本發(fā)明涉及一種高純度Nisin的制備方法，具體涉及一種膜技術(shù)結(jié)合結(jié)晶法分離制備高純Nisin的方法。(二)
背景技術(shù)：
：乳鏈菌肽(Nisin)亦稱乳酸鏈球菌素，是某些乳酸鏈球菌(現(xiàn)稱乳酸乳球菌)產(chǎn)生的一種小肽。若在食品中加入十萬分之幾到萬分之幾這種物質(zhì)，就足以抑制引起食物腐敗的許多革蘭氏陽性菌的生長和繁殖，是一種高效、無毒的天然食品防腐劑。它是用蛋白質(zhì)原料經(jīng)過發(fā)酵生物合成的由34個氨基酸組成的小肽。乳鏈菌肽對革蘭氏陽性菌，包括葡萄球菌、鏈球菌、微球菌等引起食品腐敗和對人體健康有害的病菌有較強(qiáng)的抑制作用。乳酸鏈球菌素(Nisin)能有效抑制引起食品腐敗的許多革蘭氏陽性細(xì)菌，如乳桿菌、明串珠菌、小球菌、葡萄球菌、李斯特菌等，特別是對產(chǎn)芽孢的細(xì)菌如芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用。通常，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌耐熱性很強(qiáng)，如鮮乳采用135℃、2秒鐘超高溫瞬時滅菌，非芽孢細(xì)菌的死亡率為100％，芽孢細(xì)菌的死亡率90％，還有10％的芽孢細(xì)菌不能殺滅。若鮮乳中添加0.03～0.05g/kgNisin就可抑制芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌孢子的發(fā)芽和繁殖。通過病理學(xué)家研究以及毒理學(xué)試驗都證明乳酸鏈球菌素(Nisin)是完全無毒的。乳酸鏈球菌素(Nisin)可被消化道蛋白酶降解為氨基酸，無殘留，不影響人體益生菌，不產(chǎn)生抗藥性，不與其它抗生素產(chǎn)生交叉抗性。世界上有不少國家如英、法、澳大利亞等，在包裝食品中添加乳酸鏈球菌素(Nisin)，通過此法可以降低滅菌溫度，縮短滅菌時間，降低熱加工溫度，減少營養(yǎng)成份的損失，改進(jìn)食品的品質(zhì)和節(jié)省能源，并能有效地延長食品的保藏時間。還可以取代或部分取代化學(xué)防腐劑、發(fā)色劑(如亞硝酸鹽)，以滿足生產(chǎn)保健食品、綠色食品的需要。此外，Nisin還可應(yīng)用于人類和動物致病菌引起的疾病的治療，并具有很大的市場潛力。但是，目前國內(nèi)市場中Nisin產(chǎn)品的主要規(guī)格為2.5％粉劑，由于分離提純工藝的限制，Nisin產(chǎn)品的純度很難提高，而這種低純度的產(chǎn)品無法應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。因此，有必要開發(fā)新的生產(chǎn)工藝，以制備高純度Nisin。(三)技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種高純度Nisin的制備方法，本發(fā)明利用膜技術(shù)結(jié)合結(jié)晶法可分離制備得到含量達(dá)99％以上的高純Nisin。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種膜技術(shù)結(jié)合結(jié)晶法分離制備Nisin的方法，所述的方法為：(1)取Nisin發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至2.0～3.0(用濃度為4～6mol/L的HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié))，加熱至70～80℃保持30～45min，之后經(jīng)陶瓷膜(0.45μm)固液分離，取濾液先用截留分子量7000～8000的超濾膜進(jìn)行除雜(以去除截留分子量以上的雜質(zhì))，再用截留分子量2000～2500的超濾膜進(jìn)行濃縮(以去除水及截留分子量以下的小分子雜質(zhì)，通常濃縮至Nisin發(fā)酵液初始體積的3％～7％)，接著于45～55℃下繼續(xù)真空濃縮(通常濃縮至Nisin發(fā)酵液初始體積的0.3％～0.7％)，得到濃縮液；(2)取步驟(1)所得濃縮液，在50～60℃下，加入有機(jī)溶劑攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至5.0～7.0(優(yōu)選5.5～6.5，用2～4mol/L堿性物質(zhì)的水溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述的堿性物質(zhì)例如碳酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀)，降溫至0～4℃結(jié)晶12～18h，之后收集結(jié)晶所得晶體，真空干燥(45～55℃，3～6h)，制得Nisin產(chǎn)品(純度為75％～85％)。本發(fā)明方法步驟(1)中，所述的Nisin發(fā)酵液采用本領(lǐng)域公知的常規(guī)工藝生產(chǎn)，其中Nisin含量為450～550mg/L。步驟(2)中，所述的有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇或異丙醇，優(yōu)選乙醇。所述有機(jī)溶劑的體積用量為所述濃縮液體積的0.05％～0.4％，優(yōu)選0.1％～0.2％。進(jìn)一步，步驟(2)所得Nisin產(chǎn)品可重復(fù)結(jié)晶過程1～3次，從而獲得純度更高的Nisin產(chǎn)品(純度可達(dá)95％～99％)，所述重復(fù)結(jié)晶過程的具體操作方法為：將步驟(2)所得Nisin產(chǎn)品以料液質(zhì)量比1：10～15重新溶解于水中，得到Nisin溶液，調(diào)節(jié)pH至2～3(用濃度為4～6mol/L的HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié))，在50～60℃下，加入有機(jī)溶劑攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH至5.0～7.0(優(yōu)選5.5～6.5，用2～4mol/L堿性物質(zhì)的水溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述的堿性物質(zhì)例如碳酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉、氫氧化鈉或氫氧化鉀)，降溫至0～4℃結(jié)晶12～18h，之后收集結(jié)晶所得晶體，真空干燥(45～55℃，3～6h)，即完成一次重復(fù)結(jié)晶過程；所述的有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇或異丙醇，優(yōu)選乙醇；所述有機(jī)溶劑的體積用量為所述Nisin溶液體積的0.05％～0.4％，優(yōu)選0.1％～0.2％。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明方法可制備含量高達(dá)99％以上的高純Nisin，該Nisin產(chǎn)品可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、衛(wèi)生行業(yè)。另外，本發(fā)明方法生產(chǎn)過程清潔，避免了現(xiàn)有工藝中大量NaCl的使用，減少了高鹽廢水的產(chǎn)生。(四)附圖說明圖1：高純度Nisin(99％)照片；圖2：高純度Nisin的典型色譜圖(99％)。(五)具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。以下實施例中所采用的Nisin發(fā)酵液由浙江新銀象生物工程有限公司提供。實施例1：取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，在55℃下，加入5mL甲醇，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin452g，含量52％。實施例2：取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，在55℃下，加入5mL乙醇，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin612g，含量81％。實施例3：取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，在55℃下，加入5mL異丙醇，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin655g，含量72％。實施例4：取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，在55℃下，加入5mL乙醇，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin512g，含量70％。實施例5：取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，在55℃下，加入不同量的乙醇(1，3，5，10，20，50，100mL)分別進(jìn)行試驗，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin，并測定其含量，結(jié)果如下表1所示：表1乙醇加量(mL)135102050100產(chǎn)品重量(g)215426612511398255154產(chǎn)品含量(％)55628182776160實施例6：取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，在55℃下，加入5mL乙醇，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0和9.0分別進(jìn)行試驗，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin，并測定含量，具體結(jié)果如下表2所示：表2pH5.05.56.06.57.08.09.0產(chǎn)品重量(g)322439575612618599551產(chǎn)品含量(％)77807881756742實施例7：取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，在55℃下，加入5mL乙醇，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin612g，含量81％。將所得固體Nisin重新溶解于5L水中，pH用5mol/LHCl調(diào)節(jié)至2，在55℃下，加入5mL乙醇，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體505g，含量96％。按上述方法再次重復(fù)結(jié)晶過程，可得固體412g，含量99％。對比例1：采用NaCl進(jìn)行鹽析取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，加入1.5kgNaCl，攪拌充分后，將所得固體經(jīng)過濾、真空干燥，得Nisin固體2.1kg，含量23％。對比例2：沒有加入有機(jī)溶劑取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin112g，含量21％。對比例3：有機(jī)溶劑采用丙酮取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，加入5mL丙酮，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，緩慢用3mol/LNa2CO3溶液調(diào)節(jié)pH至6.5，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin152g，含量22％。對比例4：采用不同的堿調(diào)節(jié)pH取1000L發(fā)酵液(Nisin含量500mg/L)，用5mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至3.0，加熱至80℃保持30min，隨后將Nisin發(fā)酵液經(jīng)陶瓷膜固液分離后，進(jìn)一步將濾液用超濾膜(截留分子量7000)除去分子量7000以上的雜質(zhì)，隨后采用超濾膜(截留分子量2000)對該發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，濃縮20倍，將該濃縮液在55℃下繼續(xù)真空濃縮至5L，加入5mL乙醇，攪拌均勻后進(jìn)行結(jié)晶操作，采用3mol/LKOH、Na3PO4、CH3COONa的溶液調(diào)節(jié)pH至6.5(分別進(jìn)行試驗)，隨后將該溶液緩慢降溫至4℃，結(jié)晶12h，將晶體取出55℃真空干燥6h，最后得固體Nisin，并測定含量，如下表3所示：。表3調(diào)節(jié)pH的堿KOHNa3PO4CH3COONa產(chǎn)品重量(g)501492433產(chǎn)品含量(％)65％61％71％當(dāng)前第1頁1 2 3