本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中單核苷酸多態(tài)性rs2178077在篩查落葉型天皰瘡患者中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

天皰瘡是一種少見的可威脅生命的自身免疫性大皰性皮膚病(Stanley,1989；Nousari and Anhalt,1999)，其特點為患者體內(nèi)存在抗角質(zhì)形成細(xì)胞黏附分子的自身抗體，缺乏角質(zhì)形成細(xì)胞間的黏連功能。天皰瘡發(fā)病率為每年0.76-6.7/百萬人次，不同種族及地域間存在差異(Ahmed et al.,1990；Bystryn and Rudolph,2005；Meyer and Misery,2010)。盡管目前可通過長期系統(tǒng)性應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑對該病進(jìn)行治療(Loiseau et al.,2000)，但在美國，由于天皰瘡導(dǎo)致的死亡率接近10％(Lombardi et al.,1996)，且目前的治療方案存在明顯的副作用。因此，我們需要對天皰瘡的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究并尋找新的治療方案。

尋常型天皰瘡(PV)和落葉型天皰瘡(PF)是天皰瘡的兩種主要亞型，二者影響皮膚的不同結(jié)構(gòu)層次并且有不同的臨床表現(xiàn)(Stanley,1989；Bystryn and Rudolph,2005)。尋常型天皰瘡主要的自身抗原為橋粒核心糖蛋白3(Dsg 3)，50％-60％的患者存在橋粒核心糖蛋白1(Dsg 1)的抗體。尋常型天皰瘡患者的皮膚和黏膜均受累。落葉型天皰瘡患者僅存在橋粒核心糖蛋白1(Dsg 1)的抗體，并且僅有皮膚損害，不累及黏膜。尋常型天皰瘡的皮損程度較深，體液流失較多，機(jī)體代謝紊亂，加大感染風(fēng)險。因此，與尋常型天皰瘡相比，落葉型天皰瘡的預(yù)后較好。盡管二者在臨床表現(xiàn)及自身抗原方面存在差異，二者被視為同一種疾病且治療方案相近。

目前，天皰瘡的遺傳學(xué)基礎(chǔ)還沒有被很好的研究，但通過不同種群中疾病患病率的差異、自身免疫性疾病與遺傳相關(guān)及HLA I和HLA II類分子在不同種群中的關(guān)聯(lián)性均可證實該病存在遺傳風(fēng)險(Ahmed et al.,1990；Lombardi et al.,1996；Miyagawa et al.,1997；Lombardi et al.,1999；Loiseau et al.,2000；Shams et al.,2009；Saha et al.,2010；Tunca et al.,2010)。然而，大部分文章僅研究了較少的HLA等位基因并且缺乏獨立的驗證。目前，僅有一篇關(guān)于尋常型天皰瘡的全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究，該研究對猶太人群中的100例尋常型銀屑病患者及397例健康對照進(jìn)行分析(Sarig et al.,2012)。然而，該研究除在HLAII類分子區(qū)域發(fā)現(xiàn)有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)信號外，并沒有發(fā)現(xiàn)任何遺傳風(fēng)險因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何篩查落葉型天皰瘡患者與檢測落葉型天皰瘡易感性。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了下述任一用途：

A1)檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備篩查落葉型天皰瘡患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；

A2)檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備檢測落葉型天皰瘡易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用；

A3)檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備檢測與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

A4)檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在制備鑒定或輔助鑒定與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

B1)人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在制備篩查落葉型天皰瘡患者產(chǎn)品中的應(yīng)用；

B2)人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在制備檢測落葉型天皰瘡易感性產(chǎn)品中的應(yīng)用；

B3)檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在篩查落葉型天皰瘡患者中的應(yīng)用；

B4)檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在檢測落葉型天皰瘡易感性中的應(yīng)用；

B5)檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在檢測與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的中的應(yīng)用；

B6)檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的中的應(yīng)用；

B7)人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在篩查落葉型天皰瘡患者中的應(yīng)用；

B8)人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型在檢測落葉型天皰瘡易感性中的應(yīng)用。

rs2178077是人染色體12q24.33上的一個二等位多態(tài)性的SNP位點，該變異是轉(zhuǎn)換(A/G，在其互補(bǔ)鏈上則為T/C)。所述rs2178077基因型是AA、AG或GG。所述AA是rs2178077位點為A的純合型，所述GG是rs2178077位點為G的純合型，所述AG是rs2178077位點為A和G的雜合型。所述檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型具體可為檢測rs2178077的核苷酸種類。

上述用途中，所述檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為擴(kuò)增包括rs2178077在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物和/或單堿基延伸引物。所述產(chǎn)品可包括所述PCR引物和/或所述單堿基延伸引物。

上述用途中，所述AA和所述AG基因型的個體在落葉型天皰瘡患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型在正常人群體中的比例，所述AA和所述AG基因型的個體在落葉型天皰瘡患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型在尋常型天皰瘡群體中的比例。

上述用途中，所述落葉型天皰瘡具體可為中國人群落葉型天皰瘡。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了含有檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的含有檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)的產(chǎn)品，為a)-d)中的任一種產(chǎn)品：

a)檢測與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的產(chǎn)品；

b)鑒定或輔助鑒定與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的產(chǎn)品；

c)篩查落葉型天皰瘡患者產(chǎn)品；

d)檢測落葉型天皰瘡易感性產(chǎn)品。

上述產(chǎn)品中，所述檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為擴(kuò)增包括rs2178077在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物和/或單堿基延伸引物。

上述產(chǎn)品中，所述落葉型天皰瘡具體可為中國人群落葉型天皰瘡。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述M1)或M2)的方法：

M1)篩查落葉型天皰瘡患者的方法，包括：檢測待測對象基因組中rs2178077位點的基因型，如rs2178077位點的基因型為AA基因型，所述待測對象為或候選為落葉型天皰瘡患者；如rs2178077位點的基因型為AG基因型，所述待測對象為或候選為落葉型天皰瘡患者；如rs2178077位點的基因型為GG基因型，所述待測對象為或候選為或非落葉型天皰瘡患者；

M2)檢測落葉型天皰瘡易感性的方法，包括：檢測待測對象基因組中rs2178077位點的基因型，如rs2178077位點的基因型為AA基因型，所述待測對象易感或候選易感落葉型天皰瘡；如rs2178077位點的基因型為AG基因型，所述待測對象易感或候選易感落葉型天皰瘡；如rs2178077位點的基因型為GG基因型，所述待測對象不易感或候選不易感落葉型天皰瘡。

上述方法中，檢測待測對象基因組中rs2178077位點的基因型可采用所述檢測rs2178077的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)進(jìn)行。

上述方法中，所述落葉型天皰瘡具體可為中國人群落葉型天皰瘡。

實驗證明，rs2178077的風(fēng)險等位基因為A，該等位基因在落葉型天皰瘡患者群體中的比例比該等位基因在正常健康人群中的比例高103.25％，比該等位基因在尋常型天皰瘡患者中的基因頻率增加了99.25％，比正常對照和尋常型天皰瘡患者群體中的基因頻率增加了102.93％。rs2178077的P值是1.57×10^-9，且rs2178077的相對危險度是3.03，說明rs2178077是與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性。rs2178077的三個基因型中，AA基因型的個體和AG基因型的個體在落葉型天皰瘡患者群體中的比例分別高于對應(yīng)的基因型的個體在正常人群體和/或?qū)こＰ吞彀挴徎颊呷后w中的比例，GG基因型的個體在落葉型天皰瘡患者群體中的比例低于該基因型的個體在正常人群體和/或?qū)こＰ吞彀挴徎颊呷后w中的比例。

本發(fā)明在實際應(yīng)用中，可將檢測rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測其它的與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查落葉型天皰瘡患者的產(chǎn)品。

其中，檢測人基因組中rs2178077的多態(tài)性或基因型的物質(zhì)可為通過下述至少一種方法確定rs2178077的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器：DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性高效液相色譜、SNP芯片、TaqMan探針技術(shù)和Sequenom MassArray技術(shù)。其中，利用Sequenom MassArray技術(shù)確定rs2178077的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括PCR引物對、基于單堿基延伸反應(yīng)的延伸引物、磷酸酶、樹脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜)和/或Sequenom MassArray技術(shù)所需要的其他試劑和儀器；利用TaqMan探針技術(shù)確定rs2178077的多態(tài)性或基因型所需的試劑和/或儀器包括TaqMan探針、PCR引物對、定量PCR儀、進(jìn)行基因分型的模塊和/或TaqMan探針技術(shù)所需要的其他試劑；SNP芯片包括基于核酸雜交反應(yīng)的芯片、基于單堿基延伸反應(yīng)的芯片、基于等位基因特異性引物延伸反應(yīng)的芯片、基于“一步法”反應(yīng)的芯片、基于引物連接反應(yīng)的芯片、基于限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的芯片、基于蛋白DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片和/或基于熒光分子DNA結(jié)合反應(yīng)的芯片。在本發(fā)明的一個實施例中，利用的是Illumina公司的Infinium Human Exome BeadChip芯片。

所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒，還可為由試劑或試劑盒和儀器組成的系統(tǒng)，如由引物和DNA測序儀組成的系統(tǒng)，由PCR試劑和DNA測序試劑和DNA測序儀組成的系統(tǒng)，由TaqMan探針、PCR引物對、定量PCR儀和進(jìn)行基因分型的模塊以及TaqMan探針技術(shù)所需要的其他試劑組成的系統(tǒng)，由探針、PCR引物對以及連接酶檢測反應(yīng)(LDR)所需要的其他試劑和儀器組成的系統(tǒng)，由PCR引物對、單堿基延伸引物、芯片、PCR儀、進(jìn)行基因分型的模塊和/或Sequenom MassArray技術(shù)所需要的其他試劑和儀器組成的系統(tǒng)。

采用PCR引物擴(kuò)增包括rs2178077在內(nèi)的基因組DNA片段，以得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用單堿基延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，對得到的延伸產(chǎn)物的序列進(jìn)行檢測，確定rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)和基因型。所述PCR引物在序列上沒有特殊要求，只要能擴(kuò)增出包括rs2178077在內(nèi)的基因組DNA片段即可。所述延伸引物可根據(jù)人基因組中rs2178077上游(不包括該SNP位點)設(shè)計，所述延伸引物的最后1位核苷酸對應(yīng)于人基因組中rs2178077的前1位核苷酸。所述延伸引物也可根據(jù)人基因組中rs2178077下游(不包括該SNP位點)設(shè)計，所述延伸引物的第1位核苷酸對應(yīng)于人基因組中rs2178077的后1位核苷酸。

本發(fā)明中，所述PCR引物可由rs2178077_W1_F和rs2178077_W1_R組成；

所述rs2178077_W1_F是如下a1)至a4)中的任一種單鏈DNA：

a1)序列表中序列1所示的單鏈DNA；

a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA；

a3)與a1)或a2)限定的單鏈DNA具有85％以上的同一性的單鏈DNA；

a4)在嚴(yán)格條件下與a1)或a2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA；

所述rs2178077_W1_R是如下b1)至b4)中的任一種單鏈DNA：

b1)序列表中序列2所示的單鏈DNA；

b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA；

b3)與b1)或b2)限定的單鏈DNA具有85％以上的同一性的單鏈DNA；

b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA。

所述單堿基延伸引物(rs2178077_W1_E)可為如下c1)至c4)中的任一種單鏈DNA：

c1)序列表中序列3所示的單鏈DNA；

c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA；

c3)與c1)或c2)限定的單鏈DNA具有85％以上的同一性的單鏈DNA；

c4)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)限定的單鏈DNA雜交的單鏈DNA。

a2)所述在a1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA為在序列1所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個核苷酸得到的單鏈DNA。b2)所述在b1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA為在序列2所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個核苷酸得到的單鏈DNA。c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一個或幾個核苷酸得到的單鏈DNA為在序列3所示的單鏈DNA的5′端和/或3′端添加一至十個核苷酸得到的單鏈DNA。

這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的序列1、序列2或序列3所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機(jī)軟件進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。

所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

上述85％以上同一性，可為85％、90％或95％以上的同一性。

所述探針1和所述探針2均可由熒光物質(zhì)標(biāo)記。所述探針1可為在序列表中序列6所示的單鏈DNA的5’端標(biāo)記報告熒光染料FAM、在3’端標(biāo)記淬滅熒光染料NFQ得到的TaqMan探針。所述探針2可為在序列7所示的單鏈DNA的5’端標(biāo)記報告熒光染料VIC、在3’端標(biāo)記淬滅熒光染料NFQ得到的TaqMan探針。

本發(fā)明在一個來自中國人群的樣本(落葉型天皰瘡患者群體、尋常型天皰瘡患者群體和健康群體)中發(fā)現(xiàn)rs2178077是與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性，并且rs2178077的單核苷酸多態(tài)性與尋常型天皰瘡無關(guān)?？蓪z測rs2178077的多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì)與其它物質(zhì)(如檢測其它的與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(即等位基因)或基因型的物質(zhì))聯(lián)合在一起制備篩查落葉型天皰瘡患者的產(chǎn)品。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、rs2178077和rs3888722是與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性

研究對象

全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)階段的研究對象包括166例天皰瘡患者(尋常型天皰瘡(PV)101例，落葉型天皰瘡(PF)65例)和885例正常對照(CK)。在SNP驗證階段中的研究對象為156例天皰瘡患者(PV 86例，PF 70例)和996例正常對照(CK)。聯(lián)合分析研究對象為369例天皰瘡患者(PV 210例，PF 159例)和2493例正常對照(CK)。所有研究對象均來自于中國人群。

所有天皰瘡患者的診斷符合以下4條：1)臨床特點：紅斑基礎(chǔ)上的水皰、大皰，尼式征陰性；2)具有典型的尋常型天皰瘡或落葉型天皰瘡病史；3)免疫學(xué)檢查包括皮膚活檢組織的直接免疫熒光與血漿樣本的間接免疫熒光證實其為尋常型天皰瘡或落葉型天皰瘡患者；4)ELISA分析證實其為尋常型天皰瘡或落葉型天皰瘡患者。

所有正常對照都被臨床證實無天皰瘡(包括尋常型天皰瘡和落葉型天皰瘡)病史且無天皰瘡的家族史，并均沒有自身免疫性疾病。

所有患者和對照的特點見表1。年齡分布及性別比例在PV群體、PF群體及對照群體中均無顯著差異。

表1、發(fā)現(xiàn)階段與驗證階段的樣本

本研究經(jīng)山東省皮膚病性病防治研究所倫理審查委員會批準(zhǔn)。所有研究對象都已簽署知情同意書。

樣本為每位患者的大約2ml全血，提取基因組DNA用于基因型分析。

發(fā)現(xiàn)階段(第一階段)

對發(fā)現(xiàn)階段的101例PV、65例PF和885例正常對照應(yīng)用涵蓋900015個SNPs的Illumina Omni Zhonghua芯片進(jìn)行基因分型。在進(jìn)一步分析時排除了總體基因分型率<96％或雜合體率超過平均值±3S.D.的樣本(18例對象)；通過繼承等同分析(IBD)(PI_HAT>0.25)確定的9例可能的重復(fù)樣本或親戚樣本也被排除。滿足下列條件的SNPs也被排除：(i)沒有映射到常染色體；(ii)call rate<90％；(iii)MAF<0.01；(iv)對照中SNP的基因型分布與Hardy-Weinberg平衡的預(yù)測值(P<10^-5)相偏離。在對樣本和SNP進(jìn)行質(zhì)量過濾后，得到了包含101例PV，65例PF病例及844例對照中的43826個常見獨立的SNPs(r2<0.1)的數(shù)據(jù)集，將這些數(shù)據(jù)以及來自YRI(來自尼日利亞，伊巴丹的約魯巴人；n＝90)，CEU(來自北歐和西歐的猶太人；n＝90)，CHB(n＝45)和JPT(n＝44)的HapMap樣本一起進(jìn)行PCA分析，排除了14個異常的樣本。我們對剩余的病例和對照樣本進(jìn)行了另一輪PCA，結(jié)果顯示病例和對照都匹配很好。經(jīng)過質(zhì)量控制階段，一共有101例PV，65例PF和844例對照的806342個SNPs被納入到全基因組SNP推算。對于那些基于千人組計劃的基準(zhǔn)(2012年3月發(fā)布)而未分型的SNPs，我們應(yīng)用Shapeit(Delaneau et al.,2013)和IMPUTE_v2(Howie et al., 2009)來定相和推算。低推算置信度(INFO score<0.8)，顯著的Hardy-Weinberg連鎖不平衡(P<10^-5)或MAF<5％的SNPs被排除于進(jìn)一步的分析之外。最終，在GWAS發(fā)現(xiàn)階段一共有101例PV病例，65例PF病例和844例對照中的5546030個SNPs被分型和推算。

SNP驗證階段(第二階段)

發(fā)明人選取了82個SNPs按以下1)或2)的標(biāo)準(zhǔn)：1)在PV關(guān)聯(lián)分析中P<10^-4；或2)在PF關(guān)聯(lián)分析中P<10^-4，在另一獨立樣本中選擇56例PV患者，49例PF患者和996例正常對照的獨立樣本中進(jìn)行驗證。在82個SNPs中，一共有71個SNPs被成功分型，call rate>90％且無顯著HWE偏離(P>0.0003)。

其中rs2178077SNP分型的引物序列如下：

rs2178077_W1_F(正向引物)：ACGTTGGATGTAACAACCGAGGATTACTGC(序列1)

rs2178077_W1_R(反向引物)：ACGTTGGATGATCTCAGCAGTGATGTTGCC(序列2)

rs2178077_W1_E(延伸引物)：TGCCTCCGATGAGCAC(序列3)

rs2178077SNP分型的具體操作步驟如下：

采用Sequenom MassArray(San Diego，USA)平臺驗證，每個樣本約用到15ngDNA。首先提取外周血的基因組DNA，標(biāo)準(zhǔn)化后，樣本DNA經(jīng)多重PCR反應(yīng)擴(kuò)增包括SNP位點在內(nèi)的基因組DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SNP位點特異性單一鏈的延伸，延伸產(chǎn)物脫鹽并轉(zhuǎn)移到384孔的芯片上。質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS)進(jìn)行等位基因的檢測，采用Sequenom Mass ARRAY分型軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

1、全血標(biāo)本采集

在患者知情同意，并簽署書面同意書的情況下采集研究對象外周靜脈血5ml，放置于EDTANa₂抗凝管中，置-80℃冰柜儲存?zhèn)溆谩?/p>

2、DNA濃度標(biāo)準(zhǔn)化包括如下步驟：

1)利用NanoDrop-1000濃度測試儀準(zhǔn)確測定每一份需要標(biāo)準(zhǔn)化的樣本DNA濃度和OD比值(A260/A280、A260/A230)。

2)建立電子表格，排定每個樣本孔需要加入的DNA編號。

進(jìn)行Sequenom MassArray分型的樣本，在每96孔板上留有空白對照和重復(fù)樣本對照。

3)按照電子表格的順序，加入已測定濃度的DNA。

對于進(jìn)行Sequenom MassArray分型的樣本要求實驗濃度為12-30ng/μl，一般以18ng/μl為佳。并且A260/A280比值介于1.5-2.0之間、A260/230介于1.5-2.3，如DNA濃度高于18ng/μl則加入適量FG3，將濃度標(biāo)化至18ng/μl；如DNA濃度低于12ng/μl，則重新從血液提取合格的DNA。濃度在12—18ng/μl間直接加入。

離心后貼上粘性錫箔紙，并用標(biāo)記筆標(biāo)上樣本板標(biāo)號、樣本類型、來源地等信息。

4)在平板離心機(jī)上，3000g離心3分鐘，存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3、利用正向引物和反向引物進(jìn)行多重PCR。

4、SNP位點特異性單一鏈的延伸反應(yīng)

其中，延伸引物根據(jù)人基因組中SNP位點上游(不包括該SNP位點)設(shè)計，所述延伸引物的最后1位核苷酸對應(yīng)于人基因組中該SNP位點的前1位核苷酸。

5、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

1)對分型的SNP進(jìn)行call rate計算，去除call rate<95％的SNP或等位基因頻率<0.01的SNPs；

2)對SNP進(jìn)行遺傳平衡檢驗，去除偏離遺傳平衡定律的SNP(對照樣本中Hardy-Weinberg平衡檢驗的P≦0.001)。

3)在Sequenom MassArray系統(tǒng)中查看SNP的分型聚類圖，去除聚類圖分堆不清的SNP。

4)樣本質(zhì)控：直接去除分型失敗的樣本。

將通過質(zhì)控的樣本和SNP進(jìn)行統(tǒng)計分析。

6、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Plink 1.07軟件對分型成功并通過質(zhì)控的SNP在病例組和對照組做基因表型相關(guān)性分析，用Cochran-Armitage trend檢驗每個樣本的基因型和表型的關(guān)聯(lián)性，然后用Cochran-Mantel-Haenszel綜合分析所有樣本的基因型和表型的相關(guān)性。用Q檢驗來評價個體間的異質(zhì)性，本次實驗中，以p<0.05作為檢驗水準(zhǔn)。多重logistic回歸分析用于檢測區(qū)域內(nèi)的信號的獨立性。檢驗水準(zhǔn)α以0.05除以通過質(zhì)量控制的SNP數(shù)目為檢驗水準(zhǔn)。Q檢驗用于評估遺傳異質(zhì)性的顯著性，對SNP校正檢測后P值小于0.05者視為有顯著遺傳異質(zhì)性。

經(jīng)過對MHC突變的分析，發(fā)明人選取了1個MHC區(qū)域內(nèi)的獨立的SNP(rs3888722)應(yīng)用Taqman Allelic Discrimination Assay(Applied Biosystems)在新招募的一批樣本與部分驗證階段的研究對象(共148例病例(80例PV，68例PF)和759例正常對照，年齡分布及性別比例在PV群體、PF群體及對照群體中均無顯著差異)中進(jìn)行驗證，新招募的研究對象也均符合上文中的標(biāo)準(zhǔn)。這個SNP被成功分型，call rate>90％且無顯著HWE偏離(P>0.025)。

利用7900HT/Taqman基因分型系統(tǒng)Taqman Allelic Discrimination Assay(Applied Biosystems)對rs3888722進(jìn)行分型：

引物及探針序列為：

正向引物rs3888722-F：TGTGGTTAAGCATTCTATCGAATCA(序列4)

反向引物rs3888722-R：TGTCATCCACAGCAGAGACATG(序列5)

探針1rs3888722-P1：AGGAACACTAAAAGTT(序列6)，5′端由報告熒光染料FAM標(biāo)記，3′端由淬滅熒光染料NFQ標(biāo)記

探針2rs3888722-P2：AACACTAAAACTTGCTTCT(序列7)，5′端由報告熒光染料VIC標(biāo)記，3′端由淬滅熒光染料NFQ標(biāo)記

操作步驟如下：

分別抽取每個對象的外周靜脈血5ml，提取基因組DNA，分別基因組DNA(DNA濃度均在50-100ng/微升之間)。

實時熒光定量PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為：基因組DNA 1μL、2×TaqMan GT master mix(Life technology公司)2.5μL、20×TaqMan探針混合物0.65μL、去離子水0.85μL。將上述反應(yīng)體系加入96孔PCR板中，采用ABI 7900實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃變性30秒，60℃退火1分鐘，40個循環(huán)。

上述反應(yīng)體系中，20×TaqMan探針混合物包括擴(kuò)增包括rs3888722在內(nèi)的基因組DNA片段的PCR引物對和成套探針，其中PCR引物對由上述正向引物和反向引物組成，成套探針由探針1和探針2組成。

反應(yīng)結(jié)束后，采用7900System SDS software進(jìn)行基因型分型，確定研究位點的基因型。

在排除分型失敗樣本外，在共計157例尋常型天皰瘡(PV)患者、114例落葉型天皰瘡(PF)患者和1840例正常對照中聯(lián)合分析rs2178077與天皰瘡的相關(guān)性(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs2178077是與落葉型天皰瘡相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性，rs2178077的P值是1.57×10^-9，rs2178077的相對危險度是3.03。該SNP天皰瘡(PV和PF)患者和正常對照中的基因型頻率如表3所示。結(jié)果表明：rs2178077的三個基因型中，AG基因型的個體在PF患者群體中的比例分別高于該基因型的個體在正常人群體和PV患者群體中的比例，AA基因型的個體在PF患者群體中的比例分別高于該基因型的個體在正常人群體和PV患者群體中的比例，GG基因型的個體在PF患者群體中的比例分別低于該基因型的個體在正常人群體和PV患者群體中的比例。

在排除分型失敗樣本外，在共計167例尋常型天皰瘡(PV)患者、125例落葉型天皰瘡(PF)患者和1675例正常對照中聯(lián)合分析rs3888722與天皰瘡的相關(guān)性(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于MHC區(qū)域內(nèi)的rs3888722是與落葉型天皰瘡相關(guān)的風(fēng)險位點；

rs3888722的P值是6.73×10^-9，OR值為2.74。該SNP天皰瘡(PV和PF)患者和正常對照中的基因型頻率如表3所示。結(jié)果表明：rs3888722的三個基因型中，GC基因型的個體在PF患者群體中的比例分別高于該基因型的個體在正常人群體和PV患者群體中的比例，GG基因型的個體在PF患者群體中的比例分別高于該基因型的個體在正常人群體和PV患者群體中的比例，CC基因型的個體在PF患者群體中的比例分別低于該基因型的個體在正常人群體和PV患者群體中的比例。

表2、PV患者、PF患者和正常對照群體中各基因型的個體數(shù)及基因型頻率

注：rs2178077的基因型中，A1*A1表示AA，A1*A2表示AG，A2*A2表示GG；

rs3888722的基因型中，A1*A1表示GG，A1*A2表示GC，A2*A2表示CC。

表3、rs2178077在PV患者、PF患者和正常對照群體中的等位基因頻率

表4、rs3888722在PV患者、PF患者和正常對照群體中的等位基因頻率

利用二分類的logistic回歸模型(log-additive模型)計算PV患者群體、PF患者群體和正常人群體中基因頻率差異性P值，確定SNP有無顯著性意義，其中基因型采用可加模型進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs2178077和rs3888722的各等位基因的基因頻率在正常人群體和PF患者群體中均有顯著性差異，而在正常人群體和PV患者群體中均無顯著性差異。

由表3可知，rs2178077的風(fēng)險等位基因為A，與正常對照相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了103.25％，與PV患者群體相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了99.25％，與正常對照和PV患者群體相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了102.93％。

由表4可知，rs3888722的風(fēng)險等位基因為G，與正常對照相比該等位基因的基因頻率在PF患者中增加了147.32％，與PV患者群體相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了46.96％，與正常對照和PV患者群體相比該等位基因在PF患者中的基因頻率增加了132.90％。

實驗結(jié)果表明，rs2178077和rs3888722的多態(tài)性或基因型或等位基因頻率可用于PF患者的篩查。

<110> 山東省皮膚病性病防治研究所

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<170> PatentIn version 3.5

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