本發(fā)明提供了一種改性的聚縮酮PK3，同時(shí)還提供其制備方法和醫(yī)用用途，屬于藥用材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：蛋白質(zhì)藥物是一類新型的用于腫瘤治療與預(yù)防的生物藥物，與傳統(tǒng)的化學(xué)藥物相比，蛋白類藥物作為治療藥物具有藥效顯著、靶點(diǎn)專一、副作用低、品種繁多等優(yōu)點(diǎn)，有望成為未來(lái)臨床治療的重要發(fā)展方向。但是，由于蛋白質(zhì)為生化制劑，其半衰期短、清除率高、滲透力差、易受環(huán)境中的復(fù)雜理化因素影響而失去其生物活性，使其作為治療藥物表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性和治療效果。因此，高效的運(yùn)輸載體是蛋白類藥物應(yīng)用的關(guān)鍵。目前，生物可降解材料主要包括淀粉、明膠、葡聚糖、聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)等，其中，PLGA最為常用。PLGA緩釋周期長(zhǎng)，避免頻繁給藥，且使用安全，生物利用度顯著提高，可應(yīng)用于注射、口服、埋植等劑型。但PLGA體內(nèi)降解產(chǎn)物為二氧化碳和水，酸性物質(zhì)的產(chǎn)生會(huì)影響蛋白類藥物的穩(wěn)定性，帶來(lái)后期不釋放等問(wèn)題。聚縮酮家族，目前包括PPADK，PCADK及PK1-PK3。作為一類新型生物可降解材料，具有良好的生物兼容性、pH敏感性和蛋白友好性。與廣泛應(yīng)用的聚酯類高分子不同，聚縮酮在堿性或中性環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定，在酸性條件下快速降解為無(wú)毒、中性小分子代謝產(chǎn)物，不改變環(huán)境pH值從而引起炎癥反應(yīng)，有效的避免了聚酯類降解產(chǎn)物產(chǎn)生的酸性環(huán)境對(duì)蛋白類藥物穩(wěn)定性的影響，解決了蛋白變性后釋放困難等問(wèn)題，彌補(bǔ)了聚酯類材料的不足。同時(shí)，能夠?qū)w內(nèi)不同部位pH值的變化做出回應(yīng)，是蛋白類藥物靶向腫瘤(pH6.0-7.0)及溶酶體(pH4.0-6.0)等部位的理想載體。但由于聚縮酮分子量偏低，力學(xué)性能較差，單獨(dú)形成藥物載體時(shí)外表易形成塌陷、結(jié)構(gòu)松散、多孔洞、導(dǎo)致藥物包封效率極低，只能采取與PLGA混用的辦法，來(lái)提高載體的剛性結(jié)構(gòu)和包封效率。此外，腫瘤靶向制劑通常以靜脈注射方式給藥，聚縮酮作為疏水性高聚物，進(jìn)入人體血液系統(tǒng)后，將不可避免的吸附血漿蛋白，進(jìn)而被巨噬細(xì)胞識(shí)別吞噬，因此，聚縮酮的生物兼容性有待提高。聚乙二醇修飾pH敏感性聚合物，可以增加材料的親水性，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)載體的攝取，同時(shí)提高聚縮酮的分子量，改善聚縮酮的力學(xué)性能，使其能夠自包封單獨(dú)形成藥物載體，增加蛋白類藥物的包封效率。此外，聚乙二醇化技術(shù)仍有諸多優(yōu)勢(shì)，如降低免疫原性、延長(zhǎng)載體循環(huán)時(shí)間及增加穩(wěn)定性等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種改性的聚縮酮PK3及制備方法，的目的是解決了現(xiàn)有聚縮酮PK3力學(xué)性質(zhì)差、分散穩(wěn)定性差及生物兼容性不好等問(wèn)題，對(duì)聚縮酮進(jìn)行親水性修飾，從而獲得一系列蛋白友好型的pH敏感雙親性材料。一般地，材料表面親水性越好，在血液環(huán)境中分散性越好，對(duì)血漿蛋白的阻抗能力越強(qiáng)，被免疫系統(tǒng)清除的概率越小，同時(shí)，作為雙親性材料，在溶液中自組裝形成載體的能力更強(qiáng)。本發(fā)明選用聚乙二醇修飾聚縮酮，通過(guò)活性化合物作為中間連接分子，通過(guò)共價(jià)鍵與聚縮酮末端羥基連接，形成的氨酯鍵在酸性環(huán)境下為可降解化學(xué)鍵。與此同時(shí)，親水性的聚乙二醇阻礙血漿蛋白的特異性吸附，延長(zhǎng)載體材料在體內(nèi)的血液循環(huán)周期，提高載體材料的分散穩(wěn)定性。本發(fā)明的另一目的是提供上述聚縮酮PK3改性材料的制備方法。本發(fā)明所述聚縮酮PK3改性材料的結(jié)構(gòu)式為：其中，單體x=86.7%，單體y=13.3%，是聚乙二醇單甲醚鏈段，分子量分別為2000，5000和10000，m分別對(duì)應(yīng)為45，113和227。d-f聚合物分別對(duì)應(yīng)聚縮酮-聚乙二醇單甲醚2000，聚縮酮-聚乙二醇單甲醚5000和聚縮酮-聚乙二醇單甲醚10000。本發(fā)明所述的聚縮酮PK3改性材料制備方法，步驟如下：1）聚縮酮PK3的合成7.25mmol的1,4-環(huán)己烷二甲醇和1.81mmol的1,5-戊二醇溶解在20~30mL蒸餾苯中，加熱到90~100°C。35~55mg對(duì)甲苯磺酸溶解在0.5~1mL乙酸乙酯中，加入到上述苯溶液。加入9.06mmol的2,2-二甲氧基丙烷，開(kāi)始反應(yīng)；每隔2h補(bǔ)償2mL的苯和500μL的2,2-二甲氧基丙烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)24~48h，然后加入100~200μL三乙胺停止反應(yīng)，合成的聚縮酮在0.5~1L冷的正己烷中沉淀分離；2）聚乙二醇單甲醚的活化聚乙二醇單甲醚的末端羥基的活化，0.2mmol聚乙二醇單甲醚溶解在5~10mL的氯仿中，加入60~100倍摩爾比的1,6-亞甲基二異氰酸酯，加熱到60~80°C，過(guò)夜攪拌回流；粗產(chǎn)物在1~2L沉淀劑中多次沉淀，即獲得活化的聚乙二醇單甲醚；3）目標(biāo)產(chǎn)物的合成將步驟(2)獲得的活化的0.2mmol聚乙二醇單甲醚溶解在6~8mL的氯仿中，0.8~1.2倍摩爾量的聚縮酮溶解在2~4mL氯仿中，聚縮酮溶液逐滴加入上述溶液，加熱到60~80°C，過(guò)夜攪拌回流；粗產(chǎn)物在1~2L沉淀劑中多次沉淀，即獲得目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明所述聚縮酮PK3改性材料的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中聚乙二醇單甲醚分別是聚乙二醇單甲醚2000，聚乙二醇單甲醚5000和聚乙二醇單甲醚10000時(shí)，對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物分別為聚縮酮PK3-聚乙二醇單甲醚2000，聚縮酮PK3-聚乙二醇單甲醚5000和聚縮酮PK3-聚乙二醇單甲醚10000。本發(fā)明所述聚縮酮PK3改性材料的制備方法，其特征在于所述步驟(2)、(3)沉淀劑選自正己烷、石油醚、甲基叔丁基謎、乙醚、1,4-二氧六環(huán)等有機(jī)溶劑。本發(fā)明的積極效果在于：提供了一種聚縮酮PK3改性材料，解決了現(xiàn)有聚縮酮PK3力學(xué)性質(zhì)差、分散穩(wěn)定性差及生物相容性不好等問(wèn)題，對(duì)聚縮酮進(jìn)行親水性修飾，從而獲得一系列蛋白友好型的pH敏感雙親性材料，具有良好的pH敏感性、親水性、穩(wěn)定性和力學(xué)性能，能夠獨(dú)立作為藥物載體使用，包封化藥及蛋白類藥物，靶向腫瘤及炎癥部位。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1聚縮酮PK3改性材料的合成示意圖；圖2為實(shí)施例1聚縮酮PK3改性材料的傅里葉紅外光譜圖；圖3為實(shí)施例1聚縮酮PK3改性材料的凝膠滲透色譜圖；圖4為實(shí)施例1~3聚縮酮PK3改性材料的細(xì)胞毒性結(jié)果；圖5為實(shí)施例1~3聚縮酮PK3改性材料制備人血清白蛋白(HSA)納米粒的穩(wěn)定性結(jié)果。具體實(shí)施方式通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實(shí)施例1聚縮酮PK3-聚乙二醇單甲醚2000，其結(jié)構(gòu)式為：其制備方法如下：(1)聚縮酮PK3的合成1,4-環(huán)己烷二甲醇和1,5-戊二醇溶解在20~30mL蒸餾苯中，加熱到90~100°C。35~55mg對(duì)甲苯磺酸溶解在0.5~1mL乙酸乙酯中，加入到上述苯溶液。加入與1,4-環(huán)己烷二甲醇、1,5-戊二醇加和等摩爾量的2,2-二甲氧基丙烷，開(kāi)始反應(yīng)。隨機(jī)補(bǔ)償蒸餾的苯和2,2-二甲氧基丙烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)24~48h，然后加入100~200μL三乙胺停止反應(yīng)，合成的聚縮酮在0.5~1L冷的正己烷中沉淀分離。(2)聚乙二醇單甲醚2000的活化聚乙二醇單甲醚2000的末端羥基的活化，聚乙二醇單甲醚2000溶解在5~10mL氯仿中，加入60~100摩爾倍數(shù)的1,6-亞甲基二異氰酸酯，加熱到60~80°C，過(guò)夜攪拌回流。粗產(chǎn)物在1~2L正己烷中多次沉淀，即獲得活化的聚乙二醇單甲醚2000。(3)目標(biāo)產(chǎn)物的合成將步驟(2)獲得的活化的聚乙二醇單甲醚2000溶解在5~10mL氯仿中，等摩爾量的聚縮酮(PK3)溶解在少量氯仿中，聚縮酮溶液逐滴加入上述溶液，加熱到60~80°C，過(guò)夜攪拌回流。粗產(chǎn)物在1~2L正己烷中多次沉淀，即獲得聚縮酮PK3-聚乙二醇單甲醚2000。實(shí)施例2聚縮酮PK3-聚乙二醇單甲醚5000，其結(jié)構(gòu)式為：其制備方法如下：(1)聚縮酮PK3的合成1,4-環(huán)己烷二甲醇和1,5-戊二醇溶解在20~30mL蒸餾苯中，加熱到90~100°C。35~55mg對(duì)甲苯磺酸溶解在0.5~1mL乙酸乙酯中，加入到上述苯溶液。加入與1,4-環(huán)己烷二甲醇、1,5-戊二醇加和等摩爾量的2,2-二甲氧基丙烷，開(kāi)始反應(yīng)。隨機(jī)補(bǔ)償蒸餾的苯和2,2-二甲氧基丙烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)24~48h，然后加入100~200μL三乙胺停止反應(yīng)，合成的聚縮酮在0.5~1L冷的正己烷中沉淀分離。(2)聚乙二醇單甲醚5000的活化聚乙二醇單甲醚5000的末端羥基的活化，聚乙二醇單甲醚5000溶解在5~10mL氯仿中，加入60~100摩爾倍數(shù)的1,6-亞甲基二異氰酸酯，加熱到60~80°C，過(guò)夜攪拌回流。粗產(chǎn)物在1~2L正己烷中多次沉淀，即獲得活化的聚乙二醇單甲醚5000。(3)目標(biāo)產(chǎn)物的合成將步驟(2)獲得的活化的聚乙二醇單甲醚5000溶解在5~10mL氯仿中，等摩爾量的聚縮酮(PK3)溶解在少量氯仿中，聚縮酮溶液逐滴加入上述溶液，加熱到60~80°C，過(guò)夜攪拌回流。粗產(chǎn)物在1~2L正己烷中多次沉淀，即獲得聚縮酮PK3-聚乙二醇單甲醚5000。實(shí)施例3聚縮酮PK3-聚乙二醇單甲醚10000，其結(jié)構(gòu)式為：其制備方法如下：(1)聚縮酮PK3的合成1,4-環(huán)己烷二甲醇和1,5-戊二醇溶解在20~30mL蒸餾苯中，加熱到90~100°C。35~55mg對(duì)甲苯磺酸溶解在0.5~1mL乙酸乙酯中，加入到上述苯溶液。加入與1,4-環(huán)己烷二甲醇、1,5-戊二醇加和等摩爾量的2,2-二甲氧基丙烷，開(kāi)始反應(yīng)。隨機(jī)補(bǔ)償蒸餾的苯和2,2-二甲氧基丙烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)24~48h，然后加入100~200μL三乙胺停止反應(yīng)，合成的聚縮酮在0.5~1L冷的正己烷中沉淀分離。(2)聚乙二醇單甲醚10000的活化聚乙二醇單甲醚10000的末端羥基的活化，聚乙二醇單甲醚10000溶解在5~10mL氯仿中，加入60~100摩爾倍數(shù)的1,6-亞甲基二異氰酸酯，加熱到60~80°C，過(guò)夜攪拌回流。粗產(chǎn)物在1~2L正己烷中多次沉淀，即獲得活化的聚乙二醇單甲醚10000。(3)目標(biāo)產(chǎn)物的合成將步驟(2)獲得的活化的聚乙二醇單甲醚10000溶解在5~10mL氯仿中，等摩爾量的聚縮酮(PK3)溶解在少量氯仿中，聚縮酮溶液逐滴加入上述溶液，加熱到60~80°C，過(guò)夜攪拌回流。粗產(chǎn)物在1~2L正己烷中多次沉淀，即獲得聚縮酮PK3-聚乙二醇單甲醚10000。實(shí)驗(yàn)例1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：人類乳腺癌細(xì)胞株MCF7培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)瓶置于37°C，含5%CO2培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。以1×104個(gè)/孔的密度將處于對(duì)數(shù)期的MCF7細(xì)胞接種于在96孔板中，37°C培養(yǎng)24h使其貼壁，第二天去除培養(yǎng)液，分別加入100mg/mL預(yù)先制備含聚縮酮改性材料的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。去除培養(yǎng)基，每孔加入20μL、5mg/mLMTT試劑，37°C孵育4h，DMSO溶解生成的甲瓚結(jié)晶，酶標(biāo)儀492nm分析溶液吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，聚縮酮-聚乙二醇單甲醚(PK3-mPEG)對(duì)MCF7細(xì)胞24h后的殺傷作用明顯低于聚縮酮PK3。這歸功于表面聚乙二醇單甲醚的修飾，降低其材料毒性，屏蔽聚縮酮表面負(fù)電荷，增加材料的親水性和生物兼容性。實(shí)驗(yàn)例2聚縮酮改性材料制備HSA納米粒：采用雙乳化溶劑揮發(fā)法制備HSA納米粒。200μL的20mg/mL的HSA逐滴加入含有40mg聚縮酮或聚縮酮改性材料的2mL二氯甲烷中，高壓均質(zhì)剪切機(jī)22000rpm均質(zhì)1.5min形成初乳，初乳立即注入到20mL含有1%PVA的外水相，高壓均質(zhì)剪切機(jī)22000rpm均質(zhì)2min，形成的復(fù)乳過(guò)夜磁力攪拌揮發(fā)有機(jī)溶劑。去離子水離心洗滌三次，獲得的HSA納米粒-40°C條件下冷凍干燥，4°C保存。實(shí)驗(yàn)例3HSA納米粒穩(wěn)定性表征：稱取冷凍干燥后的聚縮酮或聚縮酮改性材料制備HSA納米粒20mg，重懸在2mLpH7.4PBS中，靜置三周，觀察沉淀或聚集現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，圖A為靜置一天現(xiàn)象，圖B為靜置三周現(xiàn)象，聚縮酮PK3組EP管底部明顯有沉淀現(xiàn)象，而聚縮酮修飾材料組依舊呈懸浮狀態(tài)，說(shuō)明聚縮酮修飾材料親水性和穩(wěn)定性較好。實(shí)驗(yàn)例4HSA納米粒的粒徑及電位分布檢測(cè)：采用激光粒度儀分析HSA納米粒粒徑及電位分布，HSA納米粒測(cè)試濃度0.5mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，HSA納米粒平均粒徑基本在200~300nm之間，電位在-3~0mV之間。親水性的修飾提高了聚縮酮表面電位，同時(shí)也增加了在溶液中的粒徑，這歸功于聚乙二醇單甲醚的親水作用。表1.實(shí)施例1~3聚縮酮PK3改性材料制備納米粒粒徑及電位分布納米粒材料粒徑/nm電位/mV包封效率(%)PK3225.7-1.3883.9PK3-mPEG2000284.4-2.2276.9PK3-mPEG5000302.0-2.3074.5PK3-mPEG10000322.6-1.8672.4實(shí)驗(yàn)例5HSA納米粒的包封效率檢測(cè)：采用BCA蛋白濃度試劑盒檢測(cè)納米粒的包封效率。20mg的納米粒溶解于1mL，1M的NaOH溶液放置一天，隨后加入2mL，1M的HCl溶液放置一天，最后NaOH溶液中和降解液。降解液中的蛋白濃度稀釋后使用BCA蛋白試劑盒分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，納米粒的實(shí)際包封效率分布在72.4%~83.9%之間。聚縮酮PK3改性材料包封率稍低于聚縮酮PK3，可能歸功于聚縮酮修飾材料的親水性，在納米粒的制備過(guò)程中導(dǎo)致蛋白藥物趨于分布于納米粒的表面，從而降低了藥物包封效率。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3