本發(fā)明涉及一種富硒灰樹花硒多糖及其制備方法和其作為抗氧化劑和人體補硒食品的應用，屬于保健食品技術領域。

背景技術：

灰樹花(Grifola frondosa)為擔子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，多孔菌科，樹花屬，又名奇果菌、貝葉多孔菌、千佛菌、蓮花菌等，是一種珍稀的藥食兩用真菌，其子實體肉質，柄短且呈珊瑚狀，外觀形似菊，氣味清香四溢，肉質脆嫩可口?；覙浠ㄔ谖覈憬⒑颖?、福建、四川等地均有栽培，其營養(yǎng)價值極其豐富，富含大量蛋白、多糖、脂肪、粗纖維及多種有益礦物質、微生物等。研究發(fā)現(xiàn)多糖作為其主要生物活性物質，具有抗腫瘤、調節(jié)免疫、抗病毒及降血糖等活性(謝文佳，黃小玲.灰樹花多糖的生物活性與研究進展.食用菌，2010，32(5):1-3.)。中國專利于2012年4月11號公開了“一種灰樹花多糖ZZK組分及其制備方法”，從灰樹花子實體中分離得到一種β葡甘聚糖(ZZK)，具有顯著的抗腫瘤活性。中國專利于2014年4月16號公開了“灰樹花多糖F2的制備方法及其降血糖功能”，以灰樹花子實體為原料，分離獲得一種新型灰樹花多糖F2，為β吡喃糖環(huán)雜多糖且含有糖醛酸。同時，能夠通過胰島素抵抗治療2型糖尿病。樊懿娜等采用單一酶及復合酶法從灰樹花子實體中分離純化多糖，進行抗氧化活性比較，所得純化組分均不含有糖醛酸，復合酶解多糖具有較高的抗氧化活性且與其較低的分子量相關(樊懿娜.酶法修飾灰樹花多糖的分離純化、結構表征及其抗氧化活性研究[D].江蘇大學，2011)。

硒元素是人體必需的微量元素之一，具有提高機體免疫力、清除體內自由基、解毒、防止心腦血管疾病、糖尿病等多種生理活性。中國營養(yǎng)學會推薦成人日硒攝入量為60～250μg。人體硒來源主要依靠膳食的攝入，但我國2/3地區(qū)的硒攝入量低于最低推薦值，缺硒常引起人體代謝障礙，易引發(fā)疾病。硒主要分為無機硒和有機硒兩大類，無機硒吸收效果差且毒性較大，其毒性和生理活性的劑量大致相當，使用不當極易引起硒中毒，因而極大的限制了它的應用；而有機硒吸收效果好且毒性較低，有資料顯示無機硒的毒性是有機硒的2.94倍，更適合補硒的要求。所以，很多研究著眼于研制各種有機硒化合物，目前已研究出富硒酵母、螺旋藻、黑木耳、富硒茶、硒化卡拉膠等。食用菌作為富集微量元素硒的良好載體，能夠通過富集硒以提高食用菌原料的營養(yǎng)及功效價值；同時，食用菌富硒可以將無機硒轉化為毒性較低、功能更強的有機硒化合物，使得富硒食用菌原料更適合用作為保健食品的原料，但由于考慮作為保健食品原料，食用菌富硒時硒的添加應該有嚴格的劑量限制。中國專利于2011年11月16號公開了“一種富硒葛根多糖的制備方法及其應用”，通過葉面施硒的方式對葛根進行富硒獲得富硒葛根，從中提取得到富硒葛根多糖。中國專利于2012年12月12號公開了“一種灰樹花多糖硒復合物的生產方法”，誘變篩選新的灰樹花菌株，通過發(fā)酵生產灰樹花多糖硒復合物。中國專利于2015年4月22號公開了“一種富硒灰樹花栽培方法”，利用殺活酶解后的活性富硒酵母菌為硒源，獲得富硒灰樹花食用菌。中國專利于2016年5月11號公開了“標量富硒灰樹花工廠化生產技術”，利用研制的硒粉制成標量灰樹花基質專用水，生產制作灰樹花菌包，用常規(guī)工廠化技術生產標量富硒灰樹花子實體。中國專利于2016年7月13號公開了“一種生產富硒灰樹花菌絲的方法”，采用液態(tài)培養(yǎng)灰樹花誘變新菌株生產富硒灰樹花菌絲原料。本發(fā)明人采用菌面噴硒的方式對灰樹花進行富硒，得到富硒灰樹花子實體，然后提取得到一種新的富硒灰樹花硒多糖，鑒定其結構特征，并研究了富硒灰樹花硒多糖的抗氧化活性。有關該硒多糖組分及其抗氧化活性研究至今未見國內外文獻報道，也未見相應專利公開。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決上述背景技術存在的不足，提供一種富硒灰樹花硒多糖的制備方法及其作為抗氧化劑和人體補硒食品等的應用。

本發(fā)明采用如下技術方案：一種富硒灰樹花硒多糖，其硒含量為8.37μg/g；分子量為4.13×10⁶Da；單糖組成為：甘露糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為3.3:23.3:1；該硒多糖同時具有α-糖苷鍵和β-糖苷鍵；該硒多糖呈不規(guī)則纖維網狀結構，有片狀和碎屑狀聚集；在水溶液中排列緊湊，呈不對稱形貌，分子間相互纏繞，分子鏈厚度為0.5～7.4nm；富硒灰樹花硒多糖一級結構的重復單元為：

上述富硒灰樹花硒多糖的制備方法，按照下述步驟進行：

一、富硒灰樹花的栽培：

(1)配制培養(yǎng)基：原料由下述成分按重量份配比制成：

棉子殼34％，雜木屑34％，麩皮10％，玉米粉10％，山表土10％，石膏粉l％，紅糖1％，料水比1:1.1～1.2，pH值自然。

(2)裝袋；

(3)滅菌：采用常壓灶滅菌，將料溫升至95℃，并保持40h；

(4)接種：待袋溫冷卻至30℃以下時，開始接種，在無菌條件下將灰樹花菌種分成菌塊后迅速接種；

(5)發(fā)菌：接種后的菌棒置于遮光處，控制室溫20～24℃，按“#”字形堆放培養(yǎng)，注意通風換氣，使其發(fā)菌完全；

(6)刺孔：充分發(fā)菌40天后，在菌棒中央位置進行刺孔，約7天后開始澆水，控制室溫24℃，濕度80％，其間弱光照射2h；

(7)出菇培養(yǎng)：將出菇的菌棒搬至有外遮陽設施的大棚管理，控制溫度18～23℃，濕度70～80％，保持通風；

(8)富硒栽培：對已開始分化的灰樹花進行富硒培養(yǎng)，菌面噴施，均勻噴灑亞硒酸鈉(5.5mg/菌棒/天)，共10天，富硒結束后繼續(xù)噴施水至成熟采收；

(9)采收：將采收的新鮮成熟富硒灰樹花于60℃真空干燥，用超微粉碎機粉碎，過200目篩，存于干燥器中備用。

二、富硒灰樹花粗硒多糖的制備：

稱取富硒灰樹花干粉以料液比1:30(g/mL)加入蒸餾水進行水提，于100℃水提3h，提取3次，提取液合并經過減壓濃縮后，用三氯乙酸除蛋白，加入80％乙醇醇沉，離心后，上清液經截留分子量為3500Da的透析袋透析72h、真空干燥3h，制得富硒灰樹花粗硒多糖。

三、純化：

將步驟(2)得到的富硒灰樹花粗硒多糖溶解于0.05mol/L的NaCl溶液中，離心除去不溶物，然后緩慢滴加至DEAE-52層析柱中，并采用0～0.2mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線分別收取合并洗脫液，得到富硒灰樹花硒多糖不同組分，選取0.05mol/L NaCl的洗脫組分合并，經濃縮、透析后，上Sephacryl S-400葡聚糖凝膠柱，用1.5mol/L的NaCl溶液洗脫，根據(jù)洗脫曲線分別收取合并洗脫液，經濃縮、透析、真空干燥后，得到富硒灰樹花硒多糖。

進一步的，所述步驟(二)中富硒灰樹花粗硒多糖的得率為7.6％，多糖含量為68.4％。

進一步的，所述步驟(三)中，富硒灰樹花粗硒多糖在10mL NaCl溶液中經震蕩加熱溶解，震蕩頻率為150次/分、溫度為55℃的震蕩恒溫水浴中充分溶解10h，溶解液經4500r/min離心10min。

進一步的，所述步驟(三)中，DEAE-52柱分離和Sephacryl S-400柱分離組分流水透析42h、蒸餾水透析30h后，減壓濃縮，于溫度21℃、真空度為-0.09MPa的真空干燥箱內干燥3h。

進一步的，所述富硒灰樹花硒多糖能夠作為抗氧化劑和補硒食品用于功能食品和食品添加劑中。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：采用本發(fā)明的方法可以生產獲得富硒灰樹花子實體，操作簡單，成本低廉，效果較好；以富硒灰樹花子實體為原料可生產獲得一種新的富硒灰樹花硒多糖，其中的有機硒含量是普通灰樹花多糖中有機硒含量的60倍多；富硒灰樹花硒多糖的抗氧化活性顯著提高。因此本發(fā)明的富硒灰樹花硒多糖除保留普通灰樹花多糖的藥用及保健作用外，既可以作為抗氧化劑功能食品，又可以作為人體補硒食品。

附圖說明

圖1為灰樹花多糖的IR譜圖；

圖2為富硒灰樹花硒多糖的IR譜圖；

圖3為富硒灰樹花硒多糖的¹H NMR譜圖；

圖4為富硒灰樹花硒多糖的¹³C NMR譜圖；

圖5為富硒灰樹花硒多糖清除DPPH自由基的能力；

圖6為富硒灰樹花硒多糖清除ABTS自由基的能力；

圖7為富硒灰樹花硒多糖螯合Fe²⁺的能力。

具體實施方式

富硒灰樹花的栽培

實施例1：

(1)配制培養(yǎng)基：原料由下述成分按重量份配比制成：

棉子殼34％，雜木屑34％，麩皮10％，玉米粉10％，山表土10％，石膏粉l％，紅糖1％，料水比1:1.1～1.2，pH值自然。

(2)裝袋；

(3)滅菌：采用常壓灶滅菌，將料溫升至95℃，并保持40h；

(4)接種：待袋溫冷卻至30℃以下時，開始接種，在無菌條件下將灰樹花菌種分成菌塊后迅速接種；

(5)發(fā)菌：接種后的菌棒置于遮光處，控制室溫20～24℃，按“#”字形堆放培養(yǎng)，注意通風換氣，使其發(fā)菌完全；

(6)刺孔：充分發(fā)菌40天后，在菌棒中央位置進行刺孔，約7天后開始澆水，控制室溫24℃，濕度80％，其間弱光照射2h；

(7)出菇培養(yǎng)：將出菇的菌棒搬至有外遮陽設施的大棚管理，控制溫度18～23℃，濕度70～80％，保持通風；

(8)富硒栽培：對已開始分化的灰樹花進行富硒培養(yǎng)，菌面噴施，均勻噴灑亞硒酸鈉(5.5mg/菌棒/天)，共10天，富硒結束后繼續(xù)噴施水至成熟采收；

(9)采收：將采收的新鮮成熟富硒灰樹花于60℃真空干燥，用超微粉碎機粉碎，過200目篩，存于干燥器中備用。

富硒灰樹花粗硒多糖的制備

實施例2：

稱取富硒灰樹花干粉以料液比1:30(g/mL)加入蒸餾水進行水提，于100℃水提3h，提取3次，提取液合并經過減壓濃縮后，用三氯乙酸除蛋白，加入80％乙醇反復醇沉4次，離心后，上清液經截留分子量為3500Da的透析袋透析72h、真空干燥3h，制得富硒灰樹花粗硒多糖(Se-GFP)，多糖得率為7.6％，多糖含量為68.4％。

富硒灰樹花粗硒多糖的純化及結構特征

實施例3：

稱取富硒灰樹花粗硒多糖0.4g，溶于10mL0.05mol/L NaCl溶液中，于震蕩頻率為150次/分、溫度為55℃的震蕩恒溫水浴中充分溶解10h，溶解液經4500r/min離心10min。除去不溶物后，上清液通過DEAE-52離子交換柱(2.0×50cm)進行分離，0～0.2mol/L的NaCl溶液進行洗脫，用DHL-A恒流泵，控制流速1mL/min，用自動分部收集器逐管收集洗脫液，每管收集5mL。收集液用苯酚-硫酸法逐管跟蹤檢測，以蒸餾水為空白，于490nm波長處測定吸光度，直到不再有糖檢出。根據(jù)洗脫曲線分別收取合并洗脫液，其中0.05mol/L NaCl的洗脫液經減壓濃縮，截留分子量為3500Da的透析袋流水透析42h、蒸餾水透析30h后，減壓濃縮，于溫度21℃、真空度為-0.09MPa的真空干燥箱內干燥3h，上述步驟所得多糖組分上Sephacryl S-400葡聚糖凝膠柱，用1.5mol/L的NaCl溶液洗脫，控制恒流泵流速為0.3mL/min，用自動分部收集器逐管收集洗脫液，每管收集3mL。收集液用苯酚-硫酸法逐管跟蹤檢測，繪制洗脫曲線收取合并洗脫液，用截留分子量為3500Da的透析袋流水透析42h、蒸餾水透析30h后，減壓濃縮，于溫度21℃、真空度為-0.09MPa的真空干燥箱內干燥3h，得到富硒灰樹花硒多糖組分(Se-GFP-22)，氫化物原子熒光法測得富硒灰樹花多糖經濕法消解硒含量為8.37μg/g。

取實施例3制備得到富硒灰樹花硒多糖組分(Se-GFP-22)。

分子量的測定：采用高效凝膠尺寸排阻色譜-多角度激光光散射-示差折光檢測儀聯(lián)用分析法(HPSEC-MALLS-RI)對多糖相對分子質量進行測定。色譜柱為TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL串聯(lián)色譜柱(7.8mm×30cm i.d.,TOSOH，日本)，流動相為0.05mol/L NaH₂PO₄和0.15mol/L NaNO₃(pH＝7)，流速為0.5mL/min，柱溫為35℃。Se-GFP-22樣品溶液濃度為5mg/mL，經12000r/min離心10min后取上清液過0.22μm濾膜過濾后，取100μL進樣分析。多糖溶液的示差折光指數(shù)增量(dn/dc)為0.1460mL/g。Se-GFP-22分子量為4.13×10⁶Da，多分散指數(shù)(PD)為1.211。

單糖組成分析：精密稱取多糖樣品5mg于安瓿瓶中，用2mol/L的硫酸溶液溶解，封口，100℃烘箱中加熱水解8h后，水解液加碳酸鋇中和至中性，以4000r/min離心除去BaSO₄沉淀，上清液冷凍干燥。水解產物經乙?；笥脥u津GC 2010氣相色譜系統(tǒng)分析。Se-GFP-22由甘露糖、葡萄糖和半乳糖三種單糖組成，其摩爾比為3.3:23.3:1，而現(xiàn)有專利(201310733480.8)中，灰樹花多糖F2由核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖六種單糖組成；專利(201110398991.X)中，灰樹花多糖ZZK由甘露糖和葡萄糖兩種單糖組成。

紅外測定：取1mg經干燥的多糖樣品，與100～200mg經干燥的KBr粉末在瑪瑙研缽中輕輕研磨均勻在紅外燈下操作。經壓片機壓成薄片后，采用NEXUS 670智能型傅立葉紅外光譜儀掃描4000～400cm^-1波長段獲得紅外光譜圖。Se-GFP-22在667.9cm^-1處為Se-O-C對稱伸縮振動吸收峰，759.9cm^-1處為Se＝O伸縮振動吸收峰，1024.5cm^-1處為O-Se-O不對稱伸縮振動吸收峰，說明富硒修飾成功；847.3cm^-1和891.6cm^-1的特征吸收峰表明，Se-GFP-22同時具有α-糖苷鍵和β-糖苷鍵，以α-糖苷鍵為主；1024.5cm^-1、1080.9cm^-1和1154.2cm^-1的特征吸收峰表明，Se-GFP-22由吡喃環(huán)組成。

甲基化分析：取5mg經干燥的多糖樣品，置于10mL反應瓶中，注入DMSO，充入氮氣，密閉，超聲2min，使樣品充分溶解，加入100mg充分干燥的NaOH粉末，氮氣保護下，攪拌至大部分NaOH溶解。在氮氣保護，避光，冰浴的條件下，緩慢加入1mL碘甲烷，室溫避光攪拌反應2h后，加入2mL水反應終止。將反應液用氯仿萃取3次，氯仿層合并，用蒸餾水洗滌數(shù)次后，真空干燥過夜，得到甲基化樣品。取少量樣品經105℃干燥后進行紅外光譜檢測，若3200-3600cm^-1處的O-H寬峰消失，說明甲基化完全，否則重復上述過程。將完全甲基化的多糖樣品加入3mL 85％甲酸中，100℃密閉解聚6h后減壓抽干，加甲醇再抽干，重復多次。加入3mL 2.5mol/L三氟乙酸100℃密閉水解6h后，反復加甲醇蒸干，以徹底除去三氟乙酸。蒸干后加25mg硼氫化鈉，并加入3mL水充分溶解，室溫靜置避光還原過夜。加入乙酸至pH 5，至無氣泡產生，減壓蒸干，再加甲醇溶解并旋轉蒸干，重復多次，以充分除去硼氫化鈉。將樣品40℃真空干燥過夜，對水解后的甲基化多糖進行乙酰化后用安捷倫6890N/5975B GC-MS色譜系統(tǒng)分析。

從Se-GFP-22部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAAs)GC-MS分析結果可以看出，Se-GFP-22由四種糖殘基組成，其中非還原末端T-Glcp殘基的峰面積百分比為13.6％；主要的鏈內殘基為1,4-linked-Glcp，百分比為70.7％；分支糖殘基1,3,6-linked-Manp和1,4,6-linked-Galp分別占到總糖殘基的12.1％和3.7％；分支度為29.30％。

核磁分析：取多糖樣品150mg，經D₂O交換3次后，溶于0.5mL D₂O中，用Bruker Avance 600MHz型核磁共振儀測定1D和2D NMR譜。從¹H NMR中可以看出δ4.73的信號提示β-吡喃環(huán)的存在，δ5.46、5.05和5.30的信號提示α-吡喃環(huán)的存在，與紅外分析分析結果一致；從¹³C NMR中可以看出異頭碳共振區(qū)的化學位移(δ99.50、98.28、95.48和91.59)，說明Se-GFP-22由四種糖殘基組成，與甲基化分析結果一致；另外，低場區(qū)δ170～180未見碳信號，表明其不含糖醛酸，與紅外和組成分析結果一致。從¹H/¹H DQF-COSY，¹H/¹H NOESY和¹H/¹³C HSQC的特征信號可以確定各個糖殘基¹H和¹³C的化學位移；從¹H/¹³C HMBC的特征信號可以看出¹H和遠程¹³C之間的耦合關系，確定各個糖殘基間連接順序。

綜合以上單糖組成、紅外、甲基化、1D NMR和2D NMR分析結果，Se-GFP-22中各糖殘基(A,B,C和D)的摩爾比為19.3:3.7:3.3:1。Se-GFP-22的主鏈結構為1,4-α-D-Glcp，有三個1,3,6-β-D-Manp和一個1,4,6-α-D-Galp分支單元，支鏈由1,4-α-D-Glcp和末端殘基α-D-Glcp組成，推測出Se-GFP-22中一級結構的重復單元為：

剛果紅分析：取多糖樣品5mg，加入2mL蒸餾水和2mL 80μmol/L的剛果紅試劑，之后逐漸加入1mol/L的NaOH溶液，使混合液的濃度從0逐漸提高到0.5mol/L，采用紫外可見光譜儀掃描400～800nm，測定各堿性梯度下最大吸光值(參比為2mL蒸餾水和2mL 80μmol/L的剛果紅試劑，逐漸加入1mol/L的NaOH溶液，使混合液的濃度從0逐漸提高到0.5mol/L，以NaOH濃度為橫坐標，最大吸收波長為縱坐標繪圖。Se-GFP-22與剛果紅形成的絡合物沒有發(fā)生紅移現(xiàn)象，推測其為無規(guī)線團。

掃描電鏡：取一定量的多糖樣品粘附在樣品盤上，經離子濺射儀噴金后，用JSM-7001F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行觀測。Se-GFP-22為不規(guī)則纖維網狀結構，有片狀和碎屑狀聚集。

原子力顯微鏡：配制10μg/mL的多糖樣品溶液，過0.45μm纖維素膜并收集濾液，取10μL濾液使其均勻附著在干凈的云母片上，室溫下防灰干燥。采用Bruker Multimode 8型原子力顯微鏡對樣品進行觀測。多糖分子在水溶液中排列緊湊，呈不對稱形貌，分子間相互纏繞，多糖鏈厚度為0.5～7.4nm。

富硒灰樹花硒多糖的體外抗氧化活性

1、實驗材料

1.1藥品與試劑

富硒灰樹花硒多糖：配制成生藥濃度為2mg/mL的水溶液備用；

DPPH溶液：配制成0.2mmol/L的無水乙醇溶液；

ABTS+溶液：配制成0.2mmol/L的溶液；

磷酸鹽緩沖溶液：配制成0.2mmol/L pH7.40的緩沖溶液；

菲洛嗪溶液：配制成5mmol/L的溶液；

氯化亞鐵溶液：配制成2mmol/L的溶液；

1.2儀器

TU-1800紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；

BS124S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

冷凍干燥機FD-1C-50：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

旋轉蒸發(fā)儀RE-52C：鞏義市予華儀器有限責任公司。

2、實驗方法

2.1富硒灰樹花硒多糖清除DPPH自由基作用

分別取2mL不同濃度的樣品液于試管中，加入2mL 0.2mmol/L DPPH無水乙醇溶液，混合均勻，暗處反應30min分鐘后于517nm處測定其吸光度(A_S)，以蒸餾水代替樣品液測得空白吸光度(A₀)，重復三次。清除率按下式計算：

清除率(％)＝(A₀-A_S)/A₀×100％

2.2富硒灰樹花硒多糖清除ABTS自由基作用

分別取0.2mL的樣品液與3.8mL上述ABTS分析溶液混合，70min后于734nm處測定其吸光度(A_S)。以蒸餾水代替樣品液測得空白吸光度(A₀)，重復三次。清除率按下式計算：

清除率(％)＝(A₀-A_S)/A₀×100％

2.3富硒灰樹花硒多糖螯合螯合Fe²⁺的能力

分別取4.4mL不同濃度的樣品液于試管中，加入0.1mL 2mmol/L FeCl2溶液，混合均勻，再加入0.4mL 5mmol/L菲啰嗪，徹底混合，室溫下反應10min后于562nm處測定其吸光度(A_S)，以蒸餾水代替樣品液測得空白吸光度(A₀)，重復三次。清除率按下式計算：

清除率(％)＝(A₀-A_S)/A₀×100％

3、實驗結果

圖5為富硒灰樹花硒多糖對DPPH自由基的清除作用，可以看到灰樹花多糖富硒前后對DPPH自由基均有一定的清除作用，且富硒灰樹花硒多糖的清除活性優(yōu)于灰樹花多糖。在濃度為1mg/mL時，Se-GFP-22和GFP-22的清除率分別為45.71％和33.33％。圖6為富硒灰樹花硒多糖對ABTS自由基的清除作用，可以看到灰樹花多糖富硒前后對ABTS自由基均有一定的清除作用，且富硒灰樹花硒多糖的清除活性優(yōu)于灰樹花多糖。在濃度為2mg/mL時，Se-GFP-22和GFP-22的清除率分別為58％和45.34％。圖7為富硒灰樹花硒多糖螯合Fe²⁺的能力，可以看到灰樹花多糖富硒前后均有一定的螯合Fe²⁺的能力，且富硒灰樹花硒多糖的螯合能力優(yōu)于灰樹花多糖。在濃度為2mg/mL時，Se-GFP-22和GFP-22的螯合Fe²⁺能力分別為59.63％和47.63％。

4、結論

與灰樹花多糖相比，富硒灰樹花硒多糖對DPPH自由基、ABTS自由基的清除活性和螯合Fe²⁺的能力都有顯著提高。