本發(fā)明涉及I型膠原質(zhì)凍膠的用途，具體地說是以I型膠原質(zhì)凍膠制備組織工程化軟骨的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

軟骨缺損是臨床上常見的疾病。目前，臨床對(duì)軟骨缺損的治療仍沒有較好的質(zhì)量方案。近些年來(lái)，組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展給軟骨缺損的治療帶來(lái)了契機(jī)。I型膠原因其良好的組織相容性和降解性被廣泛應(yīng)用到臨床中。雖然軟骨組織的主要成分是II型膠原，但是理化性能沒有I型膠原好。而I型膠原與II型膠原有相似的組成結(jié)構(gòu)，同時(shí)能夠提供細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，而開發(fā)成為凍膠，包含結(jié)合水成分，與軟骨組織更為接近，是軟骨組織修復(fù)的理想材料。因此采用組織工程技術(shù)從小牛皮中提取開發(fā)軟骨誘導(dǎo)型I型膠原質(zhì)凍膠具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是研究開發(fā)軟骨誘導(dǎo)型I型膠原質(zhì)凍膠做為誘導(dǎo)軟骨和軟骨修復(fù)的材料，開發(fā)I型膠原質(zhì)凍膠的新用途，以I型膠原質(zhì)凍膠制備組織工程化軟骨的應(yīng)用。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)研究而完成的。研究分兩大部分：

一、I型膠原質(zhì)凍膠的制備

提取方法：將去毛的小牛皮洗凈，瀝干，剪碎，粉碎后，Tris-HCl 4℃浸泡過夜，0.1%的醋酸溶液溶解2小時(shí)后，用2%的胃蛋白酶4℃消化24小時(shí)至48小時(shí)。

純化方法： 將胃蛋白酶消化的產(chǎn)物加入0.1%的醋酸中，反復(fù)洗滌離心3次；加入0.5M的NaOH調(diào)節(jié)PH至7.2左右，放置于-20℃，即獲得高純度的I型膠原質(zhì)凍膠；即時(shí)使用時(shí)放置于4℃。

鑒定方法：I型膠原質(zhì)凍膠溶液均勻地涂覆在石英片上,在180~420nm處進(jìn)行檢測(cè)其紫外光譜。

二、I型膠原體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成軟骨實(shí)驗(yàn)

提取新西蘭大白兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，然后用I型膠原質(zhì)凍膠誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨。細(xì)胞活力檢測(cè)表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在I型膠原質(zhì)凍膠中能夠較好的生長(zhǎng)，且在不斷地增殖。

番紅O染色檢測(cè)結(jié)果顯示，I型膠原質(zhì)凍膠的誘導(dǎo)下可以形成類似軟骨陷窩的結(jié)構(gòu)，且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在I型膠原質(zhì)凍膠得誘導(dǎo)下可以促使軟骨相關(guān)多糖蛋白的表達(dá)增高。

定量PCR檢測(cè)軟骨相關(guān)基因：II型膠原（COL2A1）, 蛋白聚糖（ACAN）和SOX9均有所上調(diào)，而纖維軟骨相關(guān)基因——I型膠原（COL1A1）和軟骨肥大化相關(guān)基因（COL10）表達(dá)量均較低。以上結(jié)果說明I型膠原水凝膠有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨的作用。

I型膠原質(zhì)凍膠作為誘導(dǎo)軟骨和軟骨修復(fù)材料開辟了新用途。

I型膠原質(zhì)凍膠在軟骨誘導(dǎo)性能上的應(yīng)用，是按照以下方法實(shí)現(xiàn)的：

將海綿狀的I型膠原質(zhì)凍膠以15mg/mL的濃度溶解于0.1%得醋酸溶液中，并在4攝氏度下用0.5M的NaOH調(diào)節(jié)PH至7.2左右，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)分為：1）對(duì)照組，BMSCs小球（10⁷個(gè)細(xì)胞/團(tuán)）；2）誘導(dǎo)組，BMSCs + I型膠原質(zhì)凍膠（10⁷個(gè)細(xì)胞/團(tuán)）。實(shí)驗(yàn)組采用渦流的方法，將15mg/mL I型膠原質(zhì)凍膠與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合，放在培養(yǎng)箱中15分鐘后成凝膠，加入正常的完全培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)7天，14天和21天。

總之，本發(fā)明首次對(duì)I型膠原質(zhì)凍膠的軟骨誘導(dǎo)性能進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)表明I型膠原質(zhì)凍膠可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。與此同時(shí)，I型膠原質(zhì)凍膠還有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的作用。因此，軟骨誘導(dǎo)型I型膠原質(zhì)凍膠可以作為誘導(dǎo)軟骨和軟骨修復(fù)的材料，開發(fā)了I型膠原質(zhì)凍膠的新用途，應(yīng)用I型膠原質(zhì)凍膠構(gòu)建軟骨誘導(dǎo)性膠原水凝膠在軟骨缺損的治療上有重要意義。

附圖說明

圖1A是標(biāo)準(zhǔn) Sigma I型膠原紫外光譜圖；

圖1B是所提取的I型膠原質(zhì)凍膠紫外光譜圖；

圖2是I型膠原質(zhì)凍膠誘導(dǎo)BMSCs成軟骨細(xì)胞的番紅O染色圖。

具體實(shí)施方式

一、I型膠原質(zhì)凍膠的制備和鑒定

提取方法：將去毛的小牛皮洗凈，瀝干，剪碎，粉碎后，用0.05M的Tris-HCl 在4℃浸泡過夜，棄緩沖液后，用超純水洗滌3次。室溫下將沉淀物溶于0.1%的醋酸溶液中，2小時(shí)后用勻漿機(jī)將沉淀物打勻，用2%的胃蛋白酶在4℃消化24至48小時(shí)。此時(shí)即可獲得粗提的I型膠原質(zhì)凍膠。

純化方法：將粗提的產(chǎn)物以每克50ml 0.1% 醋酸的比例洗滌，4攝氏度下10000rpm離心30分鐘，重復(fù)3次后即可獲得高純度的I型膠原質(zhì)凍膠。并將I型膠原質(zhì)凍膠用凍干機(jī)凍干48小時(shí)后形成海綿狀備用。

鑒定方法：將I型膠原質(zhì)凍膠溶液均勻地涂覆在石英片上, 在180~420nm處進(jìn)行檢測(cè)其紫外光譜。膠原的肽鏈中含有CO、COOH和CONH₂等生色基團(tuán), 可在近紫外區(qū)檢測(cè)其吸收峰值。圖1A是標(biāo)準(zhǔn) Sigma I型膠原紫外光譜圖，圖1B是所提取的I型膠原質(zhì)凍膠紫外光譜圖。所提取的I型膠原質(zhì)凍最大吸收在230nm附近，而Sigma I型膠原也是在230nm處。證明所提取的樣品含有I型膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征。

二、I型膠原體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方案：

（1）實(shí)驗(yàn)分組及處理

選取2月新西蘭大白兔，用骨髓穿刺針于股骨處抽取骨髓10毫升，利用梯度密度離心法分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) 培養(yǎng)基在37攝氏度，5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并用第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。將海綿狀的I型膠原質(zhì)凍膠以15mg/mL的濃度溶解于0.1%得醋酸溶液中，并在4攝氏度下用0.5M的NaOH調(diào)節(jié)PH至7.2左右，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為：1）對(duì)照組，BMSCs小球（10⁷個(gè)細(xì)胞/團(tuán)）；2）誘導(dǎo)組，BMSCs + 15mg/mL I型膠原質(zhì)凍膠（10⁷個(gè)細(xì)胞/團(tuán)）。實(shí)驗(yàn)組采用渦流的方法I型膠原質(zhì)凍膠成凝膠之前與細(xì)胞混合，放在培養(yǎng)箱中15分鐘后成凝膠。兩組加入正常完全培養(yǎng)基后分別培養(yǎng)7天，14天和21天。

（2）檢測(cè)指標(biāo)

①細(xì)胞增殖；

②軟骨相關(guān)蛋白GAG檢測(cè)；

③番紅O染色；

④RT-PCR檢測(cè)COL2A1，COL1A1，SOX9，COL10，ACAN mRNA的表達(dá)。

（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

①細(xì)胞增殖情況

運(yùn)用DNA法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，細(xì)胞增殖情況約佳，OD值約高。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)兩組細(xì)胞均有所增長(zhǎng)，其中，誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖比對(duì)照組更高（P<0.05）。

結(jié)果見表1。

*代表P<0.05

②軟骨相關(guān)蛋白GAG檢測(cè)

與對(duì)照組比較，經(jīng)過I型膠原質(zhì)凍膠誘導(dǎo)后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有像軟骨細(xì)胞分化的傾向，且軟骨相關(guān)蛋白明顯提高（P < 0. 05）。

結(jié)果見表2。

*代表P<0.05

③番紅O染色

番紅O染色可以間接反應(yīng)軟骨相關(guān)多糖蛋白的表達(dá)量。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在經(jīng)過I型膠原質(zhì)凍膠誘導(dǎo)后，出現(xiàn)深染的陽(yáng)性表達(dá)區(qū)，見圖2，表明I型膠原質(zhì)凍膠有誘導(dǎo)軟骨形成的能力。

④RT-PCR檢測(cè)COL2A1，COL1A1，SOX9，COL10，ACAN mRNA的表達(dá)

誘導(dǎo)組中COL2A1，SOX9和ACAN表達(dá)量隨著時(shí)間的增加而增高，且均高于對(duì)照組（p<0.05），而COL1A1和COL10并無(wú)較高的表達(dá)且結(jié)果與對(duì)照組無(wú)明顯的差異。

結(jié)果見表3。

*代表P<0.05

結(jié)論：

I型膠原質(zhì)凍膠可以在不加任何生長(zhǎng)因子和誘導(dǎo)液的情況下，有誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化的能力，可做為誘導(dǎo)軟骨和軟骨修復(fù)的材料。