本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種快速、簡便并且可實(shí)時定量檢測羊邊界病病毒（bdv）的實(shí)時熒光定量rt-pcr試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

邊界病(borderdisease，bd)，因首先發(fā)現(xiàn)于英格蘭和威爾士的邊界地區(qū)而得此名，又稱羔羊被毛顫抖病(hairyshakerdiseaseoflambs)，是由邊界病病毒引起新生羔羊以身體多毛，生長不良和神經(jīng)異常為主要特征的一種先天性傳染病。

邊界病病毒（bdv）屬黃病毒科瘟病毒屬，是有囊膜的單股正鏈rna病毒。邊界病病毒有免疫抑制作用，懷孕期感染邊界病病毒后，無論胎兒是否具有免疫應(yīng)答能力，病毒均可在體內(nèi)的各種組織中持續(xù)存在而成為病毒的攜帶者和疾病的傳染源。被感染的羔羊在生長成熟后的幾年內(nèi)，仍具有對其后代的感染性，邊界病病毒的主要自然宿主是綿羊，山羊也可感染，牛和豬均有易感性；血清學(xué)調(diào)查表明某些品種的野生鹿和野生反芻動物也可感染本病，并成為家養(yǎng)反芻動物的感染原。實(shí)驗(yàn)條件下兔子可感染本病毒，并用于邊界病病毒復(fù)制。

邊界病病毒主要存在于流產(chǎn)的胎兒，胎膜、羊水及持續(xù)感染動物的分泌物和排泄物中，動物可通過吸入和食入而感染本病。垂直感染是本病傳播的重要途徑之一。

綿羊經(jīng)肌肉、靜脈、腦內(nèi)、皮下、腹膜和氣管接種均可引發(fā)本病，用受到邊界病病毒污染的活毒疫苗接種懷孕母羊可引起本病的暴發(fā)。子宮和卵巢或睪丸生殖細(xì)胞中存在的病毒，可經(jīng)胎盤和精液發(fā)生垂直傳播。感染了邊界病病毒的成年羊主要表現(xiàn)為繁殖力下降和流產(chǎn)。羔羊表現(xiàn)為發(fā)育不良和畸形，多見斷奶羊死亡。因此，建立特異、敏感和快速的診斷技術(shù)非常重要。

目前，羊邊界病病毒的檢測技術(shù)主要有病毒分離鑒定、熒光免疫技術(shù)檢測抗原和普通pcr方法。病毒的分離鑒定，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但也存在操作復(fù)雜，需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，所需時間長，以及受影響的因素多等缺點(diǎn)，不利于羊邊界病病毒的快速診斷。熒光免疫技術(shù)是一種相對快速和敏感的檢測方法，但其敏感性較差。相比普通pcr方法，實(shí)時熒光定量pcr方法不需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來判讀結(jié)果，反應(yīng)結(jié)束即可獲得檢測結(jié)果，更為快速便捷；此外，其靈敏度比普通pcr方法靈敏度更高，還可進(jìn)行定量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決實(shí)驗(yàn)室快速、批量、準(zhǔn)確檢測羊邊界病病毒（bdv），提供一種方快捷準(zhǔn)確地檢測bdv的實(shí)時熒光定量rt-pcr試劑盒。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案為：一種檢測羊邊界病病毒的實(shí)時熒光定量rt-pcr試劑盒，該試劑盒包含a液、b液和c液；

所述a液為熒光定量rt-pcr反應(yīng)液，2×ultrasybrmixture，上游引物forwardprimer與下游引物reverseprimer；

所述b液為含羊邊界病病毒cdna，作為陽性對照；

所述c液為rnase-freewater，作為陰性對照；

所述的上游引物forwardprimer：5'-gcccatagtaggactagca-3'；

所述的下游引物reverseprimer：5'-cgaactactgacgactgtc-3'；

序列擴(kuò)增大小為115bp。

優(yōu)選的，該試劑盒含有一次性熒光定量pcr反應(yīng)八聯(lián)管。

優(yōu)選的，所述的上游引物forwardprimer與下游引物reverseprimer使用前稀釋到2pmol/l。

優(yōu)選的于，所述的2×ultrasybrmixture組分包括goldstartaqdnapolymerase1-5u、kcl20-30mm、mgso43-10mm、和eachdntp200-400um。。

一種檢測羊邊界病病毒的實(shí)時熒光定量rt-pcr試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，具體步驟如下：

（1）引物設(shè)計(jì)與合成；

（2）制備反應(yīng)模板cdna；

（3）rt-pcr反應(yīng)體系的建立；

（4）rt-pcr反應(yīng)程序的建立；

（5）rt-pcr反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增。

優(yōu)選的，所述的反應(yīng)模板cdna提取自病毒基因組dna/rna提取試劑盒提取羊邊界病病毒的rna，再將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna。

優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)體系的建立為，按20μl體系配置：

2×ultrasybrmixture11.25μl

forwardprimer（2pmol/l）0.4μl

reverseprimer（2pmol/l）0.4μl

反應(yīng)模板cdna2μl

rnase-freewater補(bǔ)足20μl。

優(yōu)選的，所述pcr反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增的程序?yàn)椋簽?5℃5min；隨后進(jìn)行40個95℃20s，60℃20s，68℃20s的循環(huán)；最后68℃延伸5min。

本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是：

1）特異性強(qiáng)

本發(fā)明的實(shí)時熒光定量rt-pcr檢測試劑盒特異性檢測出羊邊界病病毒（bdv），所檢測的陰性對照病毒（羊支原體、布魯氏桿菌、巴氏桿菌、大腸桿菌）均無陽性結(jié)果。

2）靈敏度高

本發(fā)明的羊邊界病病毒（bdv）實(shí)時熒光定量rt-pcr檢測試劑盒靈敏度高，最小檢出量為4×10²拷貝/μl病毒基因組拷貝數(shù)。

3）耗時少、結(jié)果判讀簡便

與通過病原分離鑒定來檢測相比，本發(fā)明的羊邊界病病毒（bdv）實(shí)時熒光定量rt-pcr檢測試劑盒，在時間成本、工作量等方面具有明顯的優(yōu)勢，從組織樣品中提取rna，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量rt-pcr檢測，到獲得最終結(jié)果可在4-5小時內(nèi)完成，與普通rt-pcr相比，實(shí)時熒光定量rt-pcr反應(yīng)結(jié)束即可進(jìn)行結(jié)果判定，不需要再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)分析來判讀結(jié)果。本發(fā)明的實(shí)時熒光定量rt-pcr檢測試劑盒特別適用于羊邊界病病毒（bdv）的實(shí)驗(yàn)室快速診斷和疫情監(jiān)測。

4）準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好

用1.0×10⁶、1.0×10⁵和1.0×10⁴拷貝/μl的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品分3管同時進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr，分別重復(fù)5次檢測。結(jié)果其ct值平均數(shù)分別為15.01+1.10、17.85+0.83、21.03+0.69，變異系數(shù)分別為2.34%、2.21%和2.07%，表明反應(yīng)批內(nèi)和批間ct值差異均不顯著，該反應(yīng)體系重復(fù)性好。

5）可實(shí)時定量

本發(fā)明利用熒光定量pcr儀實(shí)時分析rt-pcr反應(yīng)的結(jié)果，熒光定量pcr儀會根據(jù)各個標(biāo)準(zhǔn)品測得的ct值，以樣本拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。通過從儀器讀取待測樣品的ct值，代入表達(dá)式就可以換算出其初始拷貝數(shù)。本方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測范圍廣，在6個數(shù)量級之間（ct值從14.50～31.33之間）有很好的線性關(guān)系。

附圖說明

圖1溶解曲線分析結(jié)果：溫度以0.5℃/10s的速率從55℃緩慢遞增到94℃，連續(xù)測定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取熔解曲線。熔解溫度為86.5℃，只有一個特異峰，從而排除了非特異性產(chǎn)物和形成引物二聚體對結(jié)果帶來影響的可能，同時說明設(shè)計(jì)的引物有很好的特異性，pcr反應(yīng)條件得到了很好的優(yōu)化。

圖2目標(biāo)產(chǎn)物電泳檢測分析結(jié)果：其中1：羊邊界病病毒樣本；m：dna標(biāo)準(zhǔn)600bp。

圖3是本發(fā)明特異性檢測結(jié)果，以羊支原體、布氏桿菌、巴氏桿菌、大腸桿菌為對照，同時進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr檢測，其中：m：100bpladder，1：羊邊界病毒，2：羊支原體，3：布氏桿菌，4：巴氏桿菌，5：大腸桿菌，6：水對照；結(jié)果顯示，只有羊邊界病病毒反應(yīng)管有擴(kuò)增曲線，為陽性結(jié)果，4株對照反應(yīng)管和水對照反應(yīng)管均無擴(kuò)增情況出現(xiàn)，為陰性結(jié)果。

圖4是本發(fā)明實(shí)時熒光定量rt-pcr檢測敏感性檢測結(jié)果；其中反應(yīng)模板（陽性重組質(zhì)粒）的起始濃度為4×10¹⁰拷貝/μl，經(jīng)10倍倍比連續(xù)稀釋后，進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr擴(kuò)增，其中1：4×10⁸ng/μl、2：4×10⁷ng/μl、3：4×10⁶ng/μl、4：4×10⁵ng/μl、5：4×10⁴ng/μl、6：4×10³ng/μl和7：4×10²ng/μl；結(jié)果顯示本發(fā)明的檢測方法檢測限為4×10²ng/μl。

圖5是本發(fā)明定量檢測羊邊界病病毒（bdv）的標(biāo)準(zhǔn)曲線；設(shè)置對照：濃度為4×10⁸ng/μl、4×10⁷ng/μl、4×10⁶ng/μl、4×10⁵ng/μl、4×10⁴ng/μl、4×10³ng/μl和4×10²ng/μl的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個，以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以ct值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：ct=-3.295×log拷貝數(shù)＋5.068，斜率為-3.295，截距為5.068，r²=0.998，成良好的線性關(guān)系。通過從儀器讀取待測樣品的ct值，代入表達(dá)式就可以換算出其初始拷貝數(shù)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1羊邊界病病毒（bdv）實(shí)時熒光定量rt-pcr檢測

1、材料的準(zhǔn)備

羊邊界病病毒、羊支原體、布氏桿菌、巴氏桿菌和大腸桿菌為市售疫苗或廣西獸醫(yī)研究所保存。2×ultrasybrmixture、病毒基因組dna/rna提取試劑盒（cw0548s）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒hifiscriptcdnasynthesiskit（cw2569m）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

2、rt-pcr引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)genbank中的羊邊界病病毒5’非編碼區(qū)基因序列進(jìn)行同源性比較分析，選擇保守序列區(qū)作為擴(kuò)增區(qū)域，利用oligo6.0引物設(shè)計(jì)軟件和blast軟件程序設(shè)計(jì)出特異性擴(kuò)增引物，其中引物的序列分別為：

forwardprimer：5'-gcccatagtaggactagca-3'

reverseprimer：5'-cgaactactgacgactgtc-3'

序列擴(kuò)增大小為115bp。

上、下游引物使用前稀釋到2pmol/l。

3、病毒rna提取及反轉(zhuǎn)錄

使用病毒基因組rna提取試劑盒提取試驗(yàn)毒株的dna/rna，以及疑似羊邊界病病毒感染引起病變組織的rna，再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒hifiscriptcdnasynthesiskit將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna。

4、rt-pcr反應(yīng)體系建立

所述的實(shí)時熒光定量rt-pcr試劑盒反應(yīng)體系建立以20μl計(jì)，

2×ultrasybrmixture11.25μl

forwardprimer（2pmol/l）0.4μl

reverseprimer（2pmol/l）0.4μl

反應(yīng)模板cdna2μl

rnase-freewater補(bǔ)足20μl。

5、rt-pcr反應(yīng)程序及目標(biāo)產(chǎn)物電泳分析

檢測過程在實(shí)時熒光定量pcr儀密閉進(jìn)行，全程監(jiān)控，反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min；隨后進(jìn)行40個95℃20s，60℃20s，68℃20s的循環(huán)；最后68℃延伸5min。

熒光定量pcr儀會根據(jù)各個標(biāo)準(zhǔn)品測得的ct值，以樣本拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過從儀器讀取待測樣品的ct值，代入表達(dá)式就可以換算出其初始拷貝數(shù)。

反應(yīng)結(jié)束后，取8ul產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否擴(kuò)增出目的片段，片段大小為115bp。

6、實(shí)時熒光定量rt-pcr檢測方法

1）實(shí)時熒光定量pcr條件的優(yōu)化

在icycleriq^tm熒光定量pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析，對不同退火溫度（58～62℃）進(jìn)行優(yōu)化，然后，以優(yōu)化的退火溫度對引物濃度(2～25pmol/μl)進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳擴(kuò)增條件。

2）熔解曲線分析

為排除非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的形成對實(shí)時熒光定量pcr結(jié)果造成影響的可能性，在pcr后進(jìn)行熔解曲線分析以確定引物的特異性和所得產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物。溫度以0.5℃/10s的速率從55℃緩慢遞增到94℃，連續(xù)測定樣品的熒光強(qiáng)度以獲取熔解曲線。反應(yīng)結(jié)束后取6μl產(chǎn)物進(jìn)行電泳，判斷有無115bp的特異性條帶出現(xiàn)。

3）特異性檢測

以提取的試驗(yàn)毒株和對照毒株的基因組dna/rna進(jìn)行實(shí)時熒光定量rt-pcr擴(kuò)增，檢驗(yàn)rt-pcr方法的特異性。

4）敏感性檢測

將羊邊界病病毒rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，以此為反應(yīng)模板，以優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行常規(guī)pcr擴(kuò)增。pcr產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢測，在紫外燈下切取目的片段，利用dna膠回收試劑盒按說明回收純化。將回收純化的目的片段與pmd-18t載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切和pcr鑒定，重組質(zhì)粒送上海捷瑞公司測序。純化陽性重組質(zhì)粒，測定起起始濃度后，用rna-freewater連續(xù)10倍倍比稀釋，采用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr，進(jìn)行敏感性檢測。

5）準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測

用1.0×10⁶、1.0×10⁵和1.0×10⁴拷貝/μl的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品分3管同時進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr，分別重復(fù)5次檢測。檢驗(yàn)本發(fā)明檢測方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

實(shí)施例2實(shí)時熒光定量rt-pcr反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

分別對退火溫度和引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，獲得了羊邊界病病毒的實(shí)時熒光定量pcr的最佳反應(yīng)條件和體系?？偡磻?yīng)體系為20μl，包括2×反應(yīng)緩沖液11.25μl、上下游引物(2pmol/l)各0.4μl、cdna模板2μl以及ddh2o5.95μl。循環(huán)條件為：95℃5min；隨后進(jìn)行40個95℃20s，60℃20s，68℃20s的循環(huán)；最后68℃5min延伸。將熒光rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測到目的條帶115bp（圖2）。

實(shí)施例3實(shí)時熒光定量rt-pcr熔解曲線分析

熔解曲線分析結(jié)果見圖1，熔解溫度為86.5℃，只有一個特異峰，從而排除了非特異性產(chǎn)物和形成引物二聚體對結(jié)果帶來影響的可能，同時說明設(shè)計(jì)的引物有很好的特異性，pcr反應(yīng)條件得到了很好的優(yōu)化。

實(shí)施例4rt-pcr檢測方法的特異性結(jié)果

以羊支原體、布氏桿菌、巴氏桿菌、大腸桿菌為對照，同時進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr檢測，檢測本發(fā)明檢測方法的特異性，結(jié)果顯示，只有羊邊界病病毒反應(yīng)管有擴(kuò)增曲線，為陽性結(jié)果，4株對照反應(yīng)管和水對照反應(yīng)管均無擴(kuò)增情況出現(xiàn)，為陰性結(jié)果，表明本方法具有很好的特異性（圖3）。

實(shí)施例5實(shí)時熒光定量rt-pcr檢測方法的敏感性結(jié)果

陽性重組質(zhì)粒起始濃度為4×10¹⁰拷貝/μl，用rnase-freewater進(jìn)行10倍系列稀釋，采用優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr擴(kuò)增（圖4），結(jié)果顯示，當(dāng)模板濃度為4×10²拷貝/μl時，仍有熒光曲線，表明該方法檢測靈敏度為4×10²拷貝/μl。

實(shí)施例5羊邊界病病毒（bdv）實(shí)時熒光定量rt-pcr方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

設(shè)置對照：濃度為4×10⁸ng/μl、4×10⁷ng/μl、4×10⁶ng/μl、4×10⁵ng/μl、4×10⁴ng/μl、4×10³ng/μl和4×10²ng/μl的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個，以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以ct值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）：ct=-3.295×log拷貝數(shù)＋5.068，斜率為-3.295，截距為5.068，r²為0.998，呈良好的線性關(guān)系。通過從儀器讀取待測樣品的ct值，代入表達(dá)式就可以換算出其初始拷貝數(shù)，從而達(dá)到定量的效果。

實(shí)施例6羊邊界病病毒（bdv）實(shí)時熒光定量rt-pcr方法準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性檢測

用1.0×10⁶、1.0×10⁵和1.0×10⁴拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)樣品分3管同時進(jìn)行實(shí)時熒光定量pcr，分別重復(fù)5次檢測。結(jié)果其ct值平均數(shù)分別為15.01+1.10、17.85+0.83、21.03+0.69，變異系數(shù)分別為2.34%、2.21%和2.07%，表明反應(yīng)批內(nèi)和批間ct值差異均不顯著，該反應(yīng)體系重復(fù)性好。