本發(fā)明屬于基因工程應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，涉及水稻FAH基因在控制水稻育性方面的應(yīng)用，具體是通過抑制水稻FAH基因的表達(dá)創(chuàng)建水稻雄性不育材料。

背景技術(shù)：

水稻是重要的糧食作物，其生產(chǎn)對我國糧食的供給具有重要的意義。雜交水稻的推廣，使水稻產(chǎn)量得到大幅度提高，一定程度上緩解了我國人口迅速增長對糧食需求急劇增長的壓力。雜交水稻是選用遺傳上具有一定差異的優(yōu)良水稻品種為親本，采用“三系法”或“二系法”等生產(chǎn)具有雜種優(yōu)勢的雜交種。雜交種在產(chǎn)量、生長勢、生活力、繁殖力等方面都優(yōu)于雙親?！叭捣ā笔抢貌挥怠⒈３窒岛突謴?fù)系進行雜交育種，是水稻育種和推廣的一個巨大成就。其中，雄性不育系雌蕊發(fā)育正常，而雄蕊的發(fā)育退化或敗育，不能自花授粉結(jié)實；保持系雌雄蕊發(fā)育正常，將其花粉授予雄性不育系的雌蕊，不僅可結(jié)種子，而且播種后仍可獲得雄性不育植株；恢復(fù)系花粉授予不育系的雌蕊，所產(chǎn)生的種子播種后，長成的植株又恢復(fù)了育性。雄性不育性的利用是制備雜交水稻的重要環(huán)節(jié)。但是從自然界中尋找的不育系并不多。利用基因工程的方法獲得不育系是一條有效的途徑。如通過干擾某些基因的表達(dá)使花粉敗育獲得不育系(de Groot et al，2004；Chen et al，2007；Shi et al，2015)。

FAH基因編碼的延胡索酰乙酰乙酸水解酶參與酪氨酸降解途徑。在擬南芥中編碼FAH的基因突變后會造成擬南芥在短日照條件下的細(xì)胞死亡(Han et al,2013)。但是，目前尚未有關(guān)于水稻FAH基因在控制育性方面的研究報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供水稻FAH基因在水稻育性控制中的應(yīng)用，為培育水稻不育系提供新的方法。

為達(dá)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：水稻FAH基因在控制水稻育性中的應(yīng)用，該FAH基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。其中，該水稻FAH基因在育性控制方面的應(yīng)用是指干擾該基因的表達(dá)降低水稻植物的育性，即該基因的表達(dá)降低使水稻植物的育性降低。

本發(fā)明通過基因工程手段將該FAH基因與干擾表達(dá)載體連接后，轉(zhuǎn)化至其它植物如水稻中，抑制該基因在轉(zhuǎn)化后的植物體內(nèi)的表達(dá)，可以使該植物的育性降低。

本發(fā)明同時提供上述水稻FAH基因在培育水稻雄性不育植株中的應(yīng)用，該FAH基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本發(fā)明還提供一種培育水稻雄性不育植株的方法，該方法是將含權(quán)利要求1所述FAH基因的干擾表達(dá)載體導(dǎo)入水稻植株中，能抑制水稻中FAH基因的表達(dá)，使水稻育性降低，該水稻植株經(jīng)培育即得水稻雄性不育植株。

本發(fā)明克隆了水稻FAH基因，分析該基因在水稻不同組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該基因在水稻幼穗中的表達(dá)水平最高。進一步將該基因與植物干擾表達(dá)載體連接重組后，轉(zhuǎn)化至水稻日本晴中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻中該基因的表達(dá)水平降低，并且轉(zhuǎn)基因水稻的花粉活力和育性都降低。通過對水稻中該基因的表達(dá)干擾，降低其在水稻中的表達(dá)水平，可以獲得雄性不育的轉(zhuǎn)基因水稻，這些不育系能用于雜交水稻的生產(chǎn)。另外可以利用該基因抑制其它植物中其同源基因的表達(dá)，而控制其它植物的育性。

附圖說明

圖1為水稻FAH基因在水稻不同組織中的表達(dá)分析。

圖2為FAH基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定。

其中，A：FAH基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定；WT表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账荆?-4表示FAH干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻；

B：FAH基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻中FAH基因的表達(dá)分析；WT表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账荆?，3，4表示FAH干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻。

圖3是FAH基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的育性觀察。

其中，A：FAH基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株的觀察；B：FAH基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻種子的觀察；C：FAH基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻花粉活力的觀察。A、B、C中的WT表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账?，RNAi表示FAH干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻。

具體實施方式

實施例1水稻FAH基因cDNA的克隆及其序列分析

將水稻日本晴種子于37℃催芽1天后，播種于溫室中，取三葉期水稻葉片提取RNA。RNA的提取采用大連TAKARA公司的RNAiso Plus試劑進行，具體操作步驟如下：①取100mg水稻葉片，液氮研磨成粉末后，加入1ml RNAiso Plus溶液，充分混勻后，室溫放置5min，12000rpm/min離心5min，取上清液；②加入200ul氯仿于上清液中，充分混勻后，室溫靜置5min，12000rpm/min離心10min，取上清液；③加入500ul異丙醇，充分混勻后，室溫靜置10min，12000rpm/min離心15min，取沉淀；④沉淀用500ul 75％乙醇洗滌兩次；⑤去乙醇，沉淀自然干燥后，用20ul雙蒸水溶解后備用。RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用YOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒進行。具體操作如下：取1ug RNA和適量雙蒸水混勻，總體積為12ul，65℃處理5min，冰上迅速冷卻后，加入4ⅹDNase Mix 4ul，37℃處理5min。加入5ⅹRT Master Mix 4ul，37℃處理15min后，再于50℃處理5min，98℃處理5min，終止反應(yīng)。

根據(jù)Genbank中水稻日本晴FAH(序列號AK070521.1)基因的序列，設(shè)計引物FAHF(5′-ATCTGCGCCTATTTATTGCGGCCTCT-3′，見SEQ ID No.1)和FAHR(5′-GACTTCAAATAAGTTCTTATTGTAACTGGAG-3′，見SEQ ID No.2)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，采用RT-PCR法克隆水稻日本晴的FAH基因。PCR反應(yīng)體系為25ul，其中5×TransStart FastPfu Buffer 5ul、2.5mM dNTP 2.5ul、10mM引物FAHF 1ul、10mM引物FAHR 1ul、cDNA 10ng、TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.5ul，補ddH₂O至25ul；反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性20S，62℃退火20S，72℃延伸1min20S，循環(huán)35次，72℃最后延伸10min。獲得的FAH基因由華大基因公司測序，序列分析表明，克隆的FAH基因序列與Genbank中日本晴的FAH基因序列完全一致。說明克隆的基因為水稻日本晴的FAH基因。該水稻FAH基因的cDNA序列見SEQ ID No.3，其編碼區(qū)包含1290個核苷酸(見SEQ ID No.4)，編碼一個長度為430個氨基酸的蛋白質(zhì)。

實施例2 FAH基因在水稻不同組織中的表達(dá)分析

以孕穗期的水稻日本晴的根、莖、葉和幼穗為材料，分析FAH基因在水稻不同組織中的表達(dá)水平。

該孕穗期的水稻日本晴的根、莖、葉和幼穗的RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄方法同實施例1。采用熒光定量PCR法分析FAH基因在不同組織中的表達(dá)水平。根據(jù)克隆的FAH基因序列，設(shè)計熒光定量PCR引物OSFAH1(5′-CGCCAGGAAACGCTCAAC-3′，見SEQ ID No.5)和OSFAH2(5′-GTCGCTCATGGGAACAAGG-3′，見SEQ ID No.6)。以O(shè)SFAH1和OSFAH2為引物，水稻各個組織的RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系為20ul(模板400ng，OSFAH1和OSFAH2各0.8ul，美國ROCH公司的熒光定量試劑FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10ul，補雙蒸水至總體積為20ul)，以水稻OsUBQ5基因(Genbank序列號：AK061988)為內(nèi)參，OsUBQ5基因的熒光定量PCR引物為：OsUBQ51(5′-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3，見SEQ ID No.7)；OsUBQ52(5′-ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3′，見SEQ ID No.8)。采用美國伯樂公司的CFX Connect Real-Time PCR System熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15sec，60℃延伸1min，共40個循環(huán)。FAH在水稻不同組織中的表達(dá)水平見圖1，實驗結(jié)果表明，F(xiàn)AH基因在水稻幼穗中的表達(dá)水平最高，說明該基因在水稻幼穗的發(fā)育中發(fā)揮著重要的功能。

實施例3 FAH基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定

為進一步鑒定FAH基因在水稻幼穗發(fā)育中的功能，本發(fā)明構(gòu)建了FAH基因的干擾表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化水稻日本晴，觀察FAH干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的育性。具體步驟如下：

A.根據(jù)已克隆的水稻FAH基因的序列(如SEQ ID No.3所示)，采用Premier 5軟件設(shè)計特異性引物P1(CAGCTTGTTGCAAGGGT，見SEQ ID No.9)和P2(GACTTCAAATAAGTTCTTATTGTAAC，見SEQ ID No.10)，以已克隆的FAH基因為模板，采用高保真酶TransStart FastPfu DNA Polymerase(TRNAsGen)PCR擴增FAH基因序列，PCR反應(yīng)體系為25ul，其中5×TransStart FastPfu Buffer 5ul，2.5mM dNTP 2.5ul，10mM引物P1 1ul，10mM引物P2 1ul，水稻FAH基因cDNA 10ng，TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.5ul，補ddH₂O至25ul；反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性20S，54℃退火20S，72℃延伸20S，循環(huán)35次，72℃最后延伸10min。純化PCR擴增產(chǎn)物。載體ptENTRA經(jīng)XcmI(大連寶生物)酶切，酶切體系為20μl，其中10x buffer M 2ul、ptENTRA 0.5μg、XcmI 1ul(1U/1ul)，補ddH₂O至20ul，37℃酶切過夜。酶切產(chǎn)物純化后，采用T4 DNA Ligase(Fermentas)連接擴增的水稻FAH基因和載體ptENTRA。FAH基因與ptENTRA載體按照3:1的分子比例混合，連接體系20ul，其中10xT4 DNA Ligase Buffer 2ul、T4 DNA Ligase 1ul，補ddH₂O至20ul，16℃連接過夜。采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含Kan 50ug/ml的LB的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，通過菌落PCR和測序進一步驗證轉(zhuǎn)化子，從而獲得FAH基因與載體ptENTRA重組的載體。將該載體用Invitrogen(上海)公司的LR CLONASE ENZYME MIX同源重組酶和植物干擾表達(dá)載體pANDA進行同源重組。反應(yīng)體系為：含F(xiàn)AH基因的ptENTRA載體150ng、干擾表達(dá)載體pANDA150ng，加入TE緩沖液至總體積為8ul，加入2ul LR CLONASE ENZYME MIX后，25℃處理過夜。再加入1ul蛋白酶K于反應(yīng)體系中，37℃處理10min，終止反應(yīng)。取該反應(yīng)產(chǎn)物1ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含Kan 50ug/ml和潮霉素50ug/ml的LB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，F(xiàn)AH基因干擾表達(dá)載體經(jīng)酶切和測序進行進一步鑒定。

B.將構(gòu)建好的FAH基因干擾表達(dá)載體采用電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，在含50ug/ml Kan、50ug/ml慶大霉素、20ug/ml利福平和50ug/ml潮霉素的YEB培養(yǎng)基上篩選耐性轉(zhuǎn)化子。

C.FAH干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻日本晴：將含F(xiàn)AH基因干擾表達(dá)載體的農(nóng)桿菌送武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司進行水稻的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化的水稻品種為日本晴。

D.FAH基因干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定：

取轉(zhuǎn)基因水稻幼葉，采用CTAB法提取DNA。具體操作如下：取100mg水稻葉片，液氮研磨成粉末后，加入600ul 2％CTAB溶液(由100mmol/l pH 8.0 Tris-HCl、20mmol/l EDTA、1.4mol/l NaCl及2％CTAB組成)，充分混勻后，65℃水浴30min；待材料冷卻至室溫后，加入600ul氯仿，充分混勻后，10000rpm/min離心10min；取上清液加入600ul預(yù)冷的異丙醇，混勻后，10000rpm/min離心10min，取沉淀。沉淀用600ul 75％的乙醇洗滌2次，去乙醇，自然干燥備用。用30ul雙蒸水溶解提取的DNA，加入1ul RNA酶，37℃處理30min，處理的DNA溶液用于后續(xù)的PCR實驗。

根據(jù)干擾表達(dá)載體pANDA的序列以及FAH基因的序列，設(shè)計引物GUSlinker(CCGAATACGGCGTGGAT，見SEQ ID No.11)和P2(GACTTCAAATAAGTTCTTATTGTAAC，見SEQ ID No.10)。以GUSlinker和P2為引物，前述的DNA溶液為模板，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株。PCR反應(yīng)體系為25ul，其中5×TransStart FastPfu Buffer 5ul、2.5mM dNTP 2.5ul、10mM引物GUSlinker 1ul、10mM引物P2 1ul、轉(zhuǎn)基因水稻DNA 10ng、TransStart FastPfu DNA Polymerase 0.5ul，補ddH₂O至25ul。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2min，95℃變性20S，54℃退火20S，72℃延伸1min，循環(huán)35次，72℃最后延伸10min。PCR結(jié)果見圖2A。圖2A顯示，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧现形磾U增到任何帶，而轉(zhuǎn)FAH基因干擾表達(dá)載體的水稻植株中擴增出預(yù)期大小的目的帶，表明FAH基因的干擾載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入水稻中。同時提取轉(zhuǎn)基因材料葉片中的RNA，采用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因水稻中FAH基因的表達(dá)水平。RNA提取及其反轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR的操作同實施例1。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)FAH基因干擾表達(dá)載體的水稻中FAH基因的表達(dá)低于非轉(zhuǎn)基因材料中FAH的表達(dá)水平，說明FAH干擾表達(dá)載體的導(dǎo)入干擾了日本晴中FAH基因的表達(dá)，使該基因的表達(dá)水平降低，見圖2B。

實施例4 FAH干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的育性觀察

水稻花粉活力實驗采用碘-碘化鉀染色法。具體操作如下，取同時期的轉(zhuǎn)基因水稻材料及其對照的成熟花藥置于載玻片上，用鑷子將其搗碎，使花粉粒釋放出來，再加入1滴1％的碘-碘化鉀溶液進行染色，染色后置于顯微鏡下觀察。染成藍(lán)色的花粉粒是具有活力的花粉粒，染成黃褐色的花粉粒為發(fā)育不良活性低的花粉粒。觀察轉(zhuǎn)基因材料及其對照的花粉活力以及育性，結(jié)果見圖3，顯示，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账咀蚜ｏ枬M，而轉(zhuǎn)FAH基因干擾表達(dá)載體的水稻籽粒為秕谷(圖3B)。進一步鑒定轉(zhuǎn)基因水稻植株的花粉粒的活力，發(fā)現(xiàn)其花粉粒被染成黃褐色，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账镜幕ǚ哿３贁?shù)幾個外，其余的被染成藍(lán)色(圖3C)。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因水稻材料的花粉活力和育性都下降，而花粉無活力則造成轉(zhuǎn)基因水稻材料的不育。因此，通過干擾水稻中FAH的表達(dá)，可以影響水稻花粉的活力，從而獲得水稻雄性不育植株。

綜上所述，經(jīng)過這些實驗，發(fā)明人證明了水稻FAH基因在植物育性方面有著重要的功能。通過將該基因與植物干擾表達(dá)載體連接后，轉(zhuǎn)化植物，干擾轉(zhuǎn)化植物內(nèi)FAH同源基因的表達(dá)，能獲得育性降低的植物，為培育植物不育系奠定了理論和生產(chǎn)實踐基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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2.Chen RZ,Zhao X,Shao Z,Wei Z,Wang YY,Zhu LL,Zhao J,Sun MX,RF He,GC He(2007)Rice UDP-Glucose pyrophosphorylase1is essential for pollen callose deposition and its cosuppression results in a new type of thermosensitive genic male sterility.Plant Cell 19:847-861。

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SEQUENCE LISTING

<110> 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 水稻FAH基因在水稻育性控制中的應(yīng)用

<130> 011

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成

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gacttcaaat aagttcttat tgtaactgga g 31

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<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

atctgcgcct atttattgcg gcctcttctt cctcctctcc tcgcctcgcc tcgctcttcc 60

actgttcatc tgcgccacga cacgacacga cacgacacga gacgagagag gagtcggcaa 120

tggcggaggg gtcgcggtcg ccgctgaggt cgttcgtgga ggtggcgccg gggtcgcact 180

tccccatcca gaacctcccc ttcggggtct tccgccgcag gggctcgccg gagccggagc 240

cgccgcgccc ggccgtcgcc atcggggact tcgcgctcga cctcgccgcc gtctccgacg 300

cgggcctctt ccacgggccc ctcctctccg cctccccctg cttccgccag gaaacgctca 360

acatgttcct ggggatgggg cgtccggcct ggaaggaggc gcgcgccacg ctgcagaaga 420

tcctctcagc tgatgagccg gttttgcgtg acaacgaggc cttgaagaag aagtgccttg 480

ttcccatgag cgacacagag atgcttctgc caatcacggt aggagactac accgacttct 540

tttgttctgt gcaccatgca aggaattgtg ggttcatctt ccgtgggcca cagaccccag 600

tcaacccaaa ttggtttcag cttccagtag gttatcatgg tcgtgcatcc tctgtgattg 660

tatctggaac agacatcatt cgacccaaag ggcaaggcca tccaacagga gattctcgac 720

cttattttgg tccttctaag aagcttgatt ttgaacttga gatggcagcc attgttggac 780

cagggaatga attgggaaaa cctatcgata ttaatgatgc tgaagaacat atctttggcc 840

taatgataat gaatgattgg agtgccagag atatccaagc ttgggaaact atacctcttg 900

gacctttcct tgggaaaagt ttcagtacca cagtatcacc ctggatcgtt actatggatg 960

ccctaaagcc tttcacctgt gaagctccta agcaggaacc tgaacctttg ccttacttag 1020

ctgaaaagaa ccacgtaaac tacgatattc ctcttgaggt ctggattaag cccaaggagc 1080

aaagtgaacc atcaatggtt gcaaagagta acttcaagca tctgtattgg actttaacac 1140

agcaactagc acaccacact gttaatggat gcaatctgag accaggggat atgtttgcaa 1200

ctggcacact aagcggacct gagacagaat ctttgggatg tttgctggag ctaacatgga 1260

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cagcaactag cacaccacac tgttaatgga tgcaatctga gaccagggga tatgtttgca 1080

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cagcttgttg caagggt 17

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成

<400> 10

gacttcaaat aagttcttat tgtaac 26

<210> 11

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ccgaatacgg cgtggat 17