本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及比伐盧定的固相片段合成方法。
背景技術(shù)：
：比伐盧定外文名或通用名為Bivalirudin，具有以下結(jié)構(gòu)：D-苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-L-甘胺酰-L-甘氨酰-L-甘氨酰-L-甘氨酰-L-天冬酰氨酰-L-甘氨酰-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L異亮氨酰-L-脯胺酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-酪胺酰-L-亮氨酸比伐盧定(bivalirudin)是一種近年來應(yīng)用于臨床的直接凝血酶抑制劑，于2000年批準(zhǔn)在美國上市，其有效抗凝成分為水蛭素衍生物片段，通過直接并特異性抑制凝血酶活性而發(fā)揮抗凝作用，作用可逆而短暫。早期的臨床研究顯示：比伐盧定抗凝治療效果確切，且出血事件的發(fā)生率較低，和傳統(tǒng)的肝素抗凝治療相比使用更為安全。對于接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）的患者，比伐盧定可用于替代肝素。大多數(shù)比伐盧定的III期試驗(yàn)均使用缺血和出血結(jié)局的主要復(fù)合終點(diǎn)比較比伐盧定和肝素，這些試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)比伐盧定優(yōu)于或不劣于肝素。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種新的比伐盧定的合成方法，該方法顯著的提高了比伐盧定的收率與純度，反應(yīng)簡單可控，適用于工業(yè)生產(chǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種比伐盧定的固相片段合成方法，其特點(diǎn)是：該方法以三苯甲基氯類型樹脂為起始，采用固相合成1-10全保護(hù)肽樹脂，將全保護(hù)十一肽從樹脂上切割下來在固相中接入11-20肽樹脂，經(jīng)裂解得到比伐盧定粗品。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所述的比伐盧定的合成方法，其進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案是：該方法的具體步驟如下：（1）在縮合劑與催化劑作用下，由Fmoc-Leu-OH和wangresin偶聯(lián)得到Fmoc-Leu-wangresin脂；（2）脫去Fmoc，在縮合劑作用下，依次偶聯(lián)Tyr,Glu,Glu,Ile,Glu,Glu,Phe,Asp得到Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S1；（3）Fmoc-Gly-OH與CTCResin在有機(jī)堿作用下反應(yīng)得到Fmoc-Gly-CTCResin；（4）脫去Fmoc，在縮合劑作用下，依次偶聯(lián)Asn,Gly-Gly,Gly-Gly,Pro,Arg,Pro,D-Phe得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-CTCresin，即S2；其中X為氨基保護(hù)基；（5）使用切割試劑切割S1得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly，即S3；（6）在縮合劑作用下，S3與S1反應(yīng)得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S4；當(dāng)X是不為Boc的氨基保護(hù)基時，先脫除X，再裂解得到比伐盧定粗品；當(dāng)X為Boc時，直接經(jīng)裂解得到比伐盧定粗品。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所述的比伐盧定的合成方法，其進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案是：1、所述的縮合劑選自DIC、EDC·HCl中任意一種與HOBt、Cl-HOBt、HOAt、HOCt中任意一種的組合。2、所述的縮合劑選自HBTU、HATU、HCTU、TBTU、PyBOP、PyAOP中任意一種與DIEA、TEA、NMM中任意一種的組合。3、所述的氨基保護(hù)基X可以為現(xiàn)有技術(shù)中可適用于本發(fā)明的任何氨基保護(hù)基，優(yōu)選自Boc或者Fmoc。4、使用切割試劑選自20%的TFE/DCM溶液或者1-2%的TFA/DCM溶液。5、步驟（3）中所述的CTCResin替代度為0.5-2.0mmol/g，優(yōu)選為1.0-1.5mmol/g。6、步驟（1）中所述的WangResin替代度為0.3-1.5mmol/g,優(yōu)選0.5-0.6mmol/g。7、所述的有機(jī)堿選自DIEA、NMM、Py、DMAP中任意一種。8、所述催化劑選自Py、DMAP中任意一種。本發(fā)明涉及的英文縮寫所對應(yīng)的中文名稱見下表：英文縮寫中文名稱英文縮寫中文名稱Pro脯氨酸CTCResin2-氯-三苯甲基氯樹脂Leu亮氨酸Wangresin王樹脂Arg精氨酸TEA三乙胺Tyr酪氨酸NMMN-甲基嗎啉Phe苯丙氨酸DIEAN,N-二異丙基乙胺Asp天冬氨酸DIC二異丙基碳二亞胺Asn天冬酰胺HOBt1-羥基苯并三氮唑Gly甘氨酸DMAP對二甲氨基吡啶Glu谷氨酸Boc叔丁氧羰基Ile異亮氨酸Trt三苯甲基Fmoc9-芴甲氧羰基TFE三氟乙醇tBu叔丁基TFA三氟乙酸pbf(2,3-二氫-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺?；鵋OAt1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑PIP六氫吡啶DCM二氯甲烷Py吡啶DMFN,N-二甲基甲酰胺HBTU苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽EDC·HCI1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽HCTU6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯PyBOP六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷PyAOP(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽HATU2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯本發(fā)明提供的合成方法中，所用到的原料、試劑及Fmoc-Gly-Gly-OH均可由市場購得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法既避免了多Gly10雜質(zhì)的產(chǎn)生又成功的降低了Arg偶聯(lián)的難度，顯著的提高了比伐盧定的收率與純度。本發(fā)明工藝過程僅涉及氨基酸的縮合和脫保護(hù)，反應(yīng)簡單可控，適用于工業(yè)生產(chǎn)。附圖說明圖1為實(shí)驗(yàn)例制得的比伐盧定產(chǎn)品MS圖；圖2為實(shí)驗(yàn)例制得的比伐盧定產(chǎn)品HPLC圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1，一種比伐盧定的合成方法：該方法以三苯甲基氯類型樹脂為起始，采用固相合成1-10全保護(hù)肽樹脂，將全保護(hù)十一肽從樹脂上切割下來在固相中接入11-20肽樹脂，經(jīng)裂解得到比伐盧定粗品。實(shí)施例2，一種比伐盧定的合成方法，該方法的具體步驟如下：（1）在縮合劑與催化劑作用下，由Fmoc-Leu-OH和wangresin偶聯(lián)得到Fmoc-Leu-wangresin脂；（2）脫去Fmoc，在縮合劑作用下，依次偶聯(lián)Tyr,Glu,Glu,Ile,Glu,Glu,Phe,Asp得到Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S1；（3）Fmoc-Gly-OH與CTCResin在有機(jī)堿作用下反應(yīng)得到Fmoc-Gly-CTCResin；（4）脫去Fmoc，在縮合劑作用下，依次偶聯(lián)Asn,Gly-Gly,Gly-Gly,Pro,Arg,Pro,D-Phe得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-CTCresin，即S2；其中X為氨基保護(hù)基；（5）使用切割試劑切割S1得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly，即S3；（6）在縮合劑作用下，S3與S1反應(yīng)得到X-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu-wangresin，即S4；當(dāng)X是不為Boc的氨基保護(hù)基時，先脫除X，再裂解得到比伐盧定粗品；當(dāng)X為Boc時，直接經(jīng)裂解得到比伐盧定粗品。所述的縮合劑選自DIC、EDC·HCl中任意一種與HOBt、Cl-HOBt、HOAt、HOCt中任意一種的組合。或者選自HBTU、HATU、HCTU、TBTU、PyBOP、PyAOP中任意一種與DIEA、TEA、NMM中任意一種的組合。所述的氨基保護(hù)基X選自Boc或者Fmoc。使用切割試劑選自20%的TFE/DCM溶液或者1-2%的TFA/DCM溶液。步驟（3）中所述的CTCResin替代度為0.5-2.0mmol/g，優(yōu)選為1.0-1.5mmol/g。步驟（1）中所述的WangResin替代度為0.3-1.5mmol/g,優(yōu)選0.5-0.6mmol/g。所述的有機(jī)堿選自DIEA、NMM、Py、DMAP中任意一種。所述催化劑選自Py、DMAP中任意一種。實(shí)施例3，一種比伐盧定的合成方法實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)例1Fmoc-Leu-wangresin的制備稱取wangresin（0.53mmol/g）47.2g置于反應(yīng)柱中，加入DCM400mL氮?dú)獯捣鲾嚢枞軡q30min，抽干。稱取Fmoc-Leu-OH26.5g，HOBt11.1g,DMAP0.9g置于燒杯中，加入30%DCM/DMF135mL,攪拌溶解，降溫至3±2℃。量取DIC12.8mL加入上述燒杯中，反應(yīng)溫度10±2℃，反應(yīng)10min。加入反應(yīng)柱中，30±5℃氮?dú)獯捣鲾嚢璺磻?yīng)5小時，抽干溶劑，DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風(fēng)干燥8小時，得Fmoc-Leu-wangresin55.6g，取代度0.47mmol/g。實(shí)驗(yàn)例2Fmoc-Leu-wangresin的制備稱取wangresin（0.53mmol/g）47.2g置于反應(yīng)柱中，加入DCM400mL溶漲30min，抽干。稱取Fmoc-Leu-OH26.5g，HOBt11.1g置于燒杯中，加入30%DCM/DMF135mL,攪拌溶解，降溫至3±2℃。量取DIC12.8mL加入上述燒杯中，反應(yīng)溫度10±2℃，反應(yīng)10min。加入反應(yīng)柱中。量取Py20mL加入反應(yīng)柱中，60±5℃氮?dú)獯捣鲾嚢璺磻?yīng)5小時，抽干溶劑，DMF洗滌3次,DCM洗滌4次，35℃鼓風(fēng)干燥8小時，得Fmoc-Leu-wangresin52.6g，取代度0.45mmol/g。實(shí)驗(yàn)例3Fmoc-Gly-CTCResin的制備取CTCResin(1.2mmol/g)50.00g置于多肽反應(yīng)器中，加入DCM400mL氮?dú)獯捣鲾嚢?0分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。稱取Fmoc-Gly-OH53.46g,加入DMF340mL攪拌溶解，加入DIEA94.5mL，冰浴15分鐘后加入多肽反應(yīng)器中，氮?dú)獯捣鲾嚢璺磻?yīng)2小時后抽干反應(yīng)液，DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風(fēng)干燥8小時，得Fmoc-Gly-CTCResin65.6g，取代度0.92mmol/g。實(shí)驗(yàn)例4S1肽樹脂的制備取Fmoc-Leu-wangresin21.3g(10mmol)置于多肽反應(yīng)器中，加入DCM200mL氮?dú)獯捣鲾嚢?0分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。加入DBLK80mL脫Fmoc保護(hù)2次，5+15分鐘，每次80mL。DMF洗滌5次，每次80mL，1分鐘。稱取Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g(20mmol),HOBt3.0g(22mmol),加入DMF80mL攪拌溶解，冰浴5分鐘，加入DIC3.4mL(22mmol)，冰浴活化10分鐘后加入多肽反應(yīng)柱中，氮?dú)獯捣鲾嚢璺磻?yīng)1小時后抽干反應(yīng)液，DMF洗滌3次，每次100mL。按此方法依次接入Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH。脫除Fmoc，得到S1肽樹脂。實(shí)驗(yàn)例5S1肽樹脂的制備取Fmoc-Leu-wangresin21.3g(10mmol)置于多肽反應(yīng)器中，加入DCM200mL氮?dú)獯捣鲾嚢?0分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。加入DBLK80mL脫Fmoc保護(hù)2次，5+15分鐘，每次80mL。DMF洗滌5次，每次80mL，1分鐘。稱取Fmoc-Tyr(tBu)-OH9.2g(20mmol),HBTU6.8g(19mmol)，加入DMF80mL攪拌溶解，冰浴5分鐘，加入DIEA5.2mL(30mmol)，冰浴活化10分鐘后加入多肽反應(yīng)柱中，氮?dú)獯捣鲾嚢璺磻?yīng)1小時后抽干反應(yīng)液，DMF洗滌3次，每次100mL。按此方法依次接入Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH。脫除Fmoc，得到S1肽樹脂實(shí)驗(yàn)例6S2肽樹脂的制備取Fmoc-Gly-CTCResin27.4g(25mmol)置于多肽反應(yīng)器中，加入DCM200mL氮?dú)獯捣鲾嚢?0分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。加入DBLK80mL脫Fmoc保護(hù)2次，5+15分鐘，每次80mL。DMF洗滌5次，每次100mL，1分鐘。稱取Fmoc-Asn(Trt)-OH29.9g(50mmol),HOBt7.4g(55mmol),加入DMF100mL攪拌溶解，冰浴5分鐘，加入DIC8.5mL(55mmol)，冰浴活化10分鐘后加入多肽反應(yīng)柱中，氮?dú)獯捣鲾嚢璺磻?yīng)1小時后抽干反應(yīng)液，DMF洗滌3次，每次100mL，1分鐘。按此方法依次接入Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Pro-OH,Boc-D-Phe-OH。DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風(fēng)干燥8小時,得到S2肽樹脂。實(shí)驗(yàn)例7S2肽樹脂的制備取Fmoc-Gly-CTCResin27.4g(25mmol)置于多肽反應(yīng)器中，加入DCM200mL氮?dú)獯捣鲾嚢?0分鐘，使樹脂充分溶脹后抽干DCM。加入DBLK80mL脫Fmoc保護(hù)2次，5+15分鐘，每次80mL。DMF洗滌5次，每次100mL，1分鐘。稱取Fmoc-Asn(Trt)-OH29.9g(50mmol),HBTU16.1g(45mmol),加入DMF100mL攪拌溶解，冰浴5分鐘，加入DIEA12.9mL(75mmol)，冰浴活化10分鐘后加入多肽反應(yīng)柱中，氮?dú)獯捣鲾嚢璺磻?yīng)1小時后抽干反應(yīng)液，DMF洗滌3次，每次100mL，1分鐘。按此方法依次接入Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Gly-Gly-OH,Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Pro-OH,Boc-D-Phe-OH。DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風(fēng)干燥8小時,得到S2肽樹脂。實(shí)驗(yàn)例8S3全保護(hù)肽的制備取實(shí)驗(yàn)例6S2肽樹脂，加入600mL1%TFA/DCM溶液中室溫攪拌裂解2.0小時。濾去樹脂，加入無水碳酸鉀5g干燥8小時。過濾，濃縮至油狀。實(shí)施例9S3全保護(hù)肽的制備取實(shí)驗(yàn)例7S2肽樹脂肽樹脂，加入600mL20%TFE/DCM溶液中室溫攪拌裂解1.5小時。濾除樹脂，樹脂再加入300mL20%TFE/DCM溶液中室溫攪拌裂解1.5小時后濾去樹脂，合并濾液，濃縮至油狀。實(shí)驗(yàn)例10S4肽樹脂的制備取實(shí)驗(yàn)例8所得S3全保護(hù)肽(25mmol)，加入30%DCM/DMF200mL溶解后倒入燒杯中。稱取HOBt3.7g(27.5mmol)加入燒杯中，溶解，降溫至5℃。取DIC4.3mL(27.5mmol)加入上述已降溫溶液中10±5℃反應(yīng)15min，加入實(shí)施例4S1肽樹脂中反應(yīng)3小時。DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風(fēng)干燥8小時,得到S4肽樹脂。實(shí)驗(yàn)例11S4肽樹脂的制備取實(shí)驗(yàn)例9所得S3全保護(hù)肽(25mmol)，加入30%DCM/DMF200mL溶解后倒入燒杯中。稱取HATU8.6g(22.5mmol)加入燒杯中，溶解，降溫至5℃。取DIEA6.5mL(37.5mmol)加入上述已降溫溶液中10±5℃反應(yīng)15min，加入實(shí)施例5S1肽樹脂中反應(yīng)3小時。DMF洗滌3次，DCM洗滌4次，35℃鼓風(fēng)干燥8小時,得到S4肽樹脂。實(shí)驗(yàn)例12裂解配制TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚=90:5:3:2(體積比)的裂解液400mL冰浴至5℃。取實(shí)施例10所得S4肽樹脂加入上述裂解液中，25±5℃裂解2h，加入2400mL冰乙醚中析晶。離心，所得固體乙醚研洗離心3次，真空減壓干燥。得粗肽31.4g，HPLC定量含目的肽16.7g，收率76.6%。本例所得產(chǎn)品MS，HPLC見圖1-圖2。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來應(yīng)用和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)。當(dāng)前第1頁1 2 3