本發(fā)明涉及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究領(lǐng)域，尤其涉及用于研究高原缺氧情況下藥物吸收的細(xì)胞模型的建立方法。
背景技術(shù)：
我國高原國土總面積居世界之首，擁有數(shù)量眾多的高原常住人口及移居人口，此外，每年因旅游、工作、軍事任務(wù)等原因由平原地區(qū)進(jìn)入高原地區(qū)的人數(shù)超過1000萬人次。隨著高原人群的日益增加，高原用藥安全問題已成為高原人群健康的潛在威脅。
高原低氧使機(jī)體產(chǎn)生一系列生理性變化，部分為病理性變化，這些變化影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄，導(dǎo)致藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生改變。然而，目前藥物的用法用量并未考慮高原的特殊性，為高原用藥安全埋下隱患。
目前，對于高原藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究方式主要集中于大鼠、家兔等哺乳動(dòng)物的高原實(shí)地試驗(yàn)及模擬艙實(shí)驗(yàn)。張娟紅等利用大鼠急進(jìn)4010米高原實(shí)地試驗(yàn)證明，普萘洛爾的藥-時(shí)曲線下面積（AUC）、平均駐留時(shí)間（MRT）、半衰期（t1/2）、峰濃度（Cmax）均顯著增大，CL、表觀分布容積 (Vd) 均顯著降低；Kerdi等以低壓氧艙模擬高原低氧環(huán)境研究代家兔謝酶，發(fā)現(xiàn)急性缺氧48h后P450酶的活性與表達(dá)發(fā)生顯著變化。也有少數(shù)的人體試驗(yàn)，李向陽等發(fā)現(xiàn)磺胺甲噁唑在急進(jìn)和久居3800m高原健康志愿者體內(nèi)的吸收和代謝發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為CL降低、t1/2延長。高原實(shí)地試驗(yàn)耗費(fèi)大量人力物力，模擬艙試驗(yàn)則需要昂貴的大型儀器，而目前并沒有明確的研究高原藥物代謝動(dòng)力學(xué)的體外研究方法。
Caco-2細(xì)胞模型于20世紀(jì)70年代首次分離自人類結(jié)腸癌細(xì)胞，培養(yǎng)成熟的Caco-2細(xì)胞可形成與人體小腸上皮細(xì)胞相同的細(xì)胞極性和致密的單層組織，形態(tài)及功能與人體小腸上皮細(xì)胞極為相似，已被廣泛應(yīng)用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，成為藥物口服吸收的體外篩選模型。然而，目前并無利用Caco-2模型研究高原缺氧情況下藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單易行、經(jīng)濟(jì)科學(xué)的用于研究高原缺氧情況下藥物吸收的細(xì)胞模型的建立方法。
為解決上述問題，本發(fā)明所述的用于研究高原缺氧情況下藥物吸收的細(xì)胞模型的建立方法，包括以下步驟：
⑴將Caco-2細(xì)胞采用高糖DMEM培養(yǎng)液于體積濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，至下一次傳代；
⑵采用所述步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞于12孔板Transwell小室的濾膜上構(gòu)建Caco-2細(xì)胞單層模型；
⑶棄去所述Transwell小室中的培養(yǎng)基，采用HBSS洗所述Caco-2細(xì)胞單層模型2~4次；
⑷測定所述步驟⑶所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω時(shí)，則為合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型；
⑸對所述合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型進(jìn)行缺氧培養(yǎng)12~48h；
⑹棄去所述Transwell小室中的HBSS，加入新的HBSS，置37℃水平遙床上，對所述步驟⑸經(jīng)缺氧培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞單層模型以50rpm的速度洗30~60min；
⑺測定所述步驟⑹所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值、熒光黃表觀滲透系數(shù)，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω、熒光黃表觀滲透系數(shù)小于1×10-6cm/s時(shí)即可完成模型評價(jià)。
所述步驟⑴中Caco-2細(xì)胞為第40~50代之間的細(xì)胞。
所述步驟⑴中高糖DMEM培養(yǎng)液是指將胎牛血清100mL、100×非必需氨基酸10mL、HEPES 5.96g、M L-谷氨酰胺0.06g、青霉素80000單位、鏈霉素100mg溶于890mL DMEM高糖培養(yǎng)基中所得的培養(yǎng)液。
所述步驟⑴中培養(yǎng)條件是指溫度為36.5~37.5℃，濕度為85~95%。
所述步驟⑵中Caco-2細(xì)胞單層模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖DMEM培養(yǎng)液將所述步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞制成2×106個(gè)/mL的懸液；然后按1×105個(gè)/cm2接種Caco-2細(xì)胞于所述12孔板Transwell小室的濾膜上，培養(yǎng)21~28天即得；其中接種8~16h后換液，前2周隔天換液，之后每天換液。
所述步驟⑶和所述步驟⑹中HBSS均是指將葡萄糖4.5g、HEPES 5.96g溶于1mL hank’s液，并用質(zhì)量濃度為4%的HCl溶液或質(zhì)量濃度為4%的NaOH溶液調(diào)整pH值至7.2~7.4的溶液。
所述步驟⑸中缺氧培養(yǎng)是指將所述合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型放入體積濃度為1~5%O2且體積濃度為5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~48h。
所述步驟⑺熒光黃表觀滲透系數(shù)的測定方法是指首先棄去蕩洗30~60min的Transwell小室內(nèi)外的HBSS；然后將Transwell小室放入新的12孔板中，且小室內(nèi)側(cè)加入1mg/mL熒光黃溶液0.5mL，外部加入1.5mL HBSS；最后，于37℃以50rpm速率水平回旋震搖，2h后使用酶標(biāo)儀測定外部HBSS在460nm處吸收值，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出熒光黃含量，按下式計(jì)算表觀滲透系數(shù)：Paap=C·V/（T·A·C0）
其中：Papp為熒光黃表觀滲透系數(shù)；C為測得熒光黃濃度，單位%；V為接收池體積，單位cm3；T為轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，單位s；A為Transwell濾膜面積，單位cm2；C0為供給池起始濃度，單位%。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明以Caco-2模型為基礎(chǔ)，通過缺氧培養(yǎng)，建立了適用于研究高原缺氧對藥物腸吸收影響的體外藥物代謝動(dòng)力學(xué)細(xì)胞模型，操作簡單，經(jīng)濟(jì)科學(xué)，可實(shí)現(xiàn)高通量測定，對高原人群個(gè)體化用藥，合理用藥具有較大的促進(jìn)作用。
附圖說明
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
圖1為本發(fā)明的原理圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 用于研究高原缺氧情況下藥物吸收的細(xì)胞模型的建立方法，包括以下步驟：
⑴將Caco-2細(xì)胞采用高糖DMEM培養(yǎng)液于溫度為37℃、濕度為90%、體積濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，至下一次傳代。
其中：Caco-2細(xì)胞為第40~50代之間的細(xì)胞。
高糖DMEM培養(yǎng)液是指將胎牛血清100mL、100×非必需氨基酸10mL、HEPES 5.96g、M L-谷氨酰胺0.06g、青霉素80000單位、鏈霉素100mg溶于890mL DMEM高糖培養(yǎng)基中所得的培養(yǎng)液。
⑵采用步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞于12孔板Transwell小室的濾膜上構(gòu)建Caco-2細(xì)胞單層模型。
其中：Caco-2細(xì)胞單層模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖DMEM培養(yǎng)液將步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞制成2×106個(gè)/mL的懸液；然后按1×105個(gè)/cm2接種Caco-2細(xì)胞于12孔板Transwell小室的濾膜上，共接種8個(gè)孔；培養(yǎng)21天即得；其中接種8h后換液，前2周隔天換液，之后每天換液。
⑶棄去Transwell小室中的培養(yǎng)基，采用HBSS洗Caco-2細(xì)胞單層模型2次。
其中：HBSS均是指將葡萄糖4.5g、HEPES 5.96g溶于1mL hank’s液，并用質(zhì)量濃度為4%的HCl溶液或質(zhì)量濃度為4%的NaOH溶液調(diào)整pH值至7.2~7.4的溶液。
⑷測定步驟⑶所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω時(shí)，則為合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型。
⑸對合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型進(jìn)行缺氧培養(yǎng)12h，即將合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型放入體積濃度為2%O2且體積濃度為5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。
⑹棄去Transwell小室中的HBSS，加入新的HBSS，置37℃水平遙床上，對步驟⑸經(jīng)缺氧培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞單層模型以50rpm的速度洗30min。
其中HBSS同步驟⑶。
⑺測定步驟⑹所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值、熒光黃表觀滲透系數(shù)，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω、熒光黃表觀滲透系數(shù)小于1×10-6cm/s時(shí)即可完成模型評價(jià)。
熒光黃表觀滲透系數(shù)的測定方法是指首先棄去蕩洗30~60min的Transwell小室內(nèi)外的HBSS；然后將Transwell小室放入新的12孔板中，且小室內(nèi)側(cè)加入1mg/mL熒光黃溶液0.5mL，外部加入1.5mL HBSS；最后，于37℃以50rpm速率水平回旋震搖，2h后使用酶標(biāo)儀測定外部HBSS在460nm處吸收值，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出熒光黃含量，按下式計(jì)算表觀滲透系數(shù)：Paap=C·V/（T·A·C0）
其中：Papp為熒光黃表觀滲透系數(shù)；C為測得熒光黃濃度，單位%；V為接收池體積，單位cm3；T為轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，單位s；A為Transwell濾膜面積，單位cm2；C0為供給池起始濃度，單位%。
實(shí)施例2 用于研究高原缺氧情況下藥物吸收的細(xì)胞模型的建立方法，包括以下步驟：
⑴將Caco-2細(xì)胞采用高糖DMEM培養(yǎng)液于溫度為36.5℃、濕度為85%、體積濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，至下一次傳代。
其中Caco-2細(xì)胞、高糖DMEM培養(yǎng)液同實(shí)施例1。
⑵采用步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞于12孔板Transwell小室的濾膜上構(gòu)建Caco-2細(xì)胞單層模型。
其中：Caco-2細(xì)胞單層模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖DMEM培養(yǎng)液將步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞制成2×106個(gè)/mL的懸液；然后按1×105個(gè)/cm2接種Caco-2細(xì)胞于12孔板Transwell小室的濾膜上，共接種12個(gè)孔；培養(yǎng)23天即得；其中接種12h后換液，前2周隔天換液，之后每天換液。
⑶棄去Transwell小室中的培養(yǎng)基，采用HBSS洗Caco-2細(xì)胞單層模型3次。
其中HBSS同實(shí)施例1。
⑷測定步驟⑶所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω時(shí)，則為合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型。
⑸對合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型進(jìn)行缺氧培養(yǎng)24h，即將合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型放入體積濃度為2%O2且體積濃度為5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
⑹棄去Transwell小室中的HBSS，加入新的HBSS，置37℃水平遙床上，對步驟⑸經(jīng)缺氧培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞單層模型以50rpm的速度洗40min。
其中HBSS同步驟⑶。
⑺測定步驟⑹所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值、熒光黃表觀滲透系數(shù)，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω、熒光黃表觀滲透系數(shù)小于1×10-6cm/s時(shí)即可完成模型評價(jià)。
其中熒光黃表觀滲透系數(shù)的測定方法同實(shí)施例1。
實(shí)施例3 用于研究高原缺氧情況下藥物吸收的細(xì)胞模型的建立方法，包括以下步驟：
⑴將Caco-2細(xì)胞采用高糖DMEM培養(yǎng)液于溫度為37.5℃、濕度為95%、體積濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，至下一次傳代。
其中Caco-2細(xì)胞、高糖DMEM培養(yǎng)液同實(shí)施例1。
⑵采用步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞于12孔板Transwell小室的濾膜上構(gòu)建Caco-2細(xì)胞單層模型。
其中：Caco-2細(xì)胞單層模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖DMEM培養(yǎng)液將步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞制成2×106個(gè)/mL的懸液；然后按1×105個(gè)/cm2接種Caco-2細(xì)胞于12孔板Transwell小室的濾膜上，共接種6個(gè)孔；培養(yǎng)25天即得；其中接種16h后換液，前2周隔天換液，之后每天換液。
⑶棄去Transwell小室中的培養(yǎng)基，采用HBSS洗Caco-2細(xì)胞單層模型4次。
其中HBSS同實(shí)施例1。
⑷測定步驟⑶所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω時(shí)，則為合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型。
⑸對合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型進(jìn)行缺氧培養(yǎng)48h，即將合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型放入體積濃度為1%O2且體積濃度為5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
⑹棄去Transwell小室中的HBSS，加入新的HBSS，置37℃水平遙床上，對步驟⑸經(jīng)缺氧培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞單層模型以50rpm的速度洗50min。
其中HBSS同步驟⑶。
⑺測定步驟⑹所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值、熒光黃表觀滲透系數(shù)，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω、熒光黃表觀滲透系數(shù)小于1×10-6cm/s時(shí)即可完成模型評價(jià)。
其中熒光黃表觀滲透系數(shù)的測定方法同實(shí)施例1。
實(shí)施例4 用于研究高原缺氧情況下藥物吸收的細(xì)胞模型的建立方法，包括以下步驟：
⑴將Caco-2細(xì)胞采用高糖DMEM培養(yǎng)液于溫度為37℃、濕度為90%、體積濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，至下一次傳代。
其中Caco-2細(xì)胞、高糖DMEM培養(yǎng)液同實(shí)施例1。
⑵采用步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞于12孔板Transwell小室的濾膜上構(gòu)建Caco-2細(xì)胞單層模型。
其中：Caco-2細(xì)胞單層模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖DMEM培養(yǎng)液將步驟⑴所得的Caco-2細(xì)胞制成2×106個(gè)/mL的懸液；然后按1×105個(gè)/cm2接種Caco-2細(xì)胞于12孔板Transwell小室的濾膜上，共接種6個(gè)孔；培養(yǎng)28天即得；其中接種14h后換液，前2周隔天換液，之后每天換液。
⑶棄去Transwell小室中的培養(yǎng)基，采用HBSS洗Caco-2細(xì)胞單層模型2次。
其中HBSS同實(shí)施例1。
⑷測定步驟⑶所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω時(shí)，則為合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型。
⑸對合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型進(jìn)行缺氧培養(yǎng)36h，即將合格的細(xì)胞Caco-2細(xì)胞單層模型放入體積濃度為5%O2且體積濃度為5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h。
⑹棄去Transwell小室中的HBSS，加入新的HBSS，置37℃水平遙床上，對步驟⑸經(jīng)缺氧培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞單層模型以50rpm的速度洗60min。
其中HBSS同步驟⑶。
⑺測定步驟⑹所得的Caco-2細(xì)胞單層模型的跨膜電阻值、熒光黃表觀滲透系數(shù)，當(dāng)跨膜電阻值大于400Ω、熒光黃表觀滲透系數(shù)小于1×10-6cm/s時(shí)即可完成模型評價(jià)。
其中熒光黃表觀滲透系數(shù)的測定方法同實(shí)施例1。