本申請要求于2015年12月11日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/266,432的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過整體引用結(jié)合以用于所有目的。

背景技術(shù)：

對許多基材的聚合物官能化對于它們的應用來說是至關(guān)重要的，所述基材包括蛋白質(zhì)、納米粒子、固體表面、水凝膠等。例如，由聚合物官能化的蛋白質(zhì)提供的蛋白質(zhì)-聚合物綴合物已經(jīng)廣泛用作治療劑，如PEG基化的(PEGylated)蛋白質(zhì)。然而，現(xiàn)有的聚合物綴合方法通常制備的官能化的基材具有與反應部位綴合的單一聚合物鏈。將兩種以上不同的個體聚合物鏈綴合到基材的相同反應部位(以形成所謂的雜臂聚合物、或星形聚合物，其每個具有核心，擁有附接到核心的不同聚合物鏈的“臂”)是有挑戰(zhàn)性的，但對于制造具有多種綴合的聚合物鏈的組合性能的高度官能化的材料來說卻是有力的。例如，兩種聚合物鏈可以綴合到治療性蛋白的同一活性反應部位，其中一種鏈延長蛋白的半衰期并且另一種鏈靶向患病部位。這可以潛在顯著地增加藥物功效。目前在常規(guī)使用中，不存在方便地將多種不同的聚合物鏈綴合到單一反應部位的方法。本發(fā)明致力于這點和其他相關(guān)需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了可以用于快速且高效的化學綴合方法的新型方法和組合物，其可以應用于包括聚合物或小分子的改性、連接和綴合在內(nèi)的各種各樣的應用。這種方法還可以用于制造粘合劑材料如水凝膠。

在第一方面中，本發(fā)明提供使用兒茶酚官能化的化合物和硫脲官能化的二化合物聚合物(例如，方案1中所示的R₁-NCSN-R₂)制備多化合物化學結(jié)構(gòu)的方法。所述方法包括這些步驟：(a)在氧化劑的存在下，將所述兒茶酚官能化的化合物(例如，方案1中的R₃-Cat)氧化，以形成相應的氧化的兒茶酚官能化的化合物；以及(b)將所述氧化的兒茶酚官能化的化合物與所述硫脲官能化的二化合物聚合物綴合，以形成兒茶酚綴合的三化合物聚合物(例如，方案1中的R₁-NCSN-R₂-Cat-R₃)。在一些實施方案中，所述方法在步驟(b)之后還包括步驟(c)：在氧化條件下，將至少一種硫醇官能化的化合物(例如，方案1中的R₄-SH或R₅-SH)綴合到所述兒茶酚綴合的三化合物聚合物，以形成多化合物化學結(jié)構(gòu)。在一些情況中，在步驟(c)中將兩種不同的硫醇官能化的化合物(例如，方案1中的R₄-SH和R₅-SH)綴合到所述兒茶酚綴合的三化合物聚合物，以形成多化合物化學結(jié)構(gòu)(例如，方案1中的R₁-NCSN-R₂-Cat-R₃-R₄和R₁-NCSN-R₂-Cat-R₃-R₄-R₅)。在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(a)之前的步驟：將兒茶酚分子附接到化合物，以形成所述兒茶酚官能化的化合物。在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(a)之前的步驟：在胺-異硫氰酸酯反應中將具有胺基的化合物與具有異硫氰酸酯基的另一種化合物反應，以形成硫脲官能化的二化合物聚合物。

在一些實施方案中，以上和在本文中描述的方法的步驟(b)在有機溶劑或水性溶劑的存在下進行。在一些實施方案中，以上和在本文中描述的方法的步驟(b)在約1至約14的pH下，更優(yōu)選在約2至7、或約2至5、或約2.0的pH下進行。在一些實施方案中，氧化劑選自由下列各項組成的組；NaIO4、KIO4、NaMnO4、KMnO4、Na2Cr2O7、K2Cr2O7、CrO3、和蘑菇酪氨酸酶(Mushroom Tyrosinase)。在一些實施方案中，在步驟(b)中，氧化劑與兒茶酚官能化的化合物的比率在0.5至9999之間。

所要求保護的方法的一般示意圖在以下方案1中示出，其中R₁、R₂、R₃、R₄、和R₅獨立地彼此相同或不同，R₁、R₂、R₃、R₄、和R₅中的每一個獨立地為小分子、聚合物、大分子(如蛋白質(zhì)、多核苷酸、脂質(zhì)等)、納米粒子、或固體材料的表面。R₁、R₂、R₃、R₄、和R₅中的任一個均可以是自然存在的或合成性質(zhì)的化合物。

方案1.制備雜臂聚合物官能化的結(jié)構(gòu)的一般過程

在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供可以在以上和在本文中描述的方法的不同階段期間存在的各種組合物。第一，本發(fā)明提供一種組合物，其包含氧化的兒茶酚官能化的化合物和硫脲官能化的二化合物聚合物(例如，方案1中所示的R₁-NCSN-R₂)。第二，本發(fā)明提供一種組合物，其包含至少一種硫醇官能化的化合物(例如，方案1中的R₄-SH或R₅-SH)和兒茶酚綴合的三化合物聚合物(例如，方案1中的R₁-NCSN-R₂-Cat-R₃)。在一些情況中，在組合物中存在兩種不同的硫醇官能化的化合物(例如，方案1中的R₄-SH和R₅-SH)。

在第二方面中，本發(fā)明提供由以上和在本文中描述的方法制備的多化合物化學結(jié)構(gòu)。多化合物化學結(jié)構(gòu)包含兒茶酚核心和多種共價連結(jié)至所述兒茶酚核心的化合物。在一些實施方案中，多化合物化學結(jié)構(gòu)包含共價連結(jié)至兒茶酚核心的至少3或4種不同的化合物。在一些情況中，多化合物化學結(jié)構(gòu)具有共價連接至兒茶酚核心的5種不同的化合物(例如，如方案1中示出的R₁、R2、R₃、R₄、和R₅)。在一些實施方案中，所述多種化合物中的每一種獨立地為小分子、聚合物、大分子、納米粒子、或固體材料的表面。這些化合物可以是合成的或自然存在的。例如，化合物可以是聚合物如聚酰胺、聚酯、明膠、和透明質(zhì)酸。

在第三方面中，本發(fā)明提供使用兒茶酚官能化的化合物和多臂交聯(lián)劑制備兒茶酚綴合的聚合物的新型方法，所述方法包括下列步驟：(a)在氧化劑的存在下將所述兒茶酚官能化的化合物氧化，以形成相應的氧化的兒茶酚官能化的化合物；以及(b)將所述氧化的兒茶酚官能化的化合物與所述多臂交聯(lián)劑綴合，以形成相應的兒茶酚綴合的聚合物。在一些實施方案中，所述氧化劑選自由下列各項組成的組：NaIO₄、KIO₄、NaMnO₄、KMnO₄、Na₂Cr₂O₇、K₂Cr₂O₇、CrO₃、和蘑菇酪氨酸酶。

在一些實施方案中，制備兒茶酚綴合的聚合物的方法還包括在步驟(a)之前的步驟：將兒茶酚附接到分子，以形成相應的兒茶酚官能化的化合物。在一些實施方案中，制備兒茶酚綴合的聚合物的方法還包括將不同結(jié)構(gòu)的兒茶酚官能化的化合物綴合。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供制備兒茶酚綴合的聚合物的方法，所述方法還包括在水性或有機溶劑的存在下進行所述步驟(b)綴合。在一些實施方案中，溶劑是水。在一些實施方案中，制備兒茶酚綴合的聚合物的方法還包括在1至14之間的pH下進行所述步驟(b)綴合。在一些實施方案中，步驟(b)在約1至12之間的pH下進行。在一些實施方案中，步驟(b)在約1至8之間的pH下進行。在一些實施方案中，步驟(b)在約2至7的pH下進行。在一些情況中，步驟(b)在約2.0的pH下進行。

在一些實施方案中，制備兒茶酚綴合的聚合物的方法還包括以在0.5至9999、或0.5至5999、或0.5至1999、或0.5至999、或0.5至599、或0.5至199、或0.5至99、或0.5至59、或0.5至19、或0.5至9之間的氧化劑與兒茶酚官能化的化合物的比率進行所述步驟(b)綴合。

在第四方面中，本發(fā)明提供上述兒茶酚綴合的聚合物，其包含至少一種多臂交聯(lián)劑并且連接多種兒茶酚官能化的化合物。在一些實施方案中，所述兒茶酚官能化的化合物還包含附接到分子的兒茶酚。在一些實施方案中，所述兒茶酚官能化的化合物還包含經(jīng)由連接體附接到分子的兒茶酚。

在一些實施方案中，所述分子是小分子或聚合物。在一些情況中，所述分子是合成的或天然的聚合物。在一些情況中，所述分子選自由下列各項組成的組：聚酰胺、聚酯、明膠、和透明質(zhì)酸。在一些情況中，所述分子是明膠。在一些實施方案中，所述連接體還包含至少一個硫原子。在一些情況中，連接體還包含至少一個可以用于參與兒茶酚官能化的化合物向多臂交聯(lián)劑的附接的硫原子。在一些情況中，所述連接體還包含至少一個硫脲基團。在一些情況中，所述兒茶酚官能化的化合物是Gel-NCSN-cat。在一些情況中，所述兒茶酚官能化的化合物是Gel-cat。

在一些實施方案中，多臂交聯(lián)劑包含具有多個允許與化合物連接的官能化部分的分子。在一些情況中，結(jié)構(gòu)段是聚(乙二醇)(PEG)，其中所述PEG的分子量是100至1,000,000。在一些情況中，所述PEG的分子量是1000至1,000,000。在一些情況中，所述PEG的分子量是1000至100,000。在一些情況中，所述PEG的分子量是1000至50,000。在一些情況中，所述PEG的分子量是1000至10,000。在一些情況中，所述PEG的分子量是1000至5,000。在一些情況中，所述多臂交聯(lián)劑還包含至少一個含有硫原子的官能化部分。在一些情況中，多臂交聯(lián)劑還包含至少一個可以用于參與兒茶酚官能化的化合物向多臂交聯(lián)劑的附接的硫原子。在一些情況中，所述多臂交聯(lián)劑還包含至少一個含有硫脲基團的官能化部分。在一些情況中，多臂交聯(lián)劑對于每個臂來說包含至少一個硫脲基團。在一些情況中，所述多臂交聯(lián)劑是硫脲官能化的4臂聚(乙二醇)交聯(lián)劑(4臂-PEG-NCSN)。在一些情況中，所述多臂交聯(lián)劑是氨基官能化的4臂聚(乙二醇)交聯(lián)劑(4臂-PEG-NH₂)。

在第五方面中，本發(fā)明提供兒茶酚綴合的聚合物形式的示例性的上述雜臂聚合物官能化的結(jié)構(gòu)，如兒茶酚綴合的水凝膠，其能夠在被剪切至失效(failure)后恢復粘附性。在一些實施方案中，粘附性的恢復在約0至約14之間的pH下進行。在一些實施方案中，粘附性的恢復在約1至約14之間的pH下進行。在一些實施方案中，粘附性的恢復在約1至約12之間的pH下進行。在一些實施方案中，粘附性的恢復在約1至約8之間的pH下進行。在一些實施方案中，粘附性的恢復在約2至約8，例如約2至約7、或約2至約7之間的pH下進行。在一些情況中，粘附性的恢復在約2.0的pH下進行。如在本文中所使用的，“約”是指參考值的+/-10％。

在第六方面中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含上述兒茶酚官能化的化合物和氧化劑。

在第七方面中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含上述氧化的兒茶酚官能化的化合物和一種或多種多臂交聯(lián)劑。

在第八方面中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含兒茶酚分子和綴合上述連接體的化合物。

附圖說明

圖1A和1B示出了對通過Gel-NCSN-cat和Gel-cat形成的水凝膠的凝膠化行為和機械性能的研究。圖1A示出了作為從0.5至6的NaIO₄/兒茶酚比率的函數(shù)的Gel-cat(紅)和Gel-NCSN-cat(藍)水凝膠的固化時間(插圖)和儲存模量。(*在NaIO₄/兒茶酚低于1的情況下，Gel-NCSN-cat不能形成水凝膠)。圖1B示出了作為從2至10的pH的函數(shù)的Gel-cat(紅)和Gel-NCSN-cat(藍)水凝膠的固化時間(插圖)和儲存模量。(*Gel-cat在低pH水平下不能形成水凝膠，并且僅可以在pH＝6以上得到流變性數(shù)據(jù))。

圖2示出了提出的在自然界和生物合成聚合物(利用/不利用人造mfp-6)中的反應途徑(a)兒茶酚氧化為醌(b)醌進一步與未氧化的兒茶酚反應以形成二兒茶酚交聯(lián)劑(c)二兒茶酚進一步與PEG-NH2反應(d)醌迅速與硫脲改性的PEG-NCSN反應。

圖3示出了Gel-cat的氧化(NaIO₄∶cat＝1∶1，pH＝6.0)的UV-vis光譜。在加入NaIO₄之后立即掃描溶液。箭頭表示光譜隨時間向前。

圖4示出了Gel-cat和PEG-NH₂的氧化(NaIO₄∶cat＝1∶1，pH＝6.0)的UV-vis光譜。在加入NaIO₄之后立即掃描溶液。箭頭表示光譜隨時間向前。

圖5示出了Gel-cat和PEG-NCSN的氧化(NaIO₄∶cat＝1∶1，pH＝6.0)的UV-vis光譜。在加入NaIO₄之后立即掃描溶液。箭頭表示光譜隨時間向前。

圖6A和6B示出了兒茶酚綴合的聚合物的搭接-剪切(lap-shear)粘附強度。圖6A示出了通過PEG-NCSN(pH＝2.0/7.4)和PEG-NH₂(pH＝7.4)交聯(lián)的Gel-cat水凝膠的搭接-剪切粘附強度(n＝3)。插圖示出了峰粘附應力。圖6B示出了通過PEG-NCSN(pH＝2.0/7.4)和PEG-NH₂(pH＝7.4)交聯(lián)的Gel-cat水凝膠的粘附性恢復。將恢復的粘合強度歸一化為初始粘合強度并且以百分比(％)的形式給出(n＝3)。

圖7示出了在存在和不存在硫脲的情況下以及在不同pH范圍下的兒茶酚綴合的聚合物的相對粘附性。

發(fā)明詳述

I.定義

在本公開中，術(shù)語“兒茶酚”當單獨使用或以“兒茶酚官能化的”或“兒茶酚綴合的”的形式時，廣泛包括苯二酚的全部三種鄰位異構(gòu)體：(1)作為常規(guī)命名的化合物的兒茶酚，也被稱為焦兒茶酚或1，2-二羥基苯；(2)間苯二酚，或1，3-二羥基苯；和(3)氫醌，或1，2-二羥基苯?；衔锟梢愿浇拥轿幢粌蓚€羥基占據(jù)的苯環(huán)的任何碳，從而成為“兒茶酚官能化的化合物”或“兒茶酚綴合的化合物”。例如，R₃部分可以連接到在3至6位的碳中的任一個，優(yōu)選在4或5位。

如在本文中所使用的，術(shù)語“兒茶酚綴合的聚合物”是指通過交聯(lián)劑如多臂交聯(lián)劑綴合的多種兒茶酚官能化的化合物。兒茶酚官能化的化合物可以是相同或不同的結(jié)構(gòu)。兒茶酚綴合的聚合物的實例包括：水凝膠、有機凝膠以及其他聚合物網(wǎng)絡(luò)。

如在本文中所使用的，術(shù)語“多臂交聯(lián)劑”是指具有多個允許化合物(包括兒茶酚官能化的化合物)的化學綴合的官能化部分的分子。多臂交聯(lián)劑還可以具有增加對所附接的官能化部分的空間可達性(accessibility)的結(jié)構(gòu)段或“臂”。例如，多臂交聯(lián)劑可以是指具有雙臂、三臂、四臂或其他多臂結(jié)構(gòu)段附接的官能化部分的分子。此外，結(jié)構(gòu)段可以是具有100至1000000的分子量的聚(乙二醇)(PEG)。例如，多臂交聯(lián)劑可以是氨基官能化的4臂聚(乙二醇)交聯(lián)劑(4臂-PEG-NH₂)。此外，多臂交聯(lián)劑還可以具有含有硫原子的官能化部分。多臂交聯(lián)劑還可以具有包括硫脲基團的官能化部分。多臂交聯(lián)劑還可以具有全部為硫脲基團的官能化部分。例如，多臂交聯(lián)劑可以是硫脲官能化的4臂聚(乙二醇)交聯(lián)劑(4臂-PEG-NCSN)。

如在本文中所使用的術(shù)語“氧化劑”和“氧化物”包括具有將其他化合物(特別是兒茶酚)氧化的能力的大范圍的化合物。術(shù)語氧化物包括但不限于金屬氧化物如堿土和過渡金屬氧化物。術(shù)語氧化物還包括生物氧化劑。示例性的氧化劑包括NaIO₄、KIO₄、NaMnO₄、KMnO₄、Na₂Cr₂O₇、K₂Cr₂O₇、CrO₃、和蘑菇酪氨酸酶。

如在本文中所使用的，術(shù)語“兒茶酚官能化的化合物”是指附接到兒茶酚的分子。分子可以通過連接體附接到兒茶酚。術(shù)語分子可以是小分子和包括聚合物在內(nèi)的大分子。在兒茶酚官能化的化合物的合成中使用的分子包括但不限于：合成的和天然的聚合物，如聚酰胺；聚酯；明膠；凝膠；透明質(zhì)酸等。連接體還可以含有硫原子。連接體還可以含有硫脲基團。例如，兒茶酚官能化的化合物可以是Gel-NCSN-cat或Gel-cat。

如在本文中所使用的，術(shù)語“在剪切失效后恢復粘附性”是指聚合物在被搭接剪切測試至失效后恢復粘附性的能力?？梢栽谕ㄓ脺y試機上以1mm/min的速度在環(huán)境條件下測試到達失效的搭接剪切。還可以在酸性pH下在剪切失效之后測量粘附性的恢復。聚合物的粘附性恢復可以在0至100％，例如10至90％、20至80％、25至75％、或30至50％之間的范圍內(nèi)。

II.兒茶酚綴合的聚合物的制備

A.通用

本發(fā)明提供了可以用于快速、不依賴pH且高效的化學綴合方法的新方法和組合物，其可以應用于包括大分子或小分子的改性、連接、和綴合在內(nèi)的各種各樣的應用。尤其是，這種方法可以用于制備雜臂聚合物或制造粘合劑材料如水凝膠。例如，本發(fā)明提供通過以下方式使用兒茶酚官能化的化合物和多臂交聯(lián)劑制備兒茶酚綴合的聚合物的新型方法：在氧化劑的存在下將兒茶酚官能化的化合物氧化，以形成相應的氧化的兒茶酚官能化的化合物；以及將氧化的兒茶酚官能化的化合物與多臂交聯(lián)劑綴合以形成相應的兒茶酚綴合的聚合物。此外，硫原子以及硫脲基團與多臂交聯(lián)劑和/或兒茶酚官能化的化合物的結(jié)合導致在兒茶酚綴合的聚合物中兒茶酚對氧化的增強的穩(wěn)定性，導致粘附性的明顯提高。兒茶酚官能化的化合物可以是相同或不同的結(jié)構(gòu)。

此外，本發(fā)明提供用于制備新型水凝膠粘合劑的方法。例如，可以使用硫脲官能化的聚合物模擬mfp-6的功能以用于制備粘合劑水凝膠。不同于通常在堿性條件下反應的天然存在的親核體如半胱氨酸(pKa＝8-9)，^13、18已知硫脲(pKa＝-1)¹⁹衍生物由于低pKa值在酸性條件下對兒茶酚衍生物具有反應性。²⁰硫脲基團起出色親核體的作用以在酸性條件下與兒茶酚綴合的結(jié)構(gòu)形成交聯(lián)，導致快速形成水凝膠。歸因于硫脲的高還原能力，在所得水凝膠粘合劑中兒茶酚針對氧化的穩(wěn)定性明顯增強，因此導致粘附性的明顯提高。

B.兒茶酚官能化的化合物的組分和制備

本發(fā)明的兒茶酚官能化的化合物包含經(jīng)由連接體附接到兒茶酚的分子?？梢酝ㄟ^經(jīng)由連接體將兒茶酚分子附接到化合物合成兒茶酚官能化的化合物。

在兒茶酚官能化的化合物的合成中使用的分子包括，但不限于聚酰胺、聚酯、明膠、和透明質(zhì)酸。在一些實施方案中，選擇明膠，一種源自膠原蛋白的多肽的混合物，作為在兒茶酚官能化的化合物的合成中使用的分子。在一些實施方案中，選擇水凝膠作為在兒茶酚官能化的化合物的合成中使用的分子。

水凝膠是親水性的天然或合成聚合物鏈的網(wǎng)絡(luò)或支架，有時以其中水是分散介質(zhì)的膠體狀凝膠的形式存在。作為具有高吸水能力的聚合物網(wǎng)絡(luò)，水凝膠通常嚴格模擬天然的細胞外基質(zhì)。歸因于較高的水含量，水凝膠還傾向于擁有與天然組織非常相似的柔韌度：在一些情況中，水凝膠可以含有遠遠超過90％的水。在水凝膠中使用的常用成分包括聚乙烯醇、聚丙烯酸鈉、丙烯酸酯聚合物和具有大量親水基團的共聚物。正在研究天然水凝膠材料以用于組織工程；這些材料包括瓊脂糖、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、和其他天然來源的聚合物。示例性的水凝膠可以發(fā)現(xiàn)于美國專利號8,329,763；8,008,476；6,534,083；4,438,258；美國專利申請?zhí)?013/0,034,592；2013/0,022,569；2002/0,009,591；和國際專利公布號WO/2001/049240；和WO/1997/030092。

可以以多種方式合成兒茶酚官能化的化合物，包括通過常規(guī)的碳二亞胺偶聯(lián)^1、21或異硫氰酸酯-胺偶聯(lián)使含有兒茶酚的分子與含有胺的化合物反應。例如，可以通過在堿性條件下在室溫下使胺基(-NH₂)與異硫氰酸酯基(-N＝C＝S)反應得到異硫脲基團(-NH-C(＝S)-NH-、或-NCSN-)來合成兒茶酚官能化的化合物(參見方案1)。在氧化條件(高碘酸鈉，與兒茶酚基團等摩爾比)下，兒茶酚基團在寬pH范圍下迅速與-NCSN-基團反應。

C.多臂交聯(lián)劑的組分和制備

本發(fā)明使用具有多個與官能化部分連接的結(jié)構(gòu)段(或臂)的多臂交聯(lián)劑。在一些實施方案中，多臂交聯(lián)劑是指兩臂、三臂、四臂或其他多臂衍生物。在一些情況中，結(jié)構(gòu)段可以具有包含一個或多個聚(乙二醇)(PEG)鏈的支鏈或直鏈結(jié)構(gòu)，其中所述PEG的分子量是100至1000000。在一些情況中，多臂交聯(lián)劑可以具有含有硫原子的官能化部分。在一些情況中，多臂交聯(lián)劑可以具有硫脲基團。在一些情況中，多臂交聯(lián)劑對于每個臂來說可以具有硫脲基團。多臂交聯(lián)劑可以是硫脲官能化的4臂聚(乙二醇)交聯(lián)劑(4臂-PEG-NCSN)。此外，多臂交聯(lián)劑可以是氨基官能化的4臂聚(乙二醇)交聯(lián)劑(4臂-PEG-NH₂)。

在本發(fā)明中使用的多臂交聯(lián)劑中的一些，包括兩臂、三臂、四臂、六臂、和八臂，是可商購獲得的，例如Sigma-Aldrich。此外，可以以多種方式合成在本發(fā)明中使用的多臂交聯(lián)劑，包括通過使可商購獲得的多臂交聯(lián)劑經(jīng)由異硫氰酸酯-胺偶聯(lián)進一步功能化以包含硫原子或硫脲基團。例如，使4臂聚(乙二醇)-NH₂HCl與異硫氰酸甲酯和三乙胺反應得到相應的硫脲官能化的4臂交聯(lián)劑。

D.兒茶酚綴合的聚合物的組分和制備

本發(fā)明提供制備兒茶酚綴合的聚合物的新型方法。通過以下方式利用多臂交聯(lián)劑來聚合兒茶酚官能化的化合物：在氧化劑的存在下將所述兒茶酚官能化的化合物氧化，以形成氧化的兒茶酚官能化的化合物，然后，將氧化的兒茶酚官能化的化合物與多臂交聯(lián)劑綴合，以形成相應的兒茶酚綴合的聚合物。兒茶酚官能化的化合物可以是相同或不同的結(jié)構(gòu)。此外，硫原子以及硫脲基團向多臂交聯(lián)劑和/或兒茶酚官能化的化合物的合并得到在兒茶酚綴合的聚合物中兒茶酚對氧化的增強的穩(wěn)定性，導致粘附性的明顯提高。

兒茶酚綴合的聚合物可以通過下列方式合成：將兒茶酚官能化的化合物氧化以得到相應的兒茶酚官能化的化合物氧化的醌，接著引入多臂交聯(lián)劑以得到所需的兒茶酚綴合的聚合物。例如，Gel-cat的氧化得到相應的Gel-醌，其在加入4臂-PEG-NCSN時得到兒茶酚綴合的聚合物Gel-cat+PEG-NCSN。更具體地，可以通過在目標pH值下以1∶1的NaIO₄∶NCSN的比率將Gel-cat與4％PEG-NCSN/PEG-NH₂交聯(lián)來形成兒茶酚綴合的水凝膠。

此外，本發(fā)明提供雜臂聚合物的制備。雜臂聚合物，在本公開中也被稱為“多化合物化學結(jié)構(gòu)”，具有核心結(jié)構(gòu)和與核心連接并且從核心延伸的不同的化合物(例如，聚合物鏈)。因為對于每個雜臂聚合物來說存在至少兩個、可能三條、四條、五條、或更多條鏈，其中至少一些是彼此不同的(盡管一些其他的可以是相同的)，所以這些不同的化合物(在一些情況中為聚合物鏈)被稱為“雜臂”。例如，合成的雜臂聚合物可以通過順序的單部位偶聯(lián)反應容易地合成。例如，胺末端官能化的聚合物(聚合物A)與異硫氰酸酯末端官能化的聚合物(聚合物B)之間的偶聯(lián)得到聚合物綴合物(聚合物A-B)，并且異硫脲在偶聯(lián)部位。然后可以在氧化條件下將兒茶酚末端官能化的聚合物(聚合物C)與異硫脲基團偶聯(lián)，得到雜臂聚合物(聚合物A-B-C)。硫醇官能化的聚合物(聚合物D和聚合物E)可以在氧化條件下進一步與雜臂聚合物綴合以得到更復雜的結(jié)構(gòu)如聚合物A-B-C-D-E(參見方案2)。

本發(fā)明還提供充分限定的利用雜臂聚合物的表面胺的官能化?？梢酝ㄟ^雜臂聚合物將具有胺的基材表面官能化。例如，可以將異硫氰酸酯末端官能化的聚合物(聚合物A)偶聯(lián)到表面胺，得到異硫脲基團，其用于兒茶酚末端官能化的聚合物B的偶聯(lián)。可以將硫醇官能化的聚合物(聚合物C和聚合物D)在氧化條件下進一步綴合到雜臂聚合物，以在表面上得到更復雜的雜臂聚合物結(jié)構(gòu)如聚合物A-B-C-D(參見方案3)。

本發(fā)明還提供充分限定的利用雜臂聚合物的納米粒子的官能化?？梢酝ㄟ^雜臂聚合物將具有胺的粒子表面官能化。例如，可以將異硫氰酸酯末端官能化的聚合物(聚合物A)偶聯(lián)到表面胺，得到異硫脲基團，其用于兒茶酚末端官能化的聚合物B的偶聯(lián)。可以將硫醇官能化的聚合物(聚合物C和聚合物D)在氧化條件下進一步綴合到雜臂聚合物，以在納米粒子表面上得到更復雜的結(jié)構(gòu)如聚合物A-B-C-D(參見方案4)。

本發(fā)明還提供不同聚合物向蛋白質(zhì)的相同的胺的相繼綴合。可以通過雜臂聚合物將蛋白質(zhì)表面上的胺官能化。例如，可以將異硫氰酸酯末端官能化的聚合物(聚合物B)偶聯(lián)到蛋白質(zhì)(A)的表面，得到異硫脲基團，其用于兒茶酚末端官能化的聚合物C的偶聯(lián)，得到蛋白質(zhì)-聚合物綴合物A-B C。可以將硫醇官能化的聚合物(聚合物D和聚合物E)在氧化條件下進一步綴合到雜臂聚合物，以得到更復雜的結(jié)構(gòu)如蛋白質(zhì)-聚合物綴合物A-B-C-D-E(參見方案5)。

本發(fā)明還提供具有相同交聯(lián)部位的水凝膠網(wǎng)絡(luò)的相繼交聯(lián)。例如，胺官能化的4臂聚合物(聚合物A)可以與異硫氰酸酯官能化的4臂聚合物(聚合物B)形成水凝膠，在交聯(lián)部位留下異硫脲基團。兒茶酚官能化的4臂聚合物(聚合物C)之后可以通過異硫脲基團和兒茶酚基團之間偶聯(lián)使聚合物網(wǎng)絡(luò)在相同交聯(lián)部位進一步交聯(lián)(參見方案6)。

本發(fā)明還提供水凝膠在交聯(lián)部位的官能化。例如，胺官能化的4臂聚合物(聚合物A)可以與異硫氰酸酯官能化的4臂聚合物(聚合物B)形成水凝膠，在交聯(lián)部位留下異硫脲基團。兒茶酚官能化的肽(肽C)之后可以通過異硫脲基團和兒茶酚基團之間的偶聯(lián)在相同交聯(lián)部位綴合到聚合物網(wǎng)絡(luò)(參見方案7)。

III.粘附性的測量

為了測量被剪切至失效后粘附性的恢復，可以將兒茶酚綴合的聚合物搭接剪切測試至失效，然后觀察并且測量任何粘附性的恢復。兒茶酚綴合的聚合物還可以在酸性pH下在被剪切至失效后恢復粘附性。兒茶酚綴合的聚合物的粘附性恢復可以在0至100％的范圍內(nèi)。兒茶酚綴合的聚合物的粘附性恢復可以高達100％。此外，兒茶酚綴合的聚合物可以多次在被剪切至失效后恢復一些粘附性。兒茶酚綴合的聚合物也可以五次在被剪切至失效后恢復一些粘附性。

實施例

僅作為說明而不是作為限制提供以下實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會容易地認識到可以被改變或修改以產(chǎn)生基本上相同或相似的結(jié)果的多種非關(guān)鍵參數(shù)。

實施例1：作為兒茶酚官能化的化合物的Gel-cat聚合物的制備和表征

貽貝足蛋白(Mussel foot proteins，mfp)，包括mfp-1、mfp-3和mfp-5，已知是貽貝足中的出色天然粘合劑。L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)的兒茶酚側(cè)鏈是這些使得貽貝能夠緊密附接到各種表面的蛋白的關(guān)鍵組分。受這些含有L-DOPA的蛋白質(zhì)的啟發(fā)，最近已經(jīng)合成了許多帶有L-DOPA狀結(jié)構(gòu)的官能化聚合物，以模擬這樣的天然粘合劑。通常，利用DOPA或其兒茶酚類似物(例如，多巴胺)官能化的合成聚合物可以通過氧化被交聯(lián)從而形成粘合劑水凝膠。^1-4已經(jīng)提出，氧化劑引發(fā)的兒茶酚在堿性pH下的聚合是造成水凝膠形成的原因。具體地，兒茶酚首先被氧化為醌。這種中間產(chǎn)物隨后引發(fā)芳氧基自由基介導的苯酚偶聯(lián)，^2，3引起聚合物交聯(lián)和水凝膠形成。然而，由于兒茶酚結(jié)構(gòu)的喪失，這樣的醌介導的交聯(lián)不可避免降低粘附性。^5，6之前的研究已經(jīng)顯示，在堿性條件下的醌形成降低了兒茶酚官能化的水凝膠與云母、^7-9二氧化鈦¹⁰和二氧化鈦氧化物表面的粘附性。^{6、11、12}因此，為了更好地保持粘附性，應當保護兒茶酚結(jié)構(gòu)免于氧化，并且這在本質(zhì)上與模擬mfp的聚合物的交聯(lián)條件是矛盾的。^1-3

在自然界中，貽貝通過采用富含硫醇的mfp-6作為具有非常低的pK_a(pK_a＝3-4)的還原劑來克服兒茶酚氧化的負面影響^13、14。mfp-6的硫醇鹽可以在酸性pH(pH≤5)下^{7、13、16}將醌^6、13-15還原為原始兒茶酚結(jié)構(gòu)，因此恢復甚至提高向基材的粘附性。^{13、16、17}除了作為天然抗氧化劑，^{13、14、17}值得注意的是mfp-6對于提高斑塊蛋白之間的內(nèi)聚力來說也是關(guān)鍵的。^13、15鑒于此，可以在聚合物水凝膠粘合劑的結(jié)構(gòu)設(shè)計中采用“人造mfp-6”。“人造mfp-6”應當擁有三個關(guān)鍵性質(zhì)：(i)具有低pK_a，從而可以在酸性pH(pH≤5)下進行交聯(lián)，(ii)能夠?qū)Ⅴ€原為兒茶酚(為了更好的粘附性)，和(iii)含有強親核體(如硫醇)，從而其可以有效地與醌相互作用以使水凝膠的聚合物網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)(為了更好的內(nèi)聚力)。

選擇明膠，一種源自膠原蛋白的多肽的混合物，作為聚合物骨架。為了模擬富含DOPA的mfp(mfp-1、mfp-3和mfp-5)，通過常規(guī)的碳二亞胺偶聯(lián)^1、21來合成兒茶酚官能化的明膠。碳二亞胺偶聯(lián)得到酰胺連結(jié)的兒茶酚官能化的明膠聚合物，被稱為Gel-cat，(1，圖1A)。²¹與之前的報道一致，可以通過僅在堿性條件下氧化使Gel-cat交聯(lián)。通過¹H NMR和UV-vis測量估算明膠的兒茶酚含量。為了對照兩種不同聚合物中存在的兒茶酚基團的量，在整個研究中，除非另外指定，使用10％Gel-cat制備對照水凝膠，而使用4％的Gel-NCSN-cat制備用于比較的水凝膠。通過兒茶酚在不同氧化劑含量下交聯(lián)，形成水凝膠。首先，將Gel-cat溶解于PBS中，Gel-cat的濃度是100mg/mL，從而設(shè)定等摩爾量的兒茶酚。然后，將NaIO₄加入并且保持在相對于兒茶酚0.5-6的摩爾比/pH水平為pH＝6至pH＝10。將混合物立即渦旋并且當在將瓶反轉(zhuǎn)之后聚合物溶液停止流動時測定凝膠化時間。

實施例2：作為兒茶酚官能化的化合物的4Gel-NCSN-cat聚合物的制備和表征

為了模擬富含DOPA的mfp(mfp-1、mfp-3和mfp-5)，通過異硫氰酸酯-胺偶聯(lián)來合成兒茶酚官能化的明膠。首先合成多巴胺-異硫氰酸酯^22、23，然后將其經(jīng)由異硫氰酸酯-胺偶聯(lián)接枝到明膠化合物，從而制備兒茶酚官能化的化合物Gel-NCSN-cat(2，圖1A)。Gel-NCSN-cat的硫脲連接體模擬了mfp-6的還原性硫醇。通過¹H NMR和UV-vis測量估算明膠的兒茶酚含量。通過兒茶酚在不同氧化劑含量下的交聯(lián)，形成水凝膠。首先，將Gel-NCSN-cat和Gel-cat溶解于PBS，Gel-NCSN-cat和Gel-cat的濃度分別是40mg/mL和100mg/mL，從而設(shè)定等摩爾量的兒茶酚。然后，將NaIO₄加入并且保持在相對于兒茶酚1-6的摩爾比/pH水平為pH＝2至pH＝10。將混合物立即渦旋并且當在將瓶反轉(zhuǎn)之后聚合物溶液停止流動時測定凝膠化時間。

實施例3：4臂PEG-NCSN-CH₃的制備和表征

將4臂聚(乙二醇)-NH₂HCl鹽(sat)溶解于干燥DCM中。在溶液中加入異硫氰酸甲酯和三乙胺。將混合物倒入冷二乙基醚中并且通過離心機和真空干燥得到PEG產(chǎn)物。通過在¹H NMR光譜中相關(guān)峰的積分測定異硫氰酸甲酯的接枝比率。

實施例4：在不同的NaIO₄：兒茶酚比率下的水凝膠(Gel-NCSN-cat和Gel-cat)的制備

通過兒茶酚在不同氧化劑含量下交聯(lián)，形成水凝膠。首先，將Gel-NCSN-cat和Gel-cat溶解于PBS中。然后，將NaIO₄加入并且保持在相對于兒茶酚0.5-6的摩爾比。將混合物立即渦旋并且當在將瓶反轉(zhuǎn)之后聚合物溶液停止流動時測定凝膠化時間。

實施例5：在不同的pH值下的水凝膠(Gel-NCSN-cat和Gel-cat)的制備

通過在不同的pH條件下使交聯(lián)兒茶酚來形成水凝膠。首先，將Gel-NCSN-cat和Gel-cat溶解于pH緩沖劑中(2，HCl；4，MES；6，PBS；7.4，PBS；8.5，PBS；10，NaOH)。然后以相對于兒茶酚1.0的摩爾比加入NaIO₄。由于它們的短固化時間而將混合物立即渦旋并且當在將瓶反轉(zhuǎn)之后聚合物溶液停止流動時測定凝膠化時間。

實施例6：兒茶酚綴合的聚合物的制備和表征

為了研究硫脲連接對Gel-NCSN-cat凝膠化的貢獻，合成了硫脲官能化的4臂聚(乙二醇)交聯(lián)劑(PEG-NCSN)，其在氧化條件下使Gel-cat交聯(lián)。如預期的，在所有測試的pH值下，凝膠化都是快速的(在1min內(nèi))。然而，加入了氨基官能化的4臂聚(乙二醇)(PEG-NH₂)的陰性對照與Gel-cat僅在較高pH水平(pH≥6)下以明顯更長的固化時間形成水凝膠。這樣的差異可以歸因于硫脲與氨基相比較低的pK_a，并且還表明硫脲是高度有效的用于與氧化的兒茶酚(醌)偶聯(lián)的親核體。

Gel-cat的凝膠化時間表明了對氧化劑含量(NaIO₄和兒茶酚之間的摩爾比)和pH值二者的強的依賴性(圖1A和1B中的紅色曲線)。這些觀察結(jié)果與之前的報道^{2、3、24}一致，即氧化劑含量和pH二者是造成兒茶酚的還原(兒茶酚)和氧化(醌)形式之間的化學計量比的原因。值得注意的是，針對在這樣的情況中的快速凝膠化，需要兒茶酚和醌之間的最佳比率。鮮明的對比是，Gel-NCSN-cat的凝膠化時間未顯示出對氧化劑含量或pH值的明顯的依賴性。無論氧化劑含量和pH是多少，對于Gel-NCSN-cat來說，均可以實現(xiàn)極其快速的凝膠化(固化時間≤3s)(參見圖1A和1B中的藍色曲線)。此外，動態(tài)流變研究顯示，所得水凝膠的機械性能顯示出相似的對凝膠化條件的依賴性。具體地，Gel-cat水凝膠的儲存模量顯示出隨著逐漸增加的氧化劑含量或pH值的最初增加和隨后的略微降低(圖1A和1B中的紅色柱)，支持了如下的想法：最佳的氧化劑含量和pH值可以得到由被兒茶酚官能化的聚合物組成的水凝膠網(wǎng)絡(luò)的經(jīng)由酰胺連接的更快和更致密的交聯(lián)。^2、3相比之下，Gel-NCSN-cat水凝膠的儲存模量顯示出可忽略的對氧化劑含量和pH值的依賴性(圖1A和1B中的藍色柱)。有趣的是，即使在妨礙Gel-cat的凝膠化的酸性條件(pH＝2、pH＝4)下，Gel-NCSN-cat也可以形成強得多的水凝膠。這種所得水凝膠的凝膠化行為和機械性能的明顯差異可能表明兩種兒茶酚綴合的聚合物的兩種不同的交聯(lián)機制?？紤]到相同的明膠主鏈，Gel-cat和Gel-NCSN-cat水凝膠之間的這樣的明顯差異很可能歸因于明膠主鏈和兒茶酚基團之間的不同連接。

實施例7：兒茶酚綴合的聚合物的機制

為了更好地理解凝膠化機制，使用UV-vis光譜法監(jiān)測醌的產(chǎn)生和消耗。首先，評價Gel-cat在略微酸性條件(pH＝6)下的UV光譜(圖3)，因為醌在堿性pH25下是高度反應性的且不穩(wěn)定的。在加入NaIO₄(NaIO₄∶cat＝1∶1)時，醌峰(在395nm2，3)立即出現(xiàn)并且在之后的30分鐘內(nèi)略微升高。同時，可以觀察到來源于二兒茶酚形成2，3，26的在281nm和484nm附近的兩個新的峰((a)和(b)，圖2)。在pH 7.4下，由于在該pH下的更快的反應，二兒茶酚峰更明顯。如預期的，PEG-NH₂(作為陰性對照)的存在將不會改變醌和二兒茶酚形成的過程((c)，圖2)。相比之下，PEG-NCSN的存在迅速消耗醌并且大幅抑制二兒茶酚結(jié)構(gòu)的形成。如在圖4中所示，在加入NaIO4時，醌峰立即出現(xiàn)并且然后在之后的10min內(nèi)降低。在多至45min內(nèi)幾乎不能觀察到二兒茶酚峰。同時，在287nm附近的新的峰出現(xiàn)，據(jù)信這是硫脲取代的兒茶酚的吸收。^27、28在更酸性的條件(pH 4.0或2.0)下，醌被還原性硫脲的快速消耗變得更明顯。快速的醌消耗表示如在小分子之間的反應中所示的將醌恢復為兒茶酚的有效的硫脲-醌偶聯(lián)²⁰。這樣的有效偶聯(lián)可能歸因于硫脲基團的低pKa和出色的親核性，導致快速形成水凝膠并且保留大量的兒茶酚。

Gel-NCSN-cat的這種凝膠化機制與其中mfp-6在減少兒茶酚的氧化和防止貽貝足的粘合性能的喪失方面起到重要作用的天然貽貝蛋白的凝膠化機制相似。^{13-15、17、29}因此，據(jù)信，硫脲官能化的聚合物可以模擬mfp-6，以用于兒茶酚的恢復和出色的水凝膠粘合劑的形成((d)，圖2)。

實施例8：搭接-剪切測量

為了檢驗水凝膠的粘附性，進行兩個搭接-剪切測量。針對水凝膠制備，我們使用Gel-cat(10％)作為人造的富含DOPA的mfp(mfp-1，3，5)和PEG-NCSN(4％)作為人造的mfp-6(不具有DOPA)。此外，我們研究了Gel-cat和PEG-NH₂(4％)的組合作為陰性對照。在通用測試機上以1mm/min的速度在環(huán)境條件下對所有樣品進行搭接剪切測試至失效。進行至少五次相繼的粘合強度測量以研究水凝膠的粘附性能的恢復。⁴在下一次測試之前，將所有測試水凝膠浸入DI水中3。然后以相同方式測量搭接-剪切強度。尤其是，可以在酸性pH下由PEG-NCSN(人造mfp-6)交聯(lián)的Gel-cat水凝膠實現(xiàn)最高的粘附強度(pH＝2.0，～21kPa，圖6A)。在pH＝7.4下，搭接-剪切強度降低至僅2kPa。這可能是由于硫脲在堿性條件下受損害的還原能力導致的。然而，由PEG-NCSN交聯(lián)的水凝膠的粘合強度仍然高于PEG-NH₂交聯(lián)的水凝膠的粘合強度(～1KPa)，表明在pH 7.4下硫脲介導的交聯(lián)機制仍然超過醌介導的機制。

實施例9：粘附性的恢復

PEG-NCSN(人造mfp-6)交聯(lián)的Gel-cat水凝膠可以在酸性pH下在被剪切至失效后部分地恢復粘附性。明顯地，第一次恢復接近100％(圖6B)，并且在5次搭接-剪切測量之后，PEG-NCSN水凝膠仍然可以恢復初始粘附強度的40％。然而，這樣的粘附性的自發(fā)恢復隨著逐漸增加的pH(pH 7.4)而降低。相比之下，無論pH是多少，PEG-NH₂交聯(lián)的水凝膠在第一次搭接-剪切測量之后均未顯示出粘附性能的恢復。這樣的差異表明，硫脲系水凝膠的粘附性由保留的兒茶酚和表面之間的可逆氫鍵合介導。

總而言之，描述了提高兒茶酚綴合的明膠水凝膠的粘附性能的新策略。第一次采用了用于聚合物交聯(lián)和水凝膠制備的硫脲-醌偶聯(lián)。硫脲在酸性pH下的這樣的有效偶聯(lián)反應和還原能力明顯提高了水凝膠粘附性。本發(fā)明還可以應用于DOPA研究(如表面涂布)和聚合物化學(如點擊化學和蛋白質(zhì)綴合)的許多其他領(lǐng)域。

本申請中引用的所有專利、專利申請、和其他出版物(包括GenBank登錄號)通過引用整體結(jié)合在本文中用于所有目的。

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