本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及苯并咪唑類化合物及其應(yīng)用，具體涉及一種作為Pin1(肽脯氨酰順反異構(gòu)酶)抑制劑的苯并咪唑類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物，及其制備方法，以及含有這些化合物的藥物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：

腫瘤的發(fā)生往往伴有細(xì)胞調(diào)節(jié)因子的異常，一些重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子如CyclinD、CyclinE、β-catenin、p53等因子都是Pin1(肽脯氨酰順反異構(gòu)酶)的作用底物，因此腫瘤的發(fā)生和Pin1密切相關(guān)。

大量臨床研究數(shù)據(jù)表明，Pin1在大多數(shù)人類腫瘤中過(guò)量表達(dá)，如前列腺癌、卵巢癌、肺癌、宮頸癌及黑色素瘤等。另外Pin1的表達(dá)亦與腫瘤患者的恢復(fù)及預(yù)后相關(guān)。可見Pin1的水平在腫瘤中是一個(gè)特異而廣泛的指標(biāo)。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多步驟多階段的復(fù)雜過(guò)程，Pin1過(guò)表達(dá)所導(dǎo)致的致癌性可能是繼發(fā)于一些原癌信號(hào)的激活，相應(yīng)信號(hào)的激活接著導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)特定蛋白的磷酸化，而這些磷酸化的蛋白又是Pin1的底物。最終，Pin1將這些致癌信號(hào)整合并放大，并且協(xié)同這些激活的致癌途徑導(dǎo)致細(xì)胞的惡性增殖與轉(zhuǎn)化，從以上研究可以看出，Pin1實(shí)際上是致癌信號(hào)通路的催化劑。大量分子生物學(xué)及Pin1抑制劑研究表明，抑制Pin1可以同時(shí)抑制多條致癌信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，因而Pin1有望成為新的腫瘤診斷和治療的理想靶標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的是提供新型作為Pin1小分子抑制劑的苯并咪唑類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物。

本發(fā)明提供了通式Ⅰ所示的衍生物、及其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物：

其中，R₁獨(dú)立選自取代苯胺基、取代芐胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或嗎啉基；取代基為單取代或多取代的H、鹵素、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、鹵代(C₁-C₄)烷基、二氧亞甲基、硝基、鹵代(C₁-C₄)烷氧基、對(duì)硝基苯氧基；

R₂獨(dú)立選自H或(C₁-C₅)烷基；

n為1-4之間的整數(shù)。

本發(fā)明優(yōu)選通式Ⅰ所示的化合物、及其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物：

其中，R₁獨(dú)立選自取代苯胺基、取代芐胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或嗎啉基；取代基為單取代或多取代的H、鹵素、三氟甲基、三氟甲氧基、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、硝基；

R₂獨(dú)立選自H或(C₁-C₅)烷基；

n為1-4之間的整數(shù)。

本發(fā)明優(yōu)選通式Ⅰ所示的化合物、及其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物：

其中，R₁獨(dú)立選自取代苯胺基、取代芐胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或嗎啉基；取代基為單取代或多取代的H、鹵素、三氟甲基、三氟甲氧基、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、硝基；

R₂獨(dú)立選自H；

n為1-4之間的整數(shù)。

本發(fā)明優(yōu)選通式Ⅰ所示的化合物、及其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物：

其中，R₁獨(dú)立選自取代苯胺基、取代芐胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或嗎啉基；取代基為單取代或多取代的H、鹵素、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、鹵代(C₁-C₄)烷基、二氧亞甲基、硝基、鹵代(C₁-C₄)烷氧基；

R₂獨(dú)立選自甲基；

n為1-4之間的整數(shù)

本發(fā)明優(yōu)選通式Ⅰ所示的化合物、及其藥學(xué)上可接受的鹽或水合物：

其中，R₁獨(dú)立選自取代苯胺基、取代芐胺基、取代苯乙胺基、哌啶基或嗎啉基；取代基為單取代或多取代的H、鹵素、(C₁-C₄)烷基、(C₁-C₄)烷氧基、鹵代(C₁-C₄)烷基、二氧亞甲基、硝基、鹵代(C₁-C₄)烷氧基；

R₂獨(dú)立選自H或(C₁-C₅)烷基；

n為2。

本發(fā)明還包括所述的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽、其易水解的酯或其異構(gòu)體的藥物組合物。

除非另外指出，本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“鹵素”是指氟、氯、溴或碘，優(yōu)選氯、溴；“烷基”是指直鏈或支鏈的烷基。

通過(guò)體外抑酶實(shí)驗(yàn)篩選，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物可抑制Pin1活力，因此，本發(fā)明化合物可用于與Pin1異常表達(dá)相關(guān)的疾病中的應(yīng)用，如各種癌癥。

通過(guò)體外活性篩選研究，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性，因此本發(fā)明可以用于制備治療和/或預(yù)防各種癌癥的藥物，如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮癌、胰腺癌或卵巢癌。

本發(fā)明活性化合物可作為唯一的抗癌藥物使用，或者與一種或多種其它抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。聯(lián)合治療通過(guò)將各個(gè)組分同時(shí)、順序或隔開給藥來(lái)實(shí)現(xiàn)。下文中提供的實(shí)施例和制備例進(jìn)一步闡明和舉例說(shuō)明本發(fā)明化合物及其制備方法。應(yīng)當(dāng)理解，下述實(shí)施例和制備例的范圍并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

下面的合成路線描述了本發(fā)明的式Ⅰ化合物的制備，所有的原料都是通過(guò)這條路線中描述的方法、通過(guò)有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法制備的或者可商購(gòu)。本發(fā)明的全部最終化合物都是通過(guò)這條路線中描述的方法或通過(guò)與其類似的方法制備的，這些方法是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。這條路線中應(yīng)用的全部可變因數(shù)如下文的定義或如權(quán)利要求中的定義。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但這些例舉性實(shí)施方式的用途和目的僅用來(lái)舉例本發(fā)明，并非對(duì)本發(fā)明的實(shí)際保護(hù)范圍構(gòu)成任何形式的任何限定，更非將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于此。

實(shí)施例1：(E)-1-(N-苯基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯的制備

步驟A：(E)-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯的制備

室溫下，將3.79g(27.4mmol)K₂CO₃置于100ml茄形瓶中，加入40ml干燥的THF，攪拌下加入3.17g(15mmol)膦?；宜峒柞ザ阴?，室溫?cái)嚢?0min后，向茄形瓶中加入2g(13.7mmol)苯并咪唑-2-甲醛，然后將反應(yīng)體系置于N₂氛圍中，66℃回流24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻反應(yīng)液，過(guò)濾，濾液蒸干，大量乙酸乙酯重新溶解，然后用飽和NaCl溶液洗三次，無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)夜，過(guò)濾，蒸干溶劑得黃色固體，用快速制備液相純化(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得白色固體，收率：85％～90％。

步驟B：(E)-3-[(2′-丙烯酸甲酯)-1(H)-苯并咪唑]丙酸的制備

將0.404g(2mmol)(E)-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯置于100ml茄形瓶中，向茄形瓶中加入40ml丙酮，8ml DMF，0.8ml水，然后再加入5.52g(40mmol)碳酸鉀，1.224g(8mmol)溴丙酸，70℃回流4小時(shí)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全。反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，所得固體用50ml水溶解，0℃下6mol/L鹽酸調(diào)pH至5左右，然后用乙酸乙酯萃取至水層在紫外下幾無(wú)熒光，合并有機(jī)層，然后用NaCl溶液洗六次，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸干，得白色至黃色固體，不需純化可直接投下一步，收率：80％～85％。

步驟C：(E)-1-(N-苯基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯的制備

0℃下，0.473g(1.73mmol)(E)-3-[(2′-丙烯酸甲酯)-1(H)-苯并咪唑]丙酸和0.177g苯胺(1.903mmol)置于100ml茄形瓶中，加入50ml CH₂Cl₂，接著加入0.465g HOBt(3.46mmol)和0.97ml N-甲基嗎啉，最后分批加入0.664g EDCI(3.46mmol)，攪拌30min，撤掉冰浴，室溫過(guò)夜反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，飽和NaCl溶液洗CH₂Cl₂層三次，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，蒸干，得黃色固體，快速制備液相分離純化(石油醚：乙酸乙酯＝1:3)，得白色固體，收率50.2％。

ESI-MS m/z:370.1[M+H]⁺.

實(shí)施例2：(E)-1-(N-苯基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸的制備

室溫下，0.21g(0.601mmol)(E)-1-(N-苯基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯置于20ml茄形瓶中，加入6ml THF，1.6ml氫氧化鋰溶液(3.57mol/L)，室溫反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完成后，用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7左右，蒸除THF，加入10ml水，冰浴下，用2mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至固體不再析出，過(guò)濾，干燥，得白色固體，收率94.5％。

ESI-MS m/z:356.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.89(1H,s)，9.95(1H,s)，7.81(2H,d)，7.67(2H,t)，7.46(2H,d)，7.30(1H,t)，7.24(3H,t)，7.00(1H,t)，6.91(1H,d)，4.71(2H,t)，2.85(2H,t)

按照實(shí)施例1和實(shí)施例2的制備方法，選擇合適的原料，制的實(shí)施例3-實(shí)施例32的化合物。

實(shí)施例3(E)-1-[N-(4′-甲基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:364.1[M+H]⁺.

實(shí)施例4(E)-1-[N-(4′-甲基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:350.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.93(1H,s)，9.88(1H,s)，7.80(1H,d)，7.67(2H,t)，7.35(2H,d)，7.30(1H,t)，7.24(1H,t)，7.04(2H,d)，6.91(1H,d)，4.70(2H,t)，2.83(2H,t)，2.21(3H,s).

實(shí)施例5(E)-1-[N-(4′-甲氧基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:380.1[M+H]⁺.

實(shí)施例6(E)-1-[N-(4′-甲氧基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:366.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.80(1H,s)，9.80(1H,s)，7.81(1H,d)，7.67(2H,t)，7.36(2H,d)，7.32(1H,s)，7.25(1H,t)，6.90(1H,d)，6.82(2H,d)，4.70(2H,t)，3.69(3H,s)，2.80(2H,t).

實(shí)施例7(E)-1-[N-(4′-氯苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:384.1[M+H]⁺.

實(shí)施例8(E)-1-[N-(4′-氯苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:370.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:10.23(1H,s)，7.67(1H,d)，7.64(2H,t)，7.52(2H,d)，7.30(2H,d)，7.25(1H,t)，7.22(1H,t)，6.95(1H,d)，4.68(2H,t)，2.86(2H,t).

實(shí)施例9(E)-1-[N-(4′-溴苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:428.1[M+H]⁺，430.1[M+H]⁺.

實(shí)施例10(E)-1-[N-(4′-溴苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:414.1[M+H]⁺，416.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:10.18(1H,s)，7.66(1H,d)，7.64(2H,t)，7.46(4H,m)，7.26(1H,t)，7.22(1H,t)，6.94(1H,d)，4.68(2H,t)，2.86(2H,t).

實(shí)施例11(E)-1-[N-(3′-溴苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:428.1[M+H]⁺，430.1[M+H]⁺.

實(shí)施例12(E)-1-[N-(3′-溴苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:414.1[M+H]⁺，416.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.46(1H,s)，10.15(1H,s)，7.80(1H,s)，7.78(1H,d)，7.67(2H,t)，7.36(1H,d)，7.30(1H,t)，7.24(1H,t)，7.21(1H,d)，7.20(1H,s)，6.92(1H,d)，4.71(2H,t)，2.86(2H,t).

實(shí)施例13(E)-1-(N-哌啶基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:332.1[M+H]⁺.

實(shí)施例14(E)-1-(N-哌啶基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:328.2[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.74(1H,s)，7.79(1H,d)，7.67(1H,m)，7.66(1H,m)，7.33(2H,m)，6.90(1H,d)，4.60(2H,t)，3.34(2H,t)，3.21(2H,t)，2.84(2H,t)，1.74(2H,m)，1.32(2H,m)，1.26(2H,m).

實(shí)施例15(E)-1-(N-嗎啉基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:344.1[M+H]⁺.

實(shí)施例16(E)-1-(N-嗎啉基)丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:330.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.81(1H,s)，7.79(1H,d)，7.66(2H,t)，7.28(2H,m)，6.91(1H,d)，4.61(2H,t)，3.44(2H,t)，3.37(4H,t)，3.26(2H,t)，2.86(2H,t).

實(shí)施例17(E)-1-[N-(3′,5′-二甲氧基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:410.1[M+H]⁺.

實(shí)施例18(E)-1-[N-(3′,5′-二甲氧基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:396.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.81(1H,s)，9.90(1H,s)，7.80(1H,d)，7.67(2H,t)，7.31(1H,t)，7.25(1H,t)，6.91(1H,d)，6.87(1H,s)，6.71(2H,s)，4.70(2H,t)，3.67(6H,s)，2.86(2H,t).

實(shí)施例19(E)-1-[N-(4′-溴芐基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:442.1[M+H]⁺，444.1[M+H]⁺.

實(shí)施例20(E)-1-[N-(4′-溴芐基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:428.1[M+H]⁺，430.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.78(1H,s)，8.42(1H,t)，7.77(1H,d)，7.72-7.76(1H,m)，7.66-7.58(1H,m)，7.35(2H,d)，7.33-7.22(2H,m)，6.89(3H,d)，4.65(2H,t)，4.11(2H,d)，2.86(2H,t).

實(shí)施例21(E)-1-[N-(4′-溴苯乙基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:454.1[M+H]⁺，456.1[M+H]⁺.

實(shí)施例22(E)-1-[N-(4′-溴苯乙基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:440.1[M+H]⁺，442.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.82(1H,s)，8.00(1H,t)，7.77-7.59(3H,m)，7.34(2H,d)，7.31-7.21(2H,m)，6.93(1H,d)，6.89(2H,d)，4.59(2H,t)，3.12(2H,dd)，2.56(2H,t)，2.46(2H,t).

實(shí)施例23(E)-1-[N-(4′-甲氧基芐基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:394.1[M+H]⁺.

實(shí)施例24(E)-1-[N-(4′-甲氧基芐基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:380.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.85(1H,s)，8.32(1H,t)，7.78(1H,d)，7.69(1H,d)，7.63(1H,d)，7.29(2H,m)，6.89(3H,m)，6.75(2H,d)，4.65(2H,t)，4.08(2H,d)，3.70(3H,s)，2.66(2H,t).

實(shí)施例25(E)-1-[N-(4′-甲氧基苯乙基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:408.1[M+H]⁺.

實(shí)施例26(E)-1-[N-(4′-甲氧基苯乙基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:394.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:12.85(1H,s)，8.32(1H,t)，7.78(1H,d)，7.69(1H,d)，7.62(1H,d)，7.31(2H,t)，7.26(2H,t)，6.91(1H,d)，6.87(2H,d)，6.73(2H,d)，4.60(2H,t)，3.68(3H,s)，3.08(2H,q)，2.57(2H,t)，2.42(1H,t).

實(shí)施例27(E)-1-[N-(3′,5′-二氯苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:418.2[M+H]⁺，420.1[M+H]⁺.

實(shí)施例28(E)-1-[N-(3′,5′-二氯苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:404.2[M+H]⁺，406.0[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:10.48(1H,s)，7.63(2H,d)，7.60(1H,d)，7.54(2H,d)，7.26(1H,t)，7.23(1H,s)，7.20(1H,t)，6.92(1H,d)，4.67(2H,t)，2.86(2H,t).

實(shí)施例29(E)-1-[N-(2′,4′,6′-三甲基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:392.1[M+H]⁺.

實(shí)施例30(E)-1-[N-(2′,4′,6′-三甲基苯基)]丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:378.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:9.17(1H,s)，7.73(1H,d)，7.65(2H,t)，7.26(2H,dq)，6.93(1H,d)，6.76(2H,s)，4.68(2H,t)，2.88(2H,t)，2.16(3H,s)，1.73(6H,s).

實(shí)施例31(E)-1-{N-[4′-氧代-(4″-硝基苯基)苯基]}丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸甲酯，

ESI-MS m/z:487.1[M+H]⁺.

實(shí)施例32(E)-1-{N-[4′-氧代-(4″-硝基苯基)苯基]}丙酰胺-1(H)-苯并咪唑-2-丙烯酸，

ESI-MS m/z:473.1[M+H]⁺.

¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:10.34(1H,s)，8.21(2H,d)，7.64(2H,t)，7.60(2H,d)，7.58(1H,d)，7.25(1H,t)，7.20(1H,t)，7.09(2H,d)，7.06(2H,d)，6.96(1H,d)，4.67(2H,s)，2.89(2H,s).

實(shí)施例33本發(fā)明產(chǎn)物藥理作用研究

紫外-可見光分光光度計(jì)預(yù)冷，至溫度＜10℃，比色皿調(diào)零。加入860μL緩沖液(35mM Hepes)，20μL Pin1純蛋白，混勻。加入10μL待測(cè)化合物或溶劑對(duì)照(DMSO)，分光光度計(jì)中預(yù)冷孵育20-30min，加入150μL糜蛋白酶(60mg/mL，溶于蒸餾水中，現(xiàn)用現(xiàn)配)，快速混勻。最后加入40μL底物(順式脯氨酸底物)啟動(dòng)反應(yīng)，立即測(cè)定，在390nm下連續(xù)檢測(cè)90秒。計(jì)算抑制率，目標(biāo)化合物對(duì)Pin1抑制率見表1。

表1.目標(biāo)化合物的Pin1抑制活性

抗細(xì)胞增值的體外抑制實(shí)驗(yàn)

MTT試驗(yàn)測(cè)定方法

1.MTT的配制

稱取100mg MTT，加入50mL磷酸鹽緩沖溶液，避光攪拌30min，0.22μM濾膜過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存。

2.藥物溶液的配制

去目標(biāo)化合物溶于DMSO中，配成一定濃度的母液，將母液用乙醇和培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的溶液。加藥時(shí)溶液中DMSO終濃度應(yīng)低于1‰，乙醇的終濃度應(yīng)低于1％。

3.加藥及數(shù)據(jù)處理

待PC-3細(xì)胞(人前列腺癌細(xì)胞)貼壁24h后加藥，然后將藥物與細(xì)胞共同孵育96h。孵育完成后，加入MTT，3.5h后甩板，以DMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，使用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處吸光度值，以DMSO為空白對(duì)照，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。目標(biāo)化合物對(duì)PC-3細(xì)胞的抗增殖活性見表2。

表2.目標(biāo)化合物對(duì)PC-3細(xì)胞的抗增殖活性

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明要保護(hù)的通式的化合物具有一定的抗腫瘤活性和Pin1抑制作用。本發(fā)明的化合物具有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。