本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于檢測PRRSV和PEDV雙重RT-PCR的方法及引物。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome vires，PRRSV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病，我國俗稱豬“藍耳病”。PRRSV具有宿主專一性，僅感染豬，引起母豬繁殖障礙，仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。PRRS1996年在我國首發(fā)，2001年我國爆發(fā)普通藍耳病，而后繼續(xù)發(fā)展成2006年的高致病性藍耳病大流行。PRRS對我國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大威脅，造成嚴重經(jīng)濟損失。豬流行性腹瀉病(porcine epidemic diarrhea,PED)是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的另一種高度接觸性病毒傳染病。1980年，我國首次出現(xiàn)豬流行性腹瀉的相關(guān)報道，而后多省不斷有流行性腹瀉的發(fā)生，2010年，豬流行性腹瀉再次在我國大規(guī)模爆發(fā)。近年來，豬流行性腹瀉的流行趨勢逐漸擴大，季節(jié)性越來越不明顯。豬感染流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可感染各品種、各年齡段的豬，發(fā)病豬表現(xiàn)為食欲飲欲下降、嘔吐、急性腹瀉、脫水，哺乳仔豬消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，一但發(fā)病，死亡率可達100％。

PRRSV和PEDV均為常見的RNA病毒，近年來二者呈現(xiàn)出混合感染的特點。當發(fā)生PRRSV和PEDV的交叉感染時，根據(jù)流行病學和臨床癥狀很難對其進行確診，實驗室檢測技術(shù)是確診二者混合感染的有效手段。目前實驗室最常用的方法是PCR方法。單一的PCR方法只能對單一病原進行檢測，一但發(fā)生混合感染，繼續(xù)使用單一PCR方法進行疫病檢測就會出現(xiàn)操作復雜、檢測時間長、實驗成本增加等缺點。多重PCR方法能同時對多種病原體做出快速、準確的鑒別診斷，經(jīng)濟、快捷、系統(tǒng)，在混合感染的確診上具有明顯優(yōu)越性和極高的使用價值。目前，實際生產(chǎn)中常出現(xiàn)PRRSV和PEDV混合感染的情況，但卻缺少能同時對這兩種病毒進行檢測的PCR方法。

目前，在臨床檢測中有分別針對PRRSV和PEDV的單一RT-PCR方法，該技術(shù)能快速準確地對這兩種病毒進行確診。2000年，婁高明，李雪梅等(婁高明，李雪梅，殷震.豬繁殖與呼吸道綜合征診斷方法的研究進展[J].中國獸醫(yī)雜志，1998，02:38-41.)針對PRRSV的ORF7基因設(shè)計了一對特異性引物，建立了豬繁殖與綜合征RT-PCR的診斷方法，該方法能特異性擴增出433bp(歐洲株)和468bp(美洲株)的目的片段，對臨床上快速、準確地檢測PRRSV有極大意義。吳玉璐，程群(吳玉璐，程群，虞凌雪，侯怡軒，王康，劉光清，童光志，周艷君.豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷方法的建立[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2013，20:4370-4377.)于2013年建了豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR檢測方法。其根據(jù)豬流行性腹瀉病毒ORF3基因設(shè)計了特異性引物，能對自然感染毒株基因擴增出片段約300bp，弱毒株疫苗則能擴增出約250bp的片段。PEDV的RT-PCR檢測方法的建立為豬流行性腹瀉病的疫情診斷和流行病學監(jiān)測提供了一種特異、快速的檢測方法。

PRRSV和PEDV的單一RT-PCR方法只能對固定的病毒進行檢測，不能同時對兩種病毒進行檢測。當發(fā)生PRRSV和PEDV混合感染時，再使用單一的RT-PCR方法對其進行檢測將暴露出操作復雜、檢測時間長、實驗成本增加等缺點。在實際生產(chǎn)中常出現(xiàn)PRRSV和PEDV混合感染的情況，但卻缺少能同時對這兩種病毒進行檢測的RT-PCR方法。本發(fā)明針對PRRSV的ORF7基因和PEDV的S基因，分別設(shè)計特異性引物，通過對反應體系中各組分的優(yōu)化，實現(xiàn)了兩種病毒在同一反應體系中的同時擴增。本研究建立的雙重RT-PCR方法能快速有效地對PRRSV和PEDV進行診斷，對實際生產(chǎn)有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種用于檢測PRRSV和PEDV雙重RT-PCR的方法及引物。引物包括PRRSV引物對和PEDV引物對；PRRSV引物對包括引物PRRSV-P1和引物PRRSV-P2，所述PEDV引物對包括引物PEDV-P1和引物PEDV-P2；所述引物PRRSV-P1、引物PRRSV-P2、引物PEDV-P1和引物PEDV-P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

進一步地，PRRSV引物對用于檢測PRRSV，所述PEDV引物對用于檢測PEDV。

本發(fā)明公開了一種用于檢測PRRSV和PEDV雙重RT-PCR的方法，包括以下步驟：

1)提取待測樣品中病毒RNA；

2)將步驟1)得到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；

3)將步驟2)得到的cDNA進行PCR擴增，回收目的片段克隆到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入DH5α中，篩選，搖菌，抽提質(zhì)粒；

4)將步驟3)得到的陽性質(zhì)粒針對其中目的基因進行PCR擴增；

5)對擴增產(chǎn)物測序，以確定其中是否含有目的基因；

其中所述PRRSV目的基因是PRRSV的ORF7基因，所述PEDV目的基因是PEDV的S基因。

進一步地，步驟1)中提取待測樣品中病毒RNA具體為：將待測樣品組織多點取樣約5g，剪碎，液氮充分研磨，加入生理鹽水稀釋做10倍稀釋，-20℃反復凍融3次，5000r/min離心5分鐘，取上清置于DEPC水預處理過的EP管保存，備用，用TRIZOL法抽提病毒RNA。

進一步地，步驟3)中用于PCR擴增的引物是引物PEDV-P1、引物PEDV-P2、引物PEDV-P1和引物PEDV-P2；所述引物PEDV-P1、引物PEDV-P2、引物PEDV-P1和引物PEDV-P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

進一步地，步驟3)中的PCR擴增中PCR反應體系為25μL，其中引物PRRSV-P1、引物PRRSV-P2、引物PEDV-P1和引物PEDV-P2各1ul，PRRSV和PEDV陽性模板各1μL，10×Raction Buffer(Mg²⁺plus)2μL，dNTP Mix 1.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL。

進一步地，RT-PCR擴增的退火溫度為52.4℃。

進一步地，步驟3)中的PCR擴增中PCR反應條件為：95℃5min；95℃30s，52℃30s,72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

本發(fā)明針對PRRSV的ORF7基因和豬流行性腹瀉病毒的S基因，分別設(shè)計特異性引物，在同一反應體系實現(xiàn)了兩種病毒的同時擴增，能快速簡便地對兩種病毒進行檢測，對實際生產(chǎn)有重要意義。

當然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明不同緩沖液的RT-PCR擴增結(jié)果，其中，M：DNA分子質(zhì)量標準；1：陰性對照；2：無Mg²⁺的緩沖液(含10×Reaction Buffer Mg²⁺free、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶)；3：含Mg²⁺的緩沖液(含10×Reaction Buffer Mg²⁺plus、dNTP Mix、Taq DNA聚合酶)4：PEDV；5：PRRSV；

圖2是本發(fā)明雙重RT-PCR Mg²⁺的優(yōu)化結(jié)果，其中，M：DNA分子質(zhì)量標準；1：0.5μL；2：1μL；3：1.5μL；4：2μL；5：2.5μL；

圖3是本發(fā)明雙重RT-PCR Taq DNA聚合酶的優(yōu)化結(jié)果；其中，M：DNA分子質(zhì)量標準；1：0.1μL；2：0.2μL；3：0.3μL；4：0.4μL；5：0.5μL；

圖4是本發(fā)明雙重RT-PCR dNTPMix的優(yōu)化結(jié)果；其中，M：DNA分子質(zhì)量標準；1：0.5μL；2：1μL；3：1.5μL；4：2μL；5：2.5μL；6：3μL；7：3.5μL；

圖5是本發(fā)明雙重RT-PCR引物的優(yōu)化結(jié)果，其中，M：DNA分子質(zhì)量標準；1：0.4μL；2：0.8μL；3：1.2μL；4：1.6μL；5：2μL；6：2.4μL；

圖6是本發(fā)明雙重RT-PCR退火溫度的優(yōu)化結(jié)果，其中，M：DNA分子質(zhì)量標準；1.：58.2℃；2：56.3℃；3：54.4℃；4：51.6℃；5：49.3℃；6：48℃；

圖7是本發(fā)明雙重RT-PCR特異性測試結(jié)果，其中，M：DNA分子質(zhì)量標準；1：PEDV、PRRSV混合模板；2：PRRSV；3：PEDV；4：TGEV；5：CSFV；6：JEV；7：RV；8：大腸桿菌；9：陰性對照；

圖8是本發(fā)明雙重RT-PCR靈敏性測試結(jié)果，其中，M：DNA分子質(zhì)量標準；1～6：模板的稀釋度分別為10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1；

圖9是本發(fā)明雙重RT-PCR重復性測試結(jié)果，其中，M：DNA分子質(zhì)量標準；1～8為同一模板的8次擴增結(jié)果。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

實施例1

豬繁殖與呼吸綜合征病毒和流行性腹瀉病毒雙重RT-PCR檢測方法的構(gòu)建

1.材料來源及處理

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬繁殖與綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome vires，PRRSV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、輪狀病毒(Rotavirus，RV)、PRRSV和PEDV混合感染病料，大腸桿菌均由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院生物技術(shù)中心保存。疑似感染PRRSV和PEDV的臨床樣品均來自四川省成都市周邊豬場。將篩選的陽性樣品組織多點取樣約1g，剪碎，液氮充分研磨，加入生理鹽水稀釋做10倍稀釋，-20℃反復凍融3次，5000r/min離心5分鐘，取上清置于DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水預處理過的EP管保存，備用。

2模板的制備及引物的合成

2.1模板的制備

RNA的抽提：TRIZOL法抽提；分別抽提TGEV、PEDV、PRRSV、CSFV、JEV、RV的總RNA，-70℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。RNA抽提使用的耗材均由DEPC水預處理。

cDNA的制備：抽取的總RNA分別經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA(體系和程序如表1)：

表1：反轉(zhuǎn)錄體系

反應程序：37℃15分鐘，85℃5秒，16℃保存。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

陽性質(zhì)粒的制備：DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入DH5α中，篩選，搖菌，質(zhì)粒提取試劑盒提取陽性質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中發(fā)布的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的ORF7序列(登錄號：KJ850329.1、EF473139.1、DQ379481.1等)、豬流行性腹瀉病毒的S基因(登錄號：KF484746.1、KF484740.1、KF484733.1等)為模板，運用引物軟件Primer Primier 5.0對這兩種病毒的模板基因進行比較分析，分別設(shè)計特異性引物，通過NCBI BLAST對引物進行預測，最終確定了2對引物(如表2)，最終能擴增出300bp(PRRSV)和578bp(PEDV)的特異性片段。引物經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2：引物

3雙重RT-PCR檢測方法的建立

3.1分別從緩沖液的選擇、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、引物和退火溫度五點進行優(yōu)化，篩選出最適合PRRSV和PEDV雙重RT-PCR的反應體系。

3.1.1緩沖液的選擇與優(yōu)化

模板、引物的濃度和量一定，控制緩沖液中Mg²⁺量，逐步篩選最適合雙重RT-PCR目的條帶擴增的緩沖液。兩組緩沖液為10×Reaction Buffer(Mg²⁺plus)和10×Reaction Buffer(Mg²⁺free)。選擇適宜的緩沖液，調(diào)整鎂離子量(0.5、1、1.5、2.0、2.5μL)。反應體系采用25μL，反應程序：95℃5min；95℃30s，52.1℃30s,72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min,4℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果篩選最優(yōu)的Mg²⁺用量。

3.1.2 Taq DNA聚合酶與dNTP Mix的優(yōu)化

在緩沖液中Mg²⁺用量優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上優(yōu)化Taq DNA聚合酶與dNTP Mix的用量。保證模板和引物一定，分別改變Taq DNA聚合酶與dNTP Mix用量，設(shè)計梯度為Taq DNA聚合酶(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μL)，dNTP Mix(1、1.5、2、2.5、3μL)，反應程序：95℃5min；95℃30s，52.4℃30s,72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min,4℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果篩選最優(yōu)的Taq DNA聚合酶與dNTP Mix的用量。

3.1.3引物與退火溫度的優(yōu)化

在最優(yōu)Mg²⁺、Taq DNA聚合酶和dNTP Mix用量的前提下，在25μL反應體積中加入兩種病毒的模板各1μL，分別改變引物量與退火溫度，以篩選最優(yōu)引物量與退火溫度。最優(yōu)退火溫度的篩選：固定引物量，設(shè)計退火溫度的梯度(48～58.2℃)；最優(yōu)引物量的篩選：將退火溫度固定為52.4℃，設(shè)計引物量梯度(0.4、0.8、1.2、1.6、2μL)。反應程序同上，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，挑選最清晰明亮的條帶所對應的引物與退火溫度。

3.2特異性測試

結(jié)合以上的優(yōu)化結(jié)果用CSFV、TGEV、JEV、RV、PEDV、PRRSV的陽性模板和大腸桿菌進行PCR擴增，同時設(shè)計一PEDV和PRRSV的混合陽性模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，以測試建立所建立的雙重RT-PCR的特異性。

3.3靈敏性測試

PEDV和PRRSV的陽性重組質(zhì)粒經(jīng)核酸蛋白儀測定濃度，分別對其進行稀釋，稀釋倍數(shù)從10倍至60倍共6個濃度梯度。在以上優(yōu)化的反應體系中加入同等稀釋梯度的PEDV和PRRSV陽性模板各1μL進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，以測定本方法的靈敏性。

3.4重復性測試

用建立的雙重RT-PCR方法對同一陽性模板重復檢測，重復次數(shù)為8次，以驗證本方法的重復性。

3.5雙重RT-PCR和單一RT-PCR的臨床應用與分析比較

用優(yōu)化后的反應體系對30份臨床可疑樣品進行PEDV和PRRSV的雙重RT-PCR檢測，記錄檢測結(jié)果與檢出率，并與二者的單一RT-PCR檢測結(jié)果、檢出率進行對比分析。

3.6雙重RT-PCR擴增片段的基因序列驗證

對雙重RT-PCR擴增的目的片段進行序列測定，測序結(jié)果通過NCBI BLAST與預測的目的條帶序列進行比較分析。

4結(jié)果與分析

4.1緩沖液的優(yōu)化

分別用兩種緩沖液進行PCR擴增，結(jié)果表明，最好的雙重RT-PCR緩沖液為含Mg²⁺的緩沖液(圖1)，且Mg²⁺最佳用量為2.5μL(圖2)。

4.2 Taq DNA聚合酶與dNTP Mix用量的優(yōu)化

如圖3和圖4所示，在25μL的反應體系中，當Taq DNA聚合酶和dNTP Mix的用量分別為0.4μL和1μL時擴增的條帶最清晰。

4.3引物與退火溫度的優(yōu)化

如圖5和圖6所示，引物(10μmol/L)用量為1.2μL，退火溫度為56.3℃時，擴增條帶最為清晰。

4.4特異性測試

用本實驗建立的雙重RT-PCR對不同陽性病料進行檢測，如圖7所示，本方法具有良好的特異性。

4.5靈敏性測試

如圖8所示，本方法建立的雙重RT-PCR對PEDV和PRRSV的最低檢出率為1.49×10⁵copies/μL，具有良好的靈敏性。

4.6重復性測試

如圖9所示，應用雙重RT-PCR方法對同一陽性模板進行檢測，8次檢測結(jié)果均一致(圖9)，表明本法有良好的重復性。

4.7優(yōu)化后的反應體系

優(yōu)化后的反轉(zhuǎn)錄反應體系(25uL)如表3所示：

表3優(yōu)化后的反轉(zhuǎn)錄反應體系(25uL)

4.8雙重RT-PCR和單一RT-PCR臨床應用分析

運用本法和單一RT-PCR分別對30份臨床樣品進行檢測，檢測結(jié)果如下表(表4)：

表4：雙重RT-PCR和單一RT-PCR對臨床病料檢測結(jié)果比較

4.8雙重RT-PCR擴增片段的基因序列驗證

擴增產(chǎn)物測序后，經(jīng)NCBI BLAST比較分析，結(jié)果顯示：PRRSV的擴增序列與參考毒株(EU880436.2)的同源性為99％，PEDV的擴增序列與參考毒株(KU664503)的同源性為99％。分析結(jié)果證實本法能成功擴增PEDV和PRRSV的目的片段，同時證明本法有良好的特異性，對臨床檢測有積極意義。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川農(nóng)業(yè)大學

<120> 用于檢測PRRSV和PEDV雙重RT-PCR的方法及引物

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tctggctttg agttgtat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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