本發(fā)明涉及中藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及提取中藥材中的有效成分，并在提高CIK細(xì)胞增殖速率、CD3和CD56雙陽(yáng)性和對(duì)腫瘤殺傷力的臨床的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞過(guò)繼免疫治療是目前的研究熱點(diǎn)，并已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，它是將體外激活的自體或異體免疫效應(yīng)細(xì)胞輸注給患者，殺滅患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上修復(fù)、完善機(jī)體免疫系統(tǒng)的生物治療方法。CIK細(xì)胞(cytokine-induced-killer cells)是一群在體外經(jīng)過(guò)多種細(xì)胞因子共同誘導(dǎo)，能夠同時(shí)表達(dá)兩種膜蛋白分子即CD3和CD56的異質(zhì)細(xì)胞，它不僅具有自然殺傷細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性殺瘤特點(diǎn)，還具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性，具有重要的免疫治療臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，CIK細(xì)胞的體外大量增殖，即提高其體外增殖速率和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，是大規(guī)模使用CIK細(xì)胞免疫治療的關(guān)鍵所在。多糖作為一種免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)劑對(duì)巨噬細(xì)胞、T/B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)和淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)的功能都有調(diào)節(jié)作用，本發(fā)明應(yīng)用人參多糖對(duì)CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)方面的研究有助于其更好地應(yīng)用于臨床。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

利用人參多糖提取液有機(jī)地結(jié)合CIK細(xì)胞免疫治療在腫瘤治療中的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，建立人參多糖促進(jìn)免疫細(xì)胞的大量增殖和提高殺傷力的工藝體系，從而間接改善腫瘤患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。本發(fā)明目的在于提供最優(yōu)人參多糖提取液濃度在提高CIK細(xì)胞增殖速率、CD3和CD56雙陽(yáng)性和對(duì)腫瘤殺傷力方面的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖分化的人參多糖，所述人參多糖是采用水提醇沉法從人參中提取得到。

本發(fā)明提供了一種CIK細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和人參多糖。

進(jìn)一步地，所述人參多糖在培養(yǎng)基中的含量為3～300μg/mL。優(yōu)選的，所述人參多糖在培養(yǎng)基中的含量為30μg/mL。

進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基選自RPM1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基或MEM培養(yǎng)基。

進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基中還包括IFN-γ和CD3單抗。

本發(fā)明提供了一種CIK細(xì)胞培養(yǎng)的方法，包括以下步驟：

(1)制備CIK細(xì)胞的出發(fā)細(xì)胞；

(2)配制含有人參多糖的培養(yǎng)基，并添加入步驟(1)中的出發(fā)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)獲得CIK細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述人參多糖在培養(yǎng)基中的含量為3～300μg/mL。優(yōu)選的，所述人參多糖在培養(yǎng)基中的含量為30μg/mL。

進(jìn)一步地，所述培養(yǎng)基中還包括IFN-γ和CD3單抗。

進(jìn)一步地，步驟(2)的方法包括37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d，定期更換1/2對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液。

本發(fā)明還提供人參多糖在促CIK細(xì)胞增殖分化中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了利用所述制備方法制得的CIK細(xì)胞在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

以上所述人參多糖采用經(jīng)水提醇沉法從人參中提取得到。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種水提醇沉法提取人參多糖的方法，包括以下步驟：

(1)取人參，加入10倍重量水，煎煮3次，第1次提取時(shí)間為2h，第2次1.5h，第3次1h。合并煎液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至原體積的0.1-0.4倍；加入95％的乙醇使?jié)饪s液含醇量為80％，4℃冷藏靜置過(guò)夜，將冷藏后的藥液用離心機(jī)低溫離心20-40分鐘(離心轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分)、收集沉淀，沉淀低溫干燥得人參多糖粗品；

(2)人參多糖粗品加10倍重量水加熱煮沸10-30分鐘，降溫，過(guò)濾，向?yàn)V液中加入95％的乙醇使含醇量為80％，4℃冷藏靜置過(guò)夜，將冷藏后的藥液用離心機(jī)在4℃下離心20-40分鐘(離心轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分)，收集沉淀；

(3)重復(fù)水煮醇沉、冷藏離心過(guò)程2-3次，得到人參多糖沉淀；人參多糖沉淀加10倍重量水溶解，藥液用冷凍離心機(jī)在-20℃凍實(shí)后，在4℃下融解離心20-30分鐘(離心轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分)，取上清液，上清液重復(fù)凍融離心1次后，將上清減壓，減壓濃縮，在4℃下干燥得到人參多糖精品。

本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明所述的人參多糖與其他化學(xué)誘導(dǎo)增殖因子相比，符合細(xì)胞培養(yǎng)要求，即對(duì)人體無(wú)毒副作用，故誘導(dǎo)增殖后的CIK細(xì)胞直接可以用于臨床試驗(yàn)。(2)與相應(yīng)的多糖刺激因子相比，本發(fā)明所述的多糖提取方法精練，劑型先進(jìn)，該多糖提取液功效明顯，成分明確，質(zhì)量可控。(3)本發(fā)明所述的人參多糖具有明顯提高CIK細(xì)胞增殖速率的作用，CD3和CD56雙陽(yáng)性顯著提高，激活后的細(xì)胞殺傷力明顯高于對(duì)照CIK細(xì)胞處理。

附圖說(shuō)明

圖1人參多糖不同濃度誘導(dǎo)細(xì)胞增值趨勢(shì)圖。

圖2最優(yōu)濃度人參多糖誘導(dǎo)后CIK細(xì)胞的表型。其中A:30μg/mL人參多糖；B:空白培養(yǎng)基。

圖3最優(yōu)濃度人參多糖誘導(dǎo)后CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷力評(píng)價(jià)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。這些具體的實(shí)施例僅僅是在不違背本發(fā)明精神下的有限列舉，并不排除本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員把現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明結(jié)合而產(chǎn)生的其他具體的實(shí)施方案，或者利用已有的臨床中藥注射劑而產(chǎn)生的其他具體的實(shí)施方案。

主要材料的準(zhǔn)備。

一種對(duì)CIK細(xì)胞增殖分化有明顯提高作用的人參多糖，所述多糖提取物的方法，包括如下步驟：

(1)取人參，加入水煎煮。合并煎液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮后；加入95％的乙醇使?jié)饪s液含醇量為80％，4℃冷藏靜置過(guò)夜，將冷藏后的藥液用離心機(jī)低溫離心、收集沉淀，沉淀低溫干燥得人參多糖粗品；

(2)人參多糖粗品加水煮沸，降溫，過(guò)濾，向?yàn)V液中加入95％的乙醇使含醇量為80％，4℃冷藏靜置過(guò)夜，將冷藏后的藥液離心后收集沉淀；

(3)重復(fù)水煮醇沉、冷藏離心過(guò)程數(shù)次，得到人參多糖沉淀；人參多糖沉淀加水溶解，藥液冷凍后，在4℃下融解離心。取上清液重復(fù)凍融離心后，將上清液減壓濃縮，在4℃下干燥得到人參多糖精品。

(4)精密稱取經(jīng)50℃真空干燥的人參多糖0.1g，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，用移液管移取1mL至25mL容量瓶中，加水定容至25mL。所配得的溶液即為人參多糖溶液。

實(shí)施例l一種人參多糖的提取方法

取人參1kg，加入10倍重量水，煎煮3次，第1次提取時(shí)間為2h，第2次1.5h，第3次1h。合并煎液，過(guò)濾，濾液減壓濃縮至原體積的0.1-0.4倍；加入95％的乙醇使?jié)饪s液含醇量為80％，4℃冷藏靜置過(guò)夜，將冷藏后的藥液用離心機(jī)低溫離心20-40分鐘(離心轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分)、收集沉淀，沉淀低溫干燥得人參多糖粗品；人參多糖粗品加10倍重量水加熱煮沸10-30分鐘，降溫，過(guò)濾，向?yàn)V液中加入95％的乙醇使含醇量為80％，4℃冷藏靜置過(guò)夜，將冷藏后的藥液用離心機(jī)在4℃下離心20-40分鐘(離心轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分)，收集沉淀；重復(fù)水煮醇沉、冷藏離心過(guò)程2-3次，得到人參多糖沉淀；人參多糖沉淀加10倍重量水溶解，藥液用冷凍離心機(jī)在-20℃凍實(shí)后，在4℃下融解離心20-30分鐘(離心轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分)，取上清液，上清液重復(fù)凍融離心1次后，將上清減壓，減壓濃縮，在4℃下干燥得到人參多糖精品。

精密稱取經(jīng)50℃真空干燥的人參多糖0.1g，加水溶解，定容至50mL容量瓶中，用移液管移取1mL至25mL容量瓶中，加水定容至25mL。所配得的溶液即為人參多糖溶液。

實(shí)施例2利用細(xì)胞增殖速率篩選人參多糖的最優(yōu)濃度

按常規(guī)CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法，即第0天加入IFN-γ(1 000U/mL)，CD3單抗(25ng/mL)，置于CO₂培養(yǎng)箱37℃孵育24h后獲得的CIK細(xì)胞作為出發(fā)細(xì)胞。

在出發(fā)細(xì)胞中分別加入含3種濃度梯度的人參多糖(已高溫滅菌)的RPMI1640培養(yǎng)基，置于12孔板內(nèi)培養(yǎng)，其中濃度梯度為300μg/mL、30μg/mL、3μg/mL(即沒(méi)1mL培養(yǎng)體系中含有的人參多糖的量分別為300μg、30μg和3μg/mL)；將加入不含人參多糖的RPMI 1640培養(yǎng)基作為對(duì)照，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d，定期更換1/2對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液(定期是指根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況來(lái)確定，例如約3d更換培養(yǎng)基)。每天計(jì)算細(xì)胞濃度，分析每組細(xì)胞的增殖趨勢(shì)

結(jié)果見(jiàn)圖1。從對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與不含人參多糖的對(duì)照相比，實(shí)驗(yàn)組的300μg/mL、30μg/mL、3μg/mL三組濃度梯度均能有效提高CIK細(xì)胞增殖速率，其中人參多糖的最優(yōu)濃度為30μg/mL。

實(shí)施例3在最優(yōu)濃度下的進(jìn)行細(xì)胞流式檢測(cè)細(xì)胞表型。

將上述方法獲得的CIK出發(fā)細(xì)胞分別進(jìn)行測(cè)試，A、B組代表最優(yōu)濃度的人參多糖RPMI 1640培養(yǎng)基和不含人參多糖的RPMI 1640培養(yǎng)基(對(duì)照)。37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，約3d更換1/2對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液。培養(yǎng)7d后將細(xì)胞液混勻取出置于15mL離心管中，1500rpm離心15min后分別加入CD₃FITC-H、CD₅₆PE-H單抗各10μl，室溫避光孵育30min。流式細(xì)胞儀(Flow cytometry)檢測(cè)細(xì)胞，Cellquest軟件獲取分析細(xì)胞。30μg/mL人參多糖誘導(dǎo)后的細(xì)胞雙陽(yáng)性為0.63％(圖2A)，為對(duì)照0.35％(圖2B)的1.8倍。細(xì)胞經(jīng)過(guò)多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)后，具有CD3﹢單陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增加；人參多糖誘導(dǎo)后為51.65％，為對(duì)照40.48％的1.27倍。

實(shí)施例4在最優(yōu)濃度誘導(dǎo)下的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力測(cè)定。

在人參多糖的最優(yōu)濃度下，用人參多糖培養(yǎng)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶中已培養(yǎng)7d的細(xì)胞吸出置于15mL離心管中，離心棄去上清液，用0.9％NaCl洗脫CIK細(xì)胞兩次后，加0.8mL RPMI 1640培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)，得出細(xì)胞濃度。棄去A549腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的上清液，加1.5mL胰酶漂洗并棄去漂洗液，再加入1mL胰酶，37℃，3min。輕拍后加5mL預(yù)熱的RPMI 1640終止反應(yīng)。1200rpm，5min離心收集腫瘤細(xì)胞，洗脫兩次后，加10mL培養(yǎng)液，計(jì)數(shù)，得出細(xì)胞濃度。稀釋細(xì)胞濃度，并按細(xì)胞個(gè)數(shù)比等體積加液(CIK細(xì)胞液與A549腫瘤細(xì)胞液各100μl，共200μl一孔)。陽(yáng)性對(duì)照：100μl腫瘤細(xì)胞稀釋液+100μlCIK細(xì)胞液，陰性對(duì)照：200μlCIK細(xì)胞液。加好液后，放于37度，CO2濃度5％培養(yǎng)12小時(shí)。2小時(shí)后取出孔板，將原各孔中200μl液體吸去并用200μl RPMI 1640培養(yǎng)基清洗5次。各孔平均加入100ul含10％CCK8的RPMI 1640培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，放于37度，CO2濃度5％中培養(yǎng)4小時(shí)。取出孔板，拿到酶標(biāo)儀上檢測(cè)，得出人參多糖誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力結(jié)果。結(jié)果如圖3所示，在靶效比E：T＝10：1時(shí)，人參多糖誘導(dǎo)后的CIK細(xì)胞對(duì)A549腫瘤細(xì)胞的殺傷力達(dá)到97.4％，明顯高于對(duì)照。