本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于混合模式的擴(kuò)張床吸附分離人血白蛋白方法。

背景技術(shù)：

人血白蛋白是人體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占血漿蛋白60％，主要生理功能是維持血漿滲透壓，結(jié)合以及運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)。臨床用于治療失血性休克、創(chuàng)傷性休克、急性血容量減少和低白蛋白血癥等。還可作為細(xì)胞培養(yǎng)的添加成分、藥物輔劑、賦形劑等，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

臨床使用的人血白蛋白產(chǎn)品主要是從人源血漿中提取純化，制備方法包括冷乙醇沉淀、硫酸銨沉淀、利凡諾沉淀、辛酸鹽沉淀等，過程繁雜，且不能排除病毒或其它潛在致病因子的影響。利用現(xiàn)代生物技術(shù)構(gòu)筑表達(dá)重組人血白蛋白的酵母細(xì)胞，可避免病毒感染，解決血源供應(yīng)緊張等問題，具有良好的應(yīng)用前景。但是，藥用人血白蛋白的純度要求高，而酵母發(fā)酵液組分復(fù)雜，含有蛋白酶、雜蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖及熱原物質(zhì)等多種雜質(zhì)，必須采用多步層析方法才能去除。

酵母發(fā)酵液，一般先要去除酵母細(xì)胞，然后取上清液進(jìn)行后續(xù)分離純化。專利CN1127299A和US5521287利用加熱、稀釋、調(diào)酸、陽離子交換層析、疏水作用層析、金屬螯合層析、陰離子交換層析、硼酸鈣沉淀等步驟，得到純度較高的人血白蛋白。專利CN1934128A公開了一種在二價(jià)陽離子存在下通過加熱處理制備人血白蛋白的方法，可選擇性凝集來源于宿主的雜質(zhì)。專利CN1406246A中公開了包括加熱處理步驟的人血白蛋白的制造方法，通過在宿主細(xì)胞蛋白等電點(diǎn)附近pH下進(jìn)行加熱處理，可有效去除宿主細(xì)胞蛋白。專利US5962649用陽離子交換擴(kuò)張床吸附替代陽離子交換層析，可以處理含酵母細(xì)胞的發(fā)酵液，縮短了工藝。不過，蛋白捕獲階段采用陽離子交換方法，料液需要調(diào)酸至pH 4.0和稀釋，酸性環(huán)境容易激活蛋白酶，導(dǎo)致人血白蛋白的降解，稀釋使得目標(biāo)物濃度下降，吸附容量降低，處理量增大，過程時(shí)間延長。針對酵母發(fā)酵液的特點(diǎn)，提高人血白蛋白的捕獲效率，開發(fā)一種無需去除酵母吸附、近中性pH下吸附、高選擇性、具有耐鹽吸附特性的分離新方法，將有助于簡化人血白蛋白的分離工藝，提高效率，節(jié)約成本。

擴(kuò)張床吸附利用獨(dú)特設(shè)計(jì)的擴(kuò)張床和吸附劑，在向上液流的作用下床層適度膨脹，吸附劑顆粒形成穩(wěn)定的分級分布，細(xì)胞或細(xì)胞碎片等固體小顆?？梢灾苯哟┻^床層，而目標(biāo)物被吸附劑捕獲。擴(kuò)張床吸附突破了常規(guī)層析的局限性，可以直接處理含固體顆粒的復(fù)雜料液，實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞培養(yǎng)液中直接捕獲目標(biāo)物，將固液分離、濃縮和初步純化集成于一個(gè)單元，減少分離步驟，提高分離效率?；旌夏Ｊ綄游鍪且环N新型的生物分離技術(shù)，配基兼有多種功能基團(tuán)，可以與目標(biāo)蛋白產(chǎn)生多種相互作用，主要是疏水和靜電相互作用?；旌夏Ｊ轿絼┑呐浠芏韧ǔ］^高，吸附容量大，具有耐鹽吸附特性，可以通過靜電相吸來強(qiáng)化吸附，也可以通過靜電排斥來協(xié)助解吸，洗脫條件溫和，特別適合于大規(guī)模的分離純化，已在抗體等蛋白的分離純化中得到應(yīng)用。本發(fā)明充分結(jié)合擴(kuò)張床吸附和混合模式層析的特點(diǎn)，篩選合適的混合模式擴(kuò)張床吸附劑，直接從酵母發(fā)酵液中捕獲人血白蛋白，開發(fā)一種基于混合模式的擴(kuò)張床吸附分離人血白蛋白方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于混合模式的擴(kuò)張床吸附分離人血白蛋白方法，具體包括如下步驟：

1)取含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至5～20mM，68℃加熱30min滅活蛋白酶，得到人血白蛋白粗品溶液；

2)混合模式吸附劑裝填到擴(kuò)張床中，平衡緩沖液預(yù)平衡，達(dá)到1.8～2.5倍膨脹率，保持20分鐘；

3)調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0～6.0，上樣到擴(kuò)張床中，平衡緩沖液沖洗，沖洗緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫緩沖液，得到人血白蛋白溶液；

4)將人血白蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于95％的人血白蛋白；

所述的含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液為畢赤酵母、漢遜酵母或釀酒酵母表達(dá)重組人血白蛋白的發(fā)酵液；所述的混合模式吸附劑的基質(zhì)為添加有增重劑的多孔微球，增重劑包括石英砂、鈦白粉、碳化鎢粉末，多孔微球包括瓊脂糖微球、纖維素微球、聚丙烯酰胺微球；所述的混合模式吸附劑的功能配基為色氨酸及其衍生物，包括L-色氨酸、L-色氨酸甲酯、L-色氨酸乙酯、5-羥基-L-色氨酸、N-乙酰-L-色氨酸、色胺和4-(1H-吲哚-2-基)苯胺等；所述的平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值為5.0～6.0；所述的沖洗緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH值為7.0～8.0；所述的洗脫緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH值為3.5～4.5；所述的步驟3)中的沖洗緩沖液的沖洗體積為5-20倍柱體積；所述的步驟1)中酵母發(fā)酵液pH值和步驟3)人血白蛋白粗品溶液的pH調(diào)節(jié)所用酸溶液為乙酸或檸檬酸，所用堿溶液為氫氧化鈉溶液。

本發(fā)明針對酵母發(fā)酵液組分復(fù)雜、pH中性、電導(dǎo)較高的特點(diǎn)，結(jié)合擴(kuò)張床吸附和混合模式層析的優(yōu)勢，采用混合模式擴(kuò)張床吸附劑直接處理含酵母細(xì)胞的發(fā)酵液，充分利用擴(kuò)張床吸附直接處理含細(xì)胞料液的特點(diǎn)，以及混合模式吸附容量大、選擇性好、具有耐鹽特性、洗脫條件溫和等優(yōu)勢，簡化分離步驟，提高分離效率，得到一個(gè)從酵母發(fā)酵液中擴(kuò)張床吸附直接分離人血白蛋白的新方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1)采用獨(dú)特的擴(kuò)張床吸附模式，發(fā)酵液無需去除酵母細(xì)胞，直接用于人血白蛋白分離，簡化預(yù)處理步驟，提高分離效率；2)采用特殊的混合模式吸附劑，對人血白蛋白的吸附選擇性高，單步層析純度高達(dá)95％以上，宿主細(xì)胞蛋白和色素去除率達(dá)90％左右；3)在pH 5.0～6.0條件下實(shí)現(xiàn)吸附，減小酸性環(huán)境下蛋白酶對人血白蛋白的降解；4)具有耐鹽吸附的特性，料液無需調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，直接上樣；5)利用靜電排斥作用實(shí)現(xiàn)有效洗脫，洗脫條件溫和，人血白蛋白的回收率達(dá)到85％以上；6)吸附容量大，過程處理量大，工藝簡單，易于放大。

附圖說明

附圖1是本發(fā)明混合模式擴(kuò)張床吸附分離人血白蛋白的高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種基于混合模式的擴(kuò)張床吸附分離人血白蛋白方法。取含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液，加入辛酸鈉，加熱，滅活蛋白酶，直接通過混合模式擴(kuò)張床進(jìn)行分離，得到人血白蛋白。本發(fā)明方法得到的人血白蛋白純度大于95％。

從酵母發(fā)酵液中直接分離人血白蛋白的方法包括如下步驟：

1)取含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至5～20mM，68℃加熱30min滅活蛋白酶，得到人血白蛋白粗品溶液；

2)混合模式吸附劑裝填到擴(kuò)張床中，平衡緩沖液預(yù)平衡，達(dá)到1.8～2.5倍膨脹率，保持20分鐘；

3)調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0～6.0，上樣到擴(kuò)張床中，平衡緩沖液沖洗，沖洗緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對應(yīng)的洗脫緩沖液，得到人血白蛋白溶液；

4)將人血白蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于95％的人血白蛋白；

所述的含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液為畢赤酵母、漢遜酵母或釀酒酵母表達(dá)重組人血白蛋白的發(fā)酵液；所述的混合模式吸附劑的基質(zhì)為添加有增重劑的多孔微球，增重劑包括石英砂、鈦白粉、碳化鎢粉末，多孔微球包括瓊脂糖微球、纖維素微球、聚丙烯酰胺微球；所述的混合模式吸附劑的功能配基為色氨酸及其衍生物，包括L-色氨酸、L-色氨酸甲酯、L-色氨酸乙酯、5-羥基-L-色氨酸、N-乙酰-L-色氨酸、色胺和4-(1H-吲哚-2-基)苯胺等；所述的平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值為5.0～6.0；所述的沖洗緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH值為7.0～8.0；所述的洗脫緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH值為3.5～4.5；所述的步驟3)中的沖洗緩沖液的沖洗體積為5-20倍柱體積；所述的步驟1)中酵母發(fā)酵液pH值和步驟3)人血白蛋白粗品溶液的pH調(diào)節(jié)所用酸溶液為乙酸或檸檬酸，所用堿溶液為氫氧化鈉溶液。

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，實(shí)施例中除特殊說明外所有pH調(diào)節(jié)溶液均為乙酸或氫氧化鈉：

實(shí)施例1

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至5mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加石英砂為增重劑的瓊脂糖微球、L-色氨酸為配基)裝填到內(nèi)徑為1cm的擴(kuò)張床中，柱高約20cm，pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液預(yù)平衡，達(dá)到2.0倍膨脹率，保持20分鐘；調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上樣10ml。經(jīng)平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.5)沖洗10倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.0)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為96.3％，收率為89.6％，宿主蛋白和色素去除率分別為90.2％和89.0％。其中附圖1是本發(fā)明混合模式擴(kuò)張床吸附分離人血白蛋白的高效液相色譜圖。

實(shí)施例2

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至10mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附劑(添加鈦白粉為增重劑的瓊脂糖微球、L-色氨酸甲酯為配基)裝填到內(nèi)徑為1cm的擴(kuò)張床中，柱高約20cm，pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液預(yù)平衡，達(dá)到1.8倍膨脹率，保持20分鐘；調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.5，上樣10ml。經(jīng)平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)沖洗5倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 3.5)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為95.0％，收率為86.7％，宿主蛋白和色素去除率分別為90.5％和89.1％。

實(shí)施例3

取含有重組人血白蛋白的漢遜酵母發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至15mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加碳化鎢為增重劑的瓊脂糖微球、L-色氨酸乙酯為配基)裝填到內(nèi)徑為1cm的擴(kuò)張床中，柱高約20cm，pH 6.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液預(yù)平衡，達(dá)到2.2倍膨脹率，保持20分鐘；調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至6.0，上樣10ml。經(jīng)平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 8.0)沖洗15倍柱體積，20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為96.1％，收率為89.2％，宿主蛋白和色素去除率分別為89.7％和90.1％。

實(shí)施例4

取含有重組人血白蛋白的漢遜酵母發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至15mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加石英砂為增重劑的聚丙烯酰胺微球、5-羥基-L-色氨酸為配基)裝填到內(nèi)徑為1cm的擴(kuò)張床中，柱高約20cm，pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液預(yù)平衡，達(dá)到2.2倍膨脹率，保持20分鐘；調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上樣10ml。經(jīng)平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)沖洗20倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.0)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為97.7％，收率為90.5％，宿主蛋白和色素去除率分別為91.3％和92.2％。

實(shí)施例5

取含有重組人血白蛋白的釀酒酵母發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至10mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加碳化鎢為增重劑的聚丙烯酰胺微球、N-乙酰-L-色氨酸為配基)裝填到內(nèi)徑為1cm的擴(kuò)張床中，柱高約20cm，pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液預(yù)平衡，達(dá)到2.0倍膨脹率，保持20分鐘；調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上樣10ml。經(jīng)平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.5)沖洗10倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.0)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為96.5％，收率為91.5％，宿主蛋白和色素去除率分別為89.3％和93.1％。

實(shí)施例6

取含有重組人血白蛋白的釀酒酵母發(fā)酵液，調(diào)節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至20mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加石英砂為增重劑的纖維素微球、色胺為配基)裝填到內(nèi)徑為1cm的擴(kuò)張床中，柱高約20cm，pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液預(yù)平衡，達(dá)到2.5倍膨脹率，保持20分鐘；調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.5，上樣10ml。經(jīng)平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH7.0)沖洗10倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.0)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為95.4％，收率為85.6％，宿主蛋白和色素去除率分別為90.3％和89.2％。實(shí)施例7

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，用檸檬酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至15mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加石英砂為增重劑的聚丙烯酰胺微球、4-(1H-吲哚-2-基)苯胺為配基)裝填到內(nèi)徑為1cm的擴(kuò)張床中，柱高約20cm，pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液預(yù)平衡，達(dá)到2.2倍膨脹率，保持20分鐘；調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上樣10ml。經(jīng)平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)沖洗10倍柱體積，20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.0)洗脫15倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為96.7％，收率為85.5％，宿主蛋白和色素去除率分別為90.6％和90.2％。