本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，具體是涉及一種檢測MAPT基因突變的探針和試劑盒及其方法。

背景技術(shù)：

進行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy，PSP)又稱Steele-Richardson-Olszewski綜合征，是一種臨床少見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。PSP是繼帕金森病(PD)之后最常見的退行性帕金森綜合征，其發(fā)病率約占PD的6％～10％。1904年由Posey首先發(fā)現(xiàn)并描述其臨床表現(xiàn)，1964年Steele等(Steele JC,Richardson JC,et al.Progressive supranuclear palsy:a heterogeneous degeneration involving the brainstem,basal ganglia and cerebellum with vertical supranuclear gaze and pseudobulbar palsy,nuchal dystonia and dementia.Arch Neurol,1964,10:333-359.)將此病列為獨立的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。PSP主要臨床特征為早期出現(xiàn)姿勢不穩(wěn)、垂直性核上性麻痹、假性球麻痹、核上性眼球運動障礙、頸部肌張力障礙、構(gòu)音障礙、假性延髓麻痹、輕度癡呆和帕金森綜合征類似癥狀等。

PSP的發(fā)病年齡在55～70歲之間，少數(shù)可早至45歲發(fā)病，平均初診年齡66.4±7歲。PSP的發(fā)病率有隨年齡增長而增高的趨勢，50～59歲為1.7/10萬，80-99歲為14.7/10萬，各年齡組中男性多于女性，男女之比約為5：3。有關(guān)PSP的流行病學的研究報道較少，Schrag等對英國倫敦約12萬人的流行病學調(diào)查顯示，PSP的患病率約為6.4/10萬，年發(fā)病率(1.14～1.21)/10萬；自出現(xiàn)癥狀后可生存1.2～16.6年，平均5.3年?；颊叨嗨烙诜窝椎炔l(fā)癥(Schrag A,Ben-Shlomo Y,et al.Prevalance of progerssive supranuclear palsy and multiple system atrophy:a cross-sectional study.Lancet,1999,354:1771-1775.)。

目前認為PSP是一種Tau蛋白病(tauopathy)，病理上可見丘腦底核、腦干以及小腦上腳萎縮、黒質(zhì)脫色等表現(xiàn)，鏡下可見在基底節(jié)、間腦和腦干有Tau蛋白病理性聚集形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)、線型神經(jīng)纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)、叢狀星形細胞以及少突膠質(zhì)細胞螺旋小體等結(jié)構(gòu)(Dickson DW,Rademakers R,et al.Progressive supranuclear palsy:pathology and genetics.Brain Pathol,2007；17(1):74-82.)。確診PSP需要依靠上述組織病理學檢查結(jié)果，而臨床診斷主要依靠其臨床表現(xiàn)。目前，在PSP發(fā)病后期可以通過CT、MRI和PET檢測等功能影像學方法輔助診斷，但沒有在早期較好地客觀輔助醫(yī)生進行確診的技術(shù)方法。PSP與原發(fā)性PD及其他非典型帕金森綜合征，如多系統(tǒng)萎縮(MSA)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(CBD)、路易體癡呆(DLB)等都具有相似的癥狀，且早期臨床癥狀不典型，鑒別診斷非常困難，極易造成誤診和漏診(Armstrong RA.Visual signs and symptoms of progressive supranuclear palsy.Clin Exp Optom,2011；94(2):150-160.)，PSP患者從癥狀首發(fā)到獲得正確診斷的平均時間是3.6～4.9年(Barsottini OG,Felício AC,et al.Progressive supranuclear palsy:new concepts.Arq Neuropsiquiatr,2010；68(6):938-946.)。此外，近年來發(fā)現(xiàn)PSP具有明顯的臨床異質(zhì)性(clinical heterogeneity)，許多尸檢病理證實的PSP患者生前并不具備上述典型臨床表現(xiàn)，各種臨床變異型相繼得到確認，這不僅推動了PSP疾病分類學的研究，同時也使得PSP的臨床診斷變得愈加復(fù)雜，面臨更大的挑戰(zhàn)。

Tau蛋白屬于微管相關(guān)蛋白家族成員，主要分布在神經(jīng)元軸突中，具有促進微管組裝和穩(wěn)定微管的生理功能。Tau蛋白是由位于人的17q21染色體上的MAPT基因編碼，正常成人腦內(nèi)存在6種Tau蛋白的異構(gòu)體。在病理狀態(tài)下，過度磷酸化的Tau蛋白聚集形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡。PSP疾病的一個重要的病理特征是神經(jīng)細胞內(nèi)有Tau蛋白異常聚集形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，而MAPT基因突變是引發(fā)神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要因素之一(Longoni G,Agosta F,et al.MRI measurements of brainstem structures in patients with Richardson's syndrome,progressive supranuclear palsy-parkinsonism,and Parkinson's disease.Mov Disord,2010Dec 15.[Epub ahead of print]PubMed PMID:21162106.)。目前許多研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在編碼Tau蛋白的MAPT基因上的一些突變，包括R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V，都與PSP的發(fā)病密切相關(guān)。

由于MAPT基因突變是PSP發(fā)病因素之一，且PSP具有發(fā)病隱匿和明顯的異質(zhì)性等特點，早期利用基因診斷進行快速檢測非常重要。它可直接檢測被檢者的MAPT基因結(jié)構(gòu)或功能是否異常，相對于常規(guī)診斷，更注重個體基因狀態(tài)，不僅可以對患者做出進一步診斷，也可以對表型正常但攜帶MAPT基因某種突變或者對疾病的易感性做出判斷，為PSP的快速診斷和早期篩查提供技術(shù)支撐。目前應(yīng)用于PSP風險基因突變檢測的技術(shù)主要是聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法。該方法是根據(jù)MAPT基因突變后堿基的不同選擇一種限制性內(nèi)切酶，該種內(nèi)切酶只對其中的一種多態(tài)性具有切割的作用，而對另一種多態(tài)性不會產(chǎn)生切割。這種方法首先通過引物對MAPT基因的突變位點進行PCR反應(yīng)，然后對PCR產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)，再把酶切產(chǎn)物進行電泳分析，根據(jù)所得到的片斷大小來對MAPT基因多態(tài)性位點進行分析。但該方法存在許多不足：首先，該方法依靠限制性內(nèi)切酶的活性，在酶切過程中容易產(chǎn)生假陽性和假陰性的結(jié)果；其次，電泳的方法容易造成PCR產(chǎn)物污染，導(dǎo)致結(jié)果的誤判；再次，該方法費時(約5～6h)，耗工，至少包括PCR擴增、酶切、電泳、凝膠成像分析四個步驟，需要大量人工操作，自動化程度低，人為誤差大。

實時熒光PCR具有快速、準確、無污染的特點，已成為分子診斷實驗室的常規(guī)儀器平臺。目前，尚未見到利用實時熒光PCR的方法來對MAPT基因R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V突變進行研究的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供快速、靈敏、特異的一種檢測MAPT基因突變的探針。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種檢測MAPT基因突變的試劑盒。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種檢測MAPT基因突變的方法。

所述檢測MAPT基因突變的探針包括但不限于TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、分子信標、改良分子信標、雙鏈熒光置換探針、LightCycler探針、雙環(huán)探針等中的至少一種。

所述熒光探針的5’端標記熒光基團，3’端標記相應(yīng)的淬滅基團。用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5L突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白A152T突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白L284R突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白S285R突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白N296del突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白G303V突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；探針序列可由其堿基互補序列替換。

所述檢測MAPT基因突變的試劑盒包括擴增引物、熒光探針、擴增試劑和參照試劑；

所述擴增引物包括特異性擴增MAPT基因編碼蛋白R5位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；特異性擴增MAPT基因編碼蛋白A152位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；特異性擴增MAPT基因編碼蛋白L284、S285、N296和G303位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；引物序列可由其堿基互補序列替換。

所述試劑盒采用兩種不同熒光基團標記的核酸探針在一個反應(yīng)管內(nèi)可以同時指示兩個目標片段的存在情況。常用的熒光基團包括但不限于現(xiàn)有的各種熒光標記物，如ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5、CY5.5等。常用的淬滅基團包括但不限于現(xiàn)有的各種淬滅劑，如DABCYL、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPE等。

所述熒光探針的5’端標記熒光基團，3’端標記相應(yīng)的淬滅基團。用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5L突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白A152T突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白L284R突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白S285R突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白N296del突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；用于檢測MAPT基因編碼蛋白G303V突變的探針，其堿基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；探針序列可由其堿基互補序列替換。

所述熒光探針包括但不限于TaqMan探針、TaqMan-MGB探針、分子信標、改良分子信標、雙鏈熒光置換探針、LightCycler探針、雙環(huán)探針等中的至少一種。

所述擴增試劑包括：PCR反應(yīng)緩沖液；MgCl₂；熱啟動Taq酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP。所述MgCl₂的濃度可為1～5mmol/L；所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的濃度均可為50～400μmol/L；所述熱啟動Taq酶的單位可為1～3U/反應(yīng)。

所述參照試劑包括陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為分別包含MAPT基因編碼蛋白的R5、A152、L284、S285、N296和G303位點的陽性標準品1(正常DNA片段)、陽性標準品2(突變DNA片段)和陽性標準品3(由陽性標準品1和陽性標準品2等量混合)；所述陰性對照可自選ddH₂O、Nuclease-free Water、Tris-HCl緩沖液等中的一種。

所述檢測MAPT基因突變的方法，包括以下步驟：

1)樣本的選擇

MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型為WT/WT的樣本，基因型為R5L/R5L的樣本，基因型為WT/R5L的樣本，所有的樣本均已通過DNA測序的方法進行驗證；

2)基因組DNA的提取

用常規(guī)分子生物學方法或市售試劑盒從抗凝全血中提取人基因組DNA；

3)實時熒光PCR擴增與檢測

實時熒光PCR反應(yīng)體系包括1×PCR buffer，1.5mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP，0.5μmol/L的上、下游引物，0.5μmol/L各熒光探針，1U熱啟動Taq酶，25ng人基因組DNA；

實時熒光PCR反應(yīng)在Roche LightCycler 480Ⅱ儀器上進行，按以下條件進行擴增檢測：

第一階段：95℃2min；

第二階段：95℃20sec，64℃20sec(熒光采集)，72℃30sec，38個循環(huán)；

兩個熒光檢測頻道分別為FAM和HEX；

4)結(jié)果分析

MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為R5L/R5L突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/R5L雜合子。

與現(xiàn)有檢測方法及相關(guān)技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點：

(1)應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)結(jié)合熒光探針，可以實時觀察實驗結(jié)果。同時檢測更加靈敏、快速，操作更加簡便，易于自動化，大大減少了交叉污染的幾率，提高了檢測的準確性。

(2)在一個反應(yīng)管中就可以對MAPT基因的一個或多個突變位點進行基因分型，節(jié)省成本的同時又提高了通量。

附圖說明

圖1為利用本發(fā)明對已知MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結(jié)果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為R5L/R5L陽性標準品2，(C)為WT/R5L陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖2為利用本發(fā)明對已知MAPT基因編碼蛋白A152位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結(jié)果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為A152T/A152T陽性標準品2，(C)為WT/A152T陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖3為利用本發(fā)明對已知MAPT基因編碼蛋白L284位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結(jié)果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為L284R/L284R陽性標準品2，(C)為WT/L284R陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖4為利用本發(fā)明對已知MAPT基因編碼蛋白S285位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結(jié)果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為S285R/S285R陽性標準品2，(C)為WT/S285R陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖5為利用本發(fā)明對已知MAPT基因編碼蛋白N296位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結(jié)果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為N296del/N296del陽性標準品2，(C)為WT/N296del陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

圖6為利用本發(fā)明對已知MAPT基因編碼蛋白G303位點基因型的對照樣本和一未知的人基因組樣本進行PCR擴增分析的熒光結(jié)果圖。其中(A)為WT/WT陽性標準品1，(B)為G303V/G303V陽性標準品2，(C)為WT/G303V陽性標準品3，(D)為純水樣本作為陰性對照，(E)為未知的人基因組樣本。

具體實施方式

以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明，本發(fā)明并不限于這些實施例中提到的材料、反應(yīng)條件或參數(shù)，任何在相關(guān)領(lǐng)域具備經(jīng)驗的技術(shù)人員，都可以按照本發(fā)明的原理，利用其它類似材料或反應(yīng)條件實現(xiàn)本發(fā)明所描述的MAPT基因突變的檢測。

實施例1實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白R5L突變位點的基因型

一.材料

1.儀器：

實時熒光PCR儀、移液器、離心機。

2.引物、探針設(shè)計：

本發(fā)明設(shè)計了可以特異擴增包含MAPT基因編碼蛋白R5位點的引物，以及特異識別MAPT基因編碼蛋白R5位點野生型和突變型的探針。野生型探針5’端標記為FAM，3’端標記為BHQ1；野生型探針5’端標記為HEX，3’端標記為BHQ1。

用到的引物和探針信息如表1所示。

表1引物與探針信息列表

3.試劑：

1×PCR buffer：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/L KCl；MgCl₂；熱啟動Taq酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP。

二.方法

1.樣本的選擇

MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型為WT/WT的樣本，基因型為R5L/R5L的樣本，基因型為WT/R5L的樣本。所有的樣本均已通過DNA測序的方法進行驗證。

2.基因組DNA的提取

用常規(guī)分子生物學方法或市售試劑盒從抗凝全血中提取人基因組DNA。

3.實時熒光PCR擴增與檢測

實時熒光PCR反應(yīng)體系包括1×PCR buffer，1.5mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP，0.5μmol/L的上、下游引物，0.5μmol/L各熒光探針，1U熱啟動Taq酶，25ng人基因組DNA。

實時熒光PCR反應(yīng)在Roche LightCycler 480Ⅱ儀器上進行，按以下條件進行擴增檢測：

第一階段：95℃2min；

第二階段：95℃20sec，64℃20sec(熒光采集)，72℃30sec，38個循環(huán)；

兩個熒光檢測頻道分別為FAM和HEX。

4.結(jié)果分析

MAPT基因編碼蛋白R5位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為R5L/R5L突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/R5L雜合子。

從圖1可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為R5L/R5L突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產(chǎn)生，為WT/R5L雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，F(xiàn)AM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產(chǎn)生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結(jié)果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有R5L突變。

實施例2實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白A152T突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結(jié)果分析：

MAPT基因編碼蛋白A152位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為A152T/A152T突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/A152T雜合子。

從圖2可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為A152T/A152T突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產(chǎn)生，為WT/A152T雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，F(xiàn)AM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產(chǎn)生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結(jié)果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有A152T突變。

實施例3實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白L284R突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結(jié)果分析：

MAPT基因編碼蛋白L284位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為L284R/L284R突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/L284R雜合子。

從圖3可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為L284R/L284R突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產(chǎn)生，為WT/L284R雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，F(xiàn)AM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產(chǎn)生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結(jié)果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有L284R突變。

實施例4實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白S285R突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結(jié)果分析：

MAPT基因編碼蛋白S285位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為S285R/S285R突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/S285R雜合子。

從圖4可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為S285R/S285R突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產(chǎn)生，為WT/S285R雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，F(xiàn)AM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產(chǎn)生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結(jié)果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有S285R突變。

實施例5實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白N296del突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結(jié)果分析：

MAPT基因編碼蛋白N296位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為N296del/N296del突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/N296del雜合子。

從圖5可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為N296del/N296del突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產(chǎn)生，為WT/N296del雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，F(xiàn)AM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產(chǎn)生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結(jié)果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有N296del突變。

實施例6實時熒光PCR檢測MAPT基因編碼蛋白G303V突變位點的基因型

按照實施例1的方法和步驟，進行實時熒光PCR擴增。

用到的引物和探針信息如表1所示。

結(jié)果分析：

MAPT基因編碼蛋白G303位點基因型判定：只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為G303V/G303V突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/G303V雜合子。

從圖6可以看出，(A)為已知MAPT基因型的陽性標準品1，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為WT/WT純合子，與實際情況相符；(B)為已知MAPT基因型的陽性標準品2，只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生，為G303V/G303V突變純合子，與實際情況相符；(C)為已知MAPT基因型的陽性標準品3，在FAM和HEX頻道中均有擴增信號產(chǎn)生，為WT/G303V雜合子，與實際情況相符；(D)為純水作為陰性對照，F(xiàn)AM和HEX頻道均沒有擴增信號信號產(chǎn)生；(E)為未知人基因組樣本，可以看出與(A)結(jié)果相同，只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生，即為WT/WT純合子，可以判斷該未知樣本的MAPT基因沒有G303V突變。

以下給出具體實施例。

用于檢測MAPT基因突變的試劑盒，包括擴增引物和熒光探針，所述擴增引物包括用于擴增MAPT基因編碼蛋白的R5、A152、L284、S285、N296和G303位點的引物，所述熒光探針包括用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5、A152、L284、S285、N296和G303的野生型和突變型探針；

所述試劑盒還包括：

特異性擴增MAPT基因編碼蛋白R5位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

特異性擴增MAPT基因編碼蛋白A152位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

特異性擴增MAPT基因編碼蛋白L284、S285、N296和G303位點的引物，其堿基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白A152位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白L284位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白S285位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白N296位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示；

用于檢測MAPT基因編碼蛋白G303位點的野生型和突變型探針，其堿基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；

上述所有序列可由其堿基互補序列替換。

所述探針采用至少兩種不同熒光基團標記，在一個反應(yīng)管內(nèi)同時指示至少兩個目標片段的存在情況，所述多種不同熒光基團包括任意發(fā)射波長不同的熒光基團的組合。

所述SEQ ID NO:7、9、11、14、16堿基序列的5’和3’兩端分別偶聯(lián)上FAM熒光基團和BHQ1淬滅基團；所述SEQ ID NO:8、10、12、13、15、17堿基序列的5’和3’兩端分別偶聯(lián)上HEX熒光基團和BHQ1淬滅基團。

所述試劑盒還包括實時熒光PCR反應(yīng)所需試劑：PCR反應(yīng)緩沖液；MgCl₂；熱啟動Taq酶；dATP、dCTP、dGTP、dTTP。

所述MgCl₂的濃度可為1～5mmol/L；所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的濃度均可為50～400μmol/L。

檢測時，每個反應(yīng)管內(nèi)包括用于檢測R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V突變中至少一種突變的探針，以及相應(yīng)的擴增引物；對待檢測的DNA樣品進行PCR擴增檢測，根據(jù)熒光信號進行結(jié)果判斷。

所述PCR擴增反應(yīng)程序為：95℃2min；95℃20sec，64℃20sec，72℃30sec，38個循環(huán)。

結(jié)果判斷為：只在FAM頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/WT純合子；只在HEX頻道中有擴增信號產(chǎn)生的樣本為Mut/Mut突變純合子；在FAM和HEX頻道中都有擴增信號產(chǎn)生的樣本為WT/Mut雜合子。

所述試劑盒中的熒光探針可用于檢測MAPT基因編碼蛋白R5L、A152T、L284R、S285R、N296del和G303V突變。

序 列 表

<110>廈門大學

<120>一種檢測MAPT基因突變的探針和試劑盒及其方法

<160> 17

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

atctgcctgccatgaactgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

gtcccagcgtgatcttccat 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

gactcttggtggcagtaactt 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

agcttcagcttcctctaagattc 23

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

tggcgtgtcactcatcct 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

cagtgtctcgcaagtgtacg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

tgagccccgccaggagttc 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

tggctgagcccctccagga 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

aacgaagatcgccacaccgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

acgaagatcaccacaccgcg 20

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400>11

agctggatcttagcaacgtccagt 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

aagctggatcgtagcaacgtcc 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

ctggatcttagaaacgtccagtcc 24

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 14

tggctcaaaggataatatcaaacacgtcc 29

<210>15

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 15

tggctcaaaggatatcaaacacgtcc 26

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列

<400>1 6

ccgggaggcggcagtg 16

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 17

ccgggagtcggcagtgtg 18