaattgatc agcgttggtg ggaaagcgcg ttacaagaaa 4740

gccgggcaat tgctgtgcca ggcagtttta acgatcagtt cgccgatgca gatattcgta 4800

attatgcggg caacgtctgg tatcagcgcg aagtctttat accgaaaggt tgggcaggcc 4860

agcgtatcgt gctgcgtttc gatgcggtca ctcattacgg caaagtgtgg gtcaataatc 4920

aggaagtgat ggagcatcag ggcggctata cgccatttga agccgatgtc acgccgtatg 4980

ttattgccgg gaaaagtgta cgtatcaccg tttgtgtgaa caacgaactg aactggcaga 5040

ctatcccgcc gggaatggtg attaccgacg aaaacggcaa gaaaaagcag tcttacttcc 5100

atgatttctt taactatgcc ggaatccatc gcagcgtaat gctctacacc acgccgaaca 5160

cctgggtgga cgatatcacc gtggtgacgc atgtcgcgca agactgtaac cacgcgtctg 5220

ttgactggca ggtggtggcc aatggtgatg tcagcgttga actgcgtgat gcggatcaac 5280

aggtggttgc aactggacaa ggcactagcg ggactttgca agtggtgaat ccgcacctct 5340

ggcaaccggg tgaaggttat ctctatgaac tgtgcgtcac agccaaaagc cagacagagt 5400

gtgatatcta cccgcttcgc gtcggcatcc ggtcagtggc agtgaagggc caacagttcc 5460

tgattaacca caaaccgttc tactttactg gctttggtcg tcatgaagat gcggacttac 5520

gtggcaaagg attcgataac gtgctgatgg tgcacgacca cgcattaatg gactggattg 5580

gggccaactc ctaccgtacc tcgcattacc cttacgctga agagatgctc gactgggcag 5640

atgaacatgg catcgtggtg attgatgaaa ctgctgctgt cggctttaac ctctctttag 5700

gcattggttt cgaagcgggc aacaagccga aagaactgta cagcgaagag gcagtcaacg 5760

gggaaactca gcaagcgcac ttacaggcga ttaaagagct gatagcgcgt gacaaaaacc 5820

acccaagcgt ggtgatgtgg agtattgcca acgaaccgga tacccgtccg caagtgcacg 5880

ggaatatttc gccactggcg gaagcaacgc gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct 5940

gcgtcaatgt aatgttctgc gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc 6000

tgtgcctgaa ccgttattac ggatggtatg tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga 6060

aggtactgga aaaagaactt ctggcctggc aggagaaact gcatcagccg attatcatca 6120

ccgaatacgg cgtggatacg ttagccgggc tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg 6180

aagagtatca gtgtgcatgg ctggatatgt atcaccgcgt ctttgatcgc gtcagcgccg 6240

tcgtcggtga acaggtatgg aatttcgccg attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg 6300

ttggcggtaa caagaaaggg atcttcactc gcgaccgcaa accgaagtcg gcggcttttc 6360

tgctgcaaaa acgctggact ggcatgaact tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac 6420

aatgaccatg gcggccggga gcatgcggcc atgctagagt ccgcaaaaat caccagtctc 6480

tctctacaaa tctatctctc tctatttttc tccagaataa tgtgtgagta gttcccagat 6540

aagggaatta gggttcttat agggtttcgc tcatgtgttg agcatataag aaacccttag 6600

tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa 6660

tccagtgacc tgcaggcatg cgacgtcgag cttagcttga gcttggatca gattgtcgtt 6720

tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga 6780

gaaaagagcg tttattagaa taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc 6840

gtccatttgt atgtgcatgc caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc 6900

aacccctccg ctgctatagt gcagtcggct tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa 6960

acgacatgtc gcacaagtcc taagttacgc gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc 7020

gttttcttgt cgcgtgtttt agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag aaccggagac 7080

attacgccat gaacaagagc gccgccgctg gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg 7140

acgaccagga cttgaccaac caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt 7200

tttccgagaa gatcaccggc accaggcgcg accgcccgga gctggccagg atgcttgacc 7260

acctacgccc tggcgacgtt gtgacagtga ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc 7320

gcgacctact ggacattgcc gagcgcatcc aggaggccgg cgcgggcctg cgtagcctgg 7380

cagagccgtg ggccgacacc accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg 7440

gcattgccga gttcgagcgt tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg 7500

ccaaggcccg aggcgtgaag tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc 7560

acgcccgcga gctgatcgac caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg 7620

gcgtgcatcg ctcgaccctg taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg 7680

aggccaggcg gcgcggtgcc ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg 7740

ccgccgagaa tgaacgccaa gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga 7800

accgtttttc attaccgaag agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga 7860

gccgcccgcg cacgtctcaa ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc 7920

caagctggcg gcctggccgg ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa 7980

aaggtgatgt gtatttgagt aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg 8040

atgagtaaat aaacaaatac gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag 8100

aaaggcgggt caggcaagac gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc 8160

ggggccgatg ttctgttagt cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc 8220

gtgcgggaag atcaaccgct aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac 8280

gtgaaggcca tcggccggcg cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac 8340

ttggctgtgt ccgcgatcaa ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct 8400

tacgacatat gggccaccgc cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg 8460

gatggaaggc tacaagcggc ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc 8520

ggtgaggttg ccgaggcgct ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg 8580

cagcgcgtga gctacccagg cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc 8640

gagggcgacg ctgcccgcga ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt 8700

tgagttaatg aggtaaagag aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc 8760

cgagcgcacg cagcagcaag gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga 8820

agcgggtcaa ctttcagttg ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac 8880

gccaaggcaa gaccattacc gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa 8940

tgagcaaatg aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat 9000

caagaacaac caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg 9060

ccaggcgtaa gcggctgggt tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc 9120

gaggaatcgg cgtgacggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg 9180

tgatgacctg gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc 9240

agaagcacgc cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg 9300

gcaaccgccg gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc 9360

agattttttc gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga 9420

cgtggccgtt ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga 9480

gcttccagac gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga 9540

ttacgacctg gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga 9600

agggaaggga gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt 9660

ctgccggcga gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt 9720

aaacaccacg cacgttgcca tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac 9780

ggtatccgag ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg 9840

gccggagtac atcgagatcg agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa 9900

gaacccggac gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg 9960

ttttctctac cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa 10020

gacgatctac gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg 10080

caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc 10140

tggcccgatc ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc 10200

ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg 10260

tctctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa 10320

cccgtacatt gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga 10380

tataaaagag aaaaaaggcg atttttccgc ctaaaactct ttaaaactta ttaaaactct 10440

taaaacccgc ctggcctgtg cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa 10500

agcgcctacc cttcggtcgc tgcgctccct acgccccgcc gcttcgcgtc ggcctatcgc 10560

ggccgctggc cgctcaaaaa tggctggcct acggccaggc aatctaccag ggcgcggaca 10620

agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg cccacatcaa ggcaccctgc ctcgcgcgtt 10680

tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc 10740

tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt 10800

gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta 10860

tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag 10920

atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 10980

gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 11040

atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 11100

caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 11160

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 11220

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 11280

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 11340

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 11400

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 11460

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 11520

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 11580

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 11640

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 11700

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 11760

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcat gatatatctc ccaatttgtg 11820

tagggcttat tatgcacgct taaaaataat aaaagcagac ttgacctgat agtttggctg 11880

tgagcaatta tgtgcttagt gcatctaatc gcttgagtta acgccggcga agcggcgtcg 11940

gcttgaacga atttctagct agacattatt tgccgactac cttggtgatc tcgcctttca 12000

cgtagtggac aaattcttcc aactgatctg cgcgcgaggc caagcgatct tcttcttgtc 12060

caagataagc ctgtctagct tcaagtatga cgggctgata ctgggccggc aggcgctcca 12120

ttgcccagtc ggcagcgaca tccttcggcg cgattttgcc ggttactgcg ctgtaccaaa 12180

tgcgggacaa cgtaagcact acatttcgct catcgccagc ccagtcgggc ggcgagttcc 12240

atagcgttaa ggtttcattt agcgcctcaa atagatcctg ttcaggaacc ggatcaaaga 12300

gttcctccgc cgctggacct accaaggcaa cgctatgttc tcttgctttt gtcagcaaga 12360

tagccagatc aatgtcgatc gtggctggct cgaagatacc tgcaagaatg tcattgcgct 12420

gccattctcc aaattgcagt tcgcgcttag ctggataacg ccacggaatg atgtcgtcgt 12480

gcacaacaat ggtgacttct acagcgcgga gaatctcgct ctctccaggg gaagccgaag 12540

tttccaaaag gtcgttgatc aaagctcgcc gcgttgtttc atcaagcctt acggtcaccg 12600

taaccagcaa atcaatatca ctgtgtggct tcaggccgcc atccactgcg gagccgtaca 12660

aatgtacggc cagcaacgtc ggttcgagat ggcgctcgat gacgccaact acctctgata 12720

gttgagtcga tacttcggcg atcaccgctt cccccatgat gtttaacttt gttttagggc 12780

gactgccctg ctgcgtaaca tcgttgctgc tccataacat caaacatcga cccacggcgt 12840

aacgcgcttg ctgcttggat gcccgaggca tagactgtac cccaaaaaaa catgtcataa 12900

caagaagcca tgaaaaccgc cactgcgccg ttaccaccgc tgcgttcggt caaggttctg 12960

gaccagttgc gtgacggcag ttacgctact tgcattacag cttacgaacc gaacgaggct 13020

tatgtccact gggttcgtgc ccgaat 13046

<210> 3

<211> 5871

<212> DNA

<213>人工序列

<221>報告基因LUC表達(dá)載體pGmNAC15::pGreenII-0800LUC

<222>（1）…（5871）

<400>3

agatcttggc aggatatatt gtggtgtaac gttatcgtac ccctactcca aaaatgtcaa 60

agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatttcggg 120

aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcgaaagga cagtagaaaa 180

ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatca ttcaagatgc 240

ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 300

agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gacatctcca ctgacgtaag 360

ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt 420

tcatttggag aggacagccc accaccatga cttcgaaagt ttatgatcca gaacaaagga 480

aacggatgat aactggtccg cagtggtggg ccagatgtaa acaaatgaat gttcttgatt 540

catttattaa ttattatgat tcagaaaaac atgcagaaaa tgctgttatt tttttacatg 600

gtaacgcggc ctcttcttat ttatggcgac atgttgtgcc acatattgag ccagtagcgc 660

ggtgtattat accagacctt attggtatgg gcaaatcagg caaatctggt aatggttctt 720

ataggttact tgatcattac aaatatctta ctgcatggtt tgaacttctt aatttaccaa 780

agaagatcat ttttgtcggc catgattggg gtgcttgttt ggcatttcat tatagctatg 840

agcatcaaga taagatcaaa gcaatagttc acgctgaaag tgtagtagat gtgattgaat 900

catgggatga atggcctgat attgaagaag atattgcgtt gatcaaatct gaagaaggag 960

aaaaaatggt tttggagaat aacttcttcg tggaaaccat gttgccatca aaaatcatga 1020

gaaagttaga accagaagaa tttgcagcat atcttgaacc attcaaagag aaaggtgaag 1080

ttcgtcgtcc aacattatca tggcctcgtg aaatcccgtt agtaaaaggt ggtaaacctg 1140

acgttgtaca aattgttagg aattataatg cttatctacg tgcaagtgat gatttaccaa 1200

aaatgtttat tgaatcggac ccaggattct tttccaatgc tattgttgaa ggtgccaaga 1260

agtttcctaa tactgaattt gtcaaagtaa aaggtcttca tttttcgcaa gaagatgcac 1320

ctgatgaaat gggaaaatat atcaaatcgt tcgttgagcg agttctcaaa aatgaacaat 1380

aattctagcc ggtacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct ctctctattt 1440

tctccataaa taatgtgtga gtagtttccc gataagggaa attagggttc ttatagggtt 1500

tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt 1560

ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcgataa 1620

cattaacgtt tacaatttcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1680

ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 1740

aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1800

gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgaccatga 1860

ttgcgaatta tttatcattt aaacaaattg cctagaatga gttacaactt taaattgacc 1920

gaattgtatg ggttaaattg attaaaaaaa ttattaacta actatttaag ttgaaagtat 1980

tcaataaagt tatctaactt tcttttgata aaataaaatt aactaactag ccaatgcata 2040

taaattaatg taaaaaggta aaaccatgtg tacgcgtata taataatttt aaaaaaatgg 2100

aaaaaaaaac tgtaaagttc ccagtttata aaaaatacat tatttttatt aacttatgaa 2160

aaaaaattaa aattaaaatt ttctttaaaa aaatctctgt aattaaactc ccctgataac 2220

ttattttttg tcaaataaag taattaatta acttataatt ttcccaacac acacataaac 2280

gtaagacaca gaatactaaa taataatttg agctgagtaa tgtggtgttt gactagtgct 2340

taatttaatt taaaaacact tgttccacac tcccaagtaa cttagacgtt tccattattt 2400

tgagaataaa ctgggaaaat aaacaacaaa ttaggcccac atagaaatat aatatgactg 2460

gaaaacacac gatcatgtct gatatagaat agattttctc attggtttta tatggctata 2520

gtttttatgc atgtagcttt aataagaata tatgccaatt tgtatggtta gtcgatttca 2580

gcgtaattta gacccttaag ttattgaaaa gctaacagaa tattttaatt gatctgaaaa 2640

tgatttcgca agtgtatgtt tacgttcacg gctccttaaa tcaatgtggt acaataaatt 2700

aatttttcat ttgagtctca gaaacataat taattatttg tgatctaaaa aaaatcttga 2760

gcaagcgtaa accttaaaaa tgaaaagctt actcaaagct aaaaagtaaa tggtaaagta 2820

gaaacatatg gagtagtaaa tctttgttaa aataaataat attattttca ggagactttt 2880

tataagaaaa aatgaaagag aagtgaggaa ataaaaattt acatctataa ttattaataa 2940

caaataatta tcctatttgg tgtatacatc ttattagaca atttaatcct taaattattt 3000

cttttaactt agattaactt ttatactttt acatttaact tctattatag tattaatctt 3060

gtaaatgtag aagctaacag aagagagaga gagagagaga gagaggggaa ggggtaagta 3120

aaggtaatac cgacagaaag gggtgtgtct gaagaagtta cgttaggagc accaaaacga 3180

aacggcagag gagagactag tggttgggta agggttgagt ttccgtacaa attaactgtt 3240

gcttctttta aggggccagg gtgagttgcg ttgcaaaatc tgatagtatt catctcattt 3300

catttgttcc ccgttaaggg agagacaggg ttacttgtgt actttcactc actcactcac 3360

tcactcactc tccagctgta tccaatcaca taagctgact tcattgcatt ctctcgcctc 3420

atttttattt taactaacaa aaatccttac tttttttaca tttcataaaa catactctac 3480

ttttctttct ttttgttttg ttcaaggaag gaacactgtg acagtagaag caagcaagaa 3540

ttggaattgg aattggaatt ggaatgaatt ctcctcctcc tccaagacca agagtggaga 3600

ggtcgagcgg aactaggcta gcagcagttt ccacacaagc caaaaccaaa accaaaacca 3660

aaaccaaaat aaaaactgta gttgtcaaag taaaagaaag gttgagtcta gtttacgcca 3720

aatgtgtctt cttattcttc tccttcttgt cagacccatt actataaaag aagccacact 3780

gcatccttct ccataccctt ttactttctt tatccaataa taataactcc attttccctc 3840

tgtcttcccc ccctcctctc tgcagcccgg gggatccact agttctagag cggccgccac 3900

cgcggtggag atcgaattcc catggaagac gccaaaaaca taaagaaagg cccggcgcca 3960

ttctatccgc tggaagatgg aaccgctgga gagcaactgc ataaggctat gaagagatac 4020

gccctggttc ctggaacaat tgcttttaca gatgcacata tcgaggtgga catcacttac 4080

gctgagtact tcgaaatgtc cgttcggttg gcagaagcta tgaaacgata tgggctgaat 4140

acaaatcaca gaatcgtcgt atgcagtgaa aactctcttc aattctttat gccggtgttg 4200

ggcgcgttat ttatcggagt tgcagttgcg cccgcgaacg acatttataa tgaacgtgaa 4260

ttgctcaaca gtatgggcat ttcgcagcct accgtggtgt tcgtttccaa aaaggggttg 4320

caaaaaattt tgaacgtgca aaaaaagctc ccaatcatcc aaaaaattat tatcatggat 4380

tctaaaacgg attaccaggg atttcagtcg atgtacacgt tcgtcacatc tcatctacct 4440

cccggtttta atgaatacga ttttgtgcca gagtccttcg atagggacaa gacaattgca 4500

ctgatcatga actcctctgg atctactggt ctgcctaaag gtgtcgctct gcctcataga 4560

actgcctgcg tgagattctc gcatgccaga gatcctattt ttggcaatca aatcattccg 4620

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tctggtggcg ctcccctctc taaggaagtc ggggaagcgg ttgccaagag gttccatctg 4920

ccaggtatca ggcaaggata tgggctcact gagactacat cagctattct gattacaccc 4980

gagggggatg ataaaccggg cgcggtcggt aaagttgttc cattttttga agcgaaggtt 5040

gtggatctgg ataccgggaa aacgctgggc gttaatcaaa gaggcgaact gtgtgtgaga 5100

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aaggatggat ggctacattc tggagacata gcttactggg acgaagacga acacttcttc 5220

atcgttgacc gcctgaagtc tctgattaag tacaaaggct atcaggtggc tcccgctgaa 5280

ttggaatcca tcttgctcca acaccccaac atcttcgacg caggtgtcgc aggtcttccc 5340

gacgatgacg ccggtgaact tcccgccgcc gttgttgttt tggagcacgg aaagacgatg 5400

acggaaaaag agatcgtgga ttacgtcgcc agtcaagtaa caaccgcgaa aaagttgcgc 5460

ggaggagttg tgtttgtgga cgaagtaccg aaaggtctta ccggaaaact cgacgcaaga 5520

aaaatcagag agatcctcat aaaggccaag aagggcggaa agatcgccgt gtaattctag 5580

agaattcgct gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctctctat tttctccata 5640

aataatgtgt gagtagtttc ccgataaggg aaattagggt tcttataggg tttcgctcat 5700

gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat 5760

aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca gtactaaaat ccagatccac tagccttgac 5820

aggatatatt ggcgggtaaa ctaagtcgct gtatgtgttt gtttgagatc t 5871