本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種鑒定西瓜種皮顏色的InDel分子標記及其引物和應用。

背景技術：

除了品質(zhì)和抗性性狀，西瓜種子性狀也是育種家新品種選育的目標之一。西瓜種皮顏色變異豐富，卻沒有統(tǒng)一的描述標準，不同的研究很難進行比較。馬雙武主編的《西瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》將種皮底色(第一顏色)分為白、黃白、灰黃、黃、紅黃、淺紅、紅、紅褐、灰褐、黑、綠和灰綠12種，種皮覆紋(第二顏色)特征分為灰褐色斑點、灰褐色斑紋、黃白色斑塊、黃紅色斑塊、黃褐色斑塊和黑色斑塊六種。

西瓜種子存在一些已知的基因突變體，遺傳學分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)控制種皮顏色的3個基因，包括r(Poole et al.,1941)控制紅色種子，t(McKay,1936)控制棕褐色(tan)種皮，w(Poole et al.,1941)控制白色種皮。r、t和w相互作用產(chǎn)生六種不同的種皮顏色：黑色(RR TT WW)、土色(RR TT ww)、棕褐色(RR tt WW)、白色帶棕褐色種尖(RR tt ww)、紅色(rr tt WW)、白色帶粉紅色種尖(rr tt ww)(Kanda 1951)。還發(fā)現(xiàn)一個控制種皮顏色的修飾基因d(Poole et al.,1941)，當r、t、w為顯性時產(chǎn)生黑色(RR TT WW DD)或黑色帶斑點種皮(RR TT WW dd)，但對其他種皮顏色沒有影響。并且這四個基因對綠色種皮顏色沒有作用。傳統(tǒng)的遺傳學采用數(shù)理統(tǒng)計的方法，只能將控制種皮顏色的一個或多個基因作為一個整體進行研究，不能確定單個基因在染色體上的位置及效應(徐云碧，1992)。

技術實現(xiàn)要素：

針對以上問題，本發(fā)明通過QTL定位首次在8號連鎖群定位到了種皮顏色的主效QTL(數(shù)量性狀位點)，并結合親本重測序制備到與西瓜種皮顏色緊密連鎖的InDel分子標記，設計了其引物，并在西瓜種皮顏色育種中進行了應用，可為鑒定西瓜種皮顏色提供新手段，加速西瓜種皮顏色的改良進程，提高育種的準確性和選擇效率。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

設計一種鑒定西瓜種皮顏色的InDel分子標記，其核苷酸序列為：ATATGAGCCCGTAGAGG。

上述InDel分子標記的PCR擴增引物，包括以下的引物對：

InDel6_sc8F：AAATCACAGTAATAGAATGCTT；

InDel6_sc8R：TTAGAAGCTACACTCGTCCT。

上述InDel分子標記的篩選方法，包括以下步驟：

(1)利用種皮顏色分別為黃麻和黑色的母本和父本雜交的F₂群體構建高密度的遺傳連鎖圖譜，并對父母本、F₁和F₂群體的93個單瓜種子進行種皮顏色的表型鑒定；

(2)結合遺傳連鎖圖譜和種皮顏色表型鑒定結果，利用專門針對質(zhì)量性狀定位的Rqtl-IM-binary方法進行QTL初定位，在LG8鑒定到一個種皮顏色的主效QTL(sc8)，其LOD峰值為17，解釋90％的表型變異，對應的置信區(qū)間(2-LOD)為119-191cM，對應的物理位置為8號染色體的19.9-25.9Mb；

(3)結合兩個親本的重測序，在QTL峰值附近區(qū)域發(fā)現(xiàn)20個插入缺失片段大于20bp的InDels，共設計了16對InDel引物；

(4)利用對應的InDel引物在父母本、F₁進行多態(tài)性篩選，然后利用多態(tài)性的InDel引物在F₂群體中進行基因型鑒定；

(5)將種皮顏色表型歸為一個形態(tài)學標記SC8，加上InDel分子標記的基因型鑒定結果與LG8上的其它SNP標記利用JoinMap4.0進行圖譜構建，發(fā)現(xiàn)SC8位于主效QTL sc8的置信區(qū)間，并且其中一對新開發(fā)的引物InDel6_sc8與SC8的連鎖程度很緊密，兩者的遺傳距離僅為1cM。

利用上述技術措施，發(fā)明人最終獲得了與西瓜種皮顏色緊密連鎖的插入缺失分子標記InDel6_sc8，其對應的西瓜參考基因組物理圖譜的位置為8號染色體的22640623bp，序列為ATATGAGCCCGTAGAGG，其特異的擴增引物序列為，

InDel6_sc8F：AAATCACAGTAATAGAATGCTT；

InDel6_sc8R：TTAGAAGCTACACTCGTCCT。

利用上述InDel分子標記鑒定西瓜種皮顏色的方法，包括以下步驟：

(1)引物設計：設計并篩選，得到所述擴增引物；

(2)DNA提取：利用CTAB法提取西瓜植株總DNA；

(3)PCR擴增：

反應體系：100ng/μl西瓜植株總DNA 1μl、正向引物(10μmol/l)1μl、反向引物(10μmol/l)1μl、2×Power Taq PCR MasterMix 12.5μl、ddH₂O 9.5μl；

反應程序：94℃5分鐘，35個循環(huán)的94℃20秒鐘、55℃1分鐘、72℃30秒、72℃5分鐘；

(4)電泳圖譜分析：對所得擴增產(chǎn)物進行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳、顯影、染色和帶型判讀，找到目標條帶，根據(jù)擴增產(chǎn)物的條帶大小及位置關系確定所屬基因型(197bp的條帶代表黃麻種皮基因型，180bp的條帶代表非黃麻種皮基因型)。

本發(fā)明具有以下積極有益效果：

本發(fā)明InDel分子標記變異穩(wěn)定、檢測容易，并且成本低廉，提高了西瓜種皮顏色育種的選擇效率和準確率，從而能加快育種進程。此外，此標記與目標QTL緊密連鎖，遺傳距離僅為1cM，在群體中檢測效率達到100％，加快了西瓜種皮顏色基因的克隆和功能驗證。

附圖說明

圖1種皮顏色全基因組的QTL掃描圖譜。

圖2開發(fā)InDel標記加入圖譜前后分析；A：LG8種皮顏色QTL掃描；B加上分子標記InDel6_sc8后的連鎖分析。

圖3利用分子標記InDel6_sc8的引物在部分F₂群體基因組DNA中的擴增結果；父母本方框中條帶為目的條帶，名稱皆為品種名稱\代號的后兩/三位。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合具體實施例，對本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。以下實施例中所涉及的原料，如無特別說明均為市售，所涉及檢測方法如無特別說明，則均為常規(guī)方法。

實施例1

鑒定西瓜種皮顏色的InDel分子標記的開發(fā)方法，具體步驟如下：

(1)西瓜種皮顏色全基因組QTL定位

利用母本“ZXG01478”(黃麻：種皮底色為黃，覆紋為灰褐色斑點)和父本“14CB11”(黑：種皮底色為黑，無覆紋)雜交獲得的F₂群體已經(jīng)構建了高密度的遺傳連鎖圖譜(Shang et al.,2016)，并對父母本、F₁和F₂群體的93個單瓜種子進行種皮顏色的直觀鑒定；結合遺傳連鎖圖譜和F₂群體表型鑒定結果，利用Rqtl-IM-binary方法(Yandel et al.,2007)進行QTL初定位(圖1)，僅在LG8鑒定到一個種皮顏色的主效QTL(sc8)，其LOD峰值為17，解釋90％的表型變異，對應的置信區(qū)間(2-LOD)為119-191cM，對應的物理位置為8號染色體的19.9～25.96Mb。

(2)父母本的重測序

利用母本和父本進行了22×深度的高通量重測序。兩個親本共檢測到45134個小的InDel。

(3)QTL區(qū)域InDel標記的開發(fā)

在QTL定位的峰值附近區(qū)間發(fā)現(xiàn)20個插入缺失片段大于20bp的InDels。利用Perl自編程序提取插入缺失相應位置前后各500bp的序列，共設計16對對應的InDel引物。

實施例2

西瓜F₂群體分子標記分析，包括以下步驟：

(1)利用CTAB法提取葉片總DNA，具體步驟如下：

①取1g新鮮葉片放入研缽，加入液氮研成粉末狀，隨即轉入加有1mlCTAB抽取液的離心管中，使二者充分混勻，然后置于65℃恒溫水浴60min，其間顛倒混合2-3次；

②從水浴鍋取出后，8000rpm離心1min；

③取上清液置于另一離心管中，加等體積的氯仿：異戊醇(24：1，V/V)，輕輕顛倒使其充分混勻；

④10000rpm離心5min，取上清液(盡量不取到中層沉淀)；

⑤加入0.7倍體積的異丙醇(需提前預冷30min)，混勻后置于-20℃冷凍不超過30min讓DNA析出；取出后10000rpm離心5min，留沉淀棄上清液；

⑥用無水乙醇清洗沉淀數(shù)次，倒掉浸泡液，打開離心管蓋子晾干；

⑦加入200μl的蒸餾水溶解DNA；用紫外分光光度計測定DNA的濃度，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)PCR反應體系和程序

反應體系如下：西瓜葉片總DNA(100ng/μl)1μl、Forward primer(10μmol/L)1μl、Reverse primer(10μmol/L)1μl、2×Power Taq PCR MasterMix12.5μl、ddH₂O 9.5μl。

PCR反應程序為：94℃5分鐘，35個循環(huán)的94℃20秒鐘、55℃1分鐘、72℃30秒、72℃5分鐘。

(3)對PCR產(chǎn)物進行8％聚丙烯酰胺凝膠電泳、顯影、染色和帶型判讀。

①試劑配制：

A.5×TBE：

Tris-base 53.9克

EDTA 3.72克

硼酸 27.5克

用蒸餾水定容至1升。

B.40％聚丙烯酰胺溶液：

聚丙烯酰胺 193.34克

甲叉雙丙烯酰胺 6.66克

用蒸餾水定容至 500毫升。

C.8％聚丙烯酰胺凝膠(現(xiàn)配現(xiàn)用)：

D.銀染液：

硝酸銀 1克

冰醋酸 5毫升

無水乙醇 50毫升

用去離子水定容至500毫升。

E.顯影液：

氫氧化鈉 15克

甲醛(37％) 2.5毫升

用去離子水定容至 500毫升。

②凝膠板準備：

玻璃板用蒸餾水洗凈、晾干后，用浸泡過無水乙醇的脫脂棉球擦拭，晾干。將凹板和平板疊合緊密后放入制膠器中壓緊并扣好其兩邊的夾子(一個制膠器可制作兩板凝膠)。在洗瓶內(nèi)配置8％聚丙烯酰胺凝膠溶液(兩份)，混勻后快速注入兩板中間的縫隙內(nèi)，注滿后插入有齒的梳子(不要讓梳子齒的下方產(chǎn)生氣泡)；若此時液面有所下降，可用移液器吸取未凝固的溶液來補充。等待溶液充分凝固。

③電泳：

將制膠器支架從底座上取下，直接放入配套的電泳槽中，在電泳槽底部及支架上兩塊玻璃板中間倒入適量的1×TBE緩沖液。在PCR產(chǎn)物中加入0.2倍體積的6×DNA Loading Buffer，混勻后取0.8微升加入點樣孔內(nèi)，260伏電泳35分鐘。

④染色和顯影：

電泳完成后，從電泳槽中取出玻璃板，撬去凹板，凝膠會貼附于平板上，凝膠面向上將平板放入銀染液中，置于脫色搖床上輕搖15分鐘，凝膠會自動脫落下來；銀染完畢，將凝膠取出放入去離子水中清洗10秒；清洗完畢后將凝膠轉入顯影液中，輕搖搖床，待條帶清晰后取出凝膠，放置在閱片器上肉眼觀察條帶的位置差異，并拍照保存。

⑤帶型判讀：

將顯影后自然干燥好的玻璃板置于閱片臺上，肉眼觀察兩親本條帶的位置差異。

實施例3

F₂群體遺傳連鎖圖譜重新構建，其步驟如下：首先利用種皮顏色形態(tài)標記(SC8)、新開發(fā)的InDel標記和LG8上其它的SNP標記利用Joinmap4.0軟件進行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)SC8位于主效QTL sc8的置信區(qū)間，并且是比較接近QTL峰值的位置，新開發(fā)的標記之一InDel6_sc8與SC8的遺傳距離很近，僅為1cM(圖2)。至此，我們開發(fā)了與種皮顏色QTL(sc8)最為緊密連鎖的共顯性分子標記InDel6_sc8，對應于8號染色體22640623bp的一個17bp的插入缺失，其序列為ATATGAGCCCGTAGAGG，其引物序列為，InDel6_sc8F：AAATCACAGTAATAGAATGCTT；InDel6_sc8R：TTAGAAGCTACACTCGTCCT。該引物在母本(黃麻)中的擴增產(chǎn)物為197bp，在父本(黑色)中的擴增產(chǎn)物為180bp，該標記與SC8的遺傳距離僅為1cM，與種皮顏色QTL(sc8)的連鎖程度很緊密。

實施例4

一種實施例3所篩選InDel分子標記在育種中的應用，其應用步驟如下：

(1)如實施例2進行InDel6_sc8分子標記在F₂群體中的基因型鑒定(圖3)。

(2)檢查InDel6_sc8分子標記的兩種基因型(A代表母本帶型，B代表父本帶型，H代表雜合基因型)在93個F₂群體中的分布情況(表1)。

結果表明，分子標記InDel6_sc8的基因型在20份黃麻種皮株系中都為A(197bp)。而在73份非黃麻(黑或褐)株系中，有23份為B(180bp)，50份為H。

分子標記InDel6_sc8的基因型為A的20個株系都是黃麻，而在基因型為B的23個株系都是非黃麻(黑或褐)，其基因型鑒定的準確率達到100％。

以上的結果足以說明通過分子標記InDel6_sc8來預測西瓜種皮顏色(特別是隱性黃麻種色)，可以提高西瓜種皮顏色育種的選擇效率，從而加速育種進程。

表1 InDel6_sc8在F₂群體中的鑒定和驗證

SEQUENCE LISTING

<110> 河南牧業(yè)經(jīng)濟學院

<120> 鑒定西瓜種皮顏色的InDel分子標記及其引物和應用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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