本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌的研究和應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

基因工程方法致弱的鼠傷寒沙門氏菌作為載體表達(dá)外源基因，廣泛用于腫瘤、病毒病、細(xì)菌病、寄生蟲病等的治療研究，已取得了良好效果。但是在許多研究報(bào)道中的沙門氏菌載體，要么使減毒載體過(guò)度減毒，失去了免疫原性；或者保留了良好的免疫原性，但是載體菌株卻減毒不夠，缺乏安全性而不能作為疫苗。因此迫切需要研制這樣的一種疫苗載體，既要使疫苗載體足夠減毒，保證動(dòng)物完全的安全，又要使疫苗載體和其攜帶的外源抗原能夠誘導(dǎo)出優(yōu)秀的保護(hù)性抗體，抗擊相關(guān)病原的感染。

豬霍亂沙門氏菌是豬的重要病原菌，關(guān)于以豬霍亂沙門氏菌為載體遞送豬的其他病原抗原的研究，在國(guó)內(nèi)外已有少量報(bào)道。而用阿拉伯糖調(diào)控豬霍亂沙門氏菌毒力基因的表達(dá)和缺失的報(bào)道卻是鮮少。發(fā)明人在前期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用阿拉伯糖調(diào)控豬霍亂沙門氏菌的crp毒力基因所產(chǎn)生的載體菌可以誘導(dǎo)出對(duì)成年Balb/c小鼠較好的免疫原性，但是疫苗株的減毒不夠，作為疫苗株的安全性可能存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，如中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104498418A。

豬鏈球菌病是一種重要人畜共患傳染病，不僅影響著養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展，還嚴(yán)重危害著人類的健康。目前我國(guó)的豬用商品化鏈球菌疫苗還存在著諸多不完善的方面，因此我們選擇大多數(shù)豬鏈球菌血清型菌株都有的的Sao（surface antigen one)）作為減毒株的異源抗原，對(duì)本研究中構(gòu)建的可調(diào)控的延遲減毒的豬霍亂沙門氏菌疫苗候選株的相關(guān)特性和免疫效率進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以其為豬病的防控提供新的思路。

重組減毒沙門氏菌疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生顯著的粘膜免疫和細(xì)胞免疫，因此具備遞送外源抗原的載體特性。已有明確的研究顯示沙門氏菌載體對(duì)其所攜帶的外源基因有較多有利作用，例如，可以誘導(dǎo)出針對(duì)沙門氏菌本身和外源蛋白的細(xì)胞和黏膜免疫應(yīng)答。研究還發(fā)現(xiàn)，有很多減毒沙門氏菌載體因?yàn)樗拗鞯拿庖邏毫蛘咦陨碛邢薜亩ㄖ材芰?，很難達(dá)到野生型菌株那樣的免疫原性；而一些減毒沙門氏菌雖然獲得足夠的免疫應(yīng)答，但是菌株本身減毒不夠，不能作為疫苗載體。此外,沙門氏菌載體作為胞內(nèi)菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答主要是以細(xì)胞和黏膜免疫為主，對(duì)于大多數(shù)病原感染所需要的體液免疫應(yīng)答顯得蒼白無(wú)力。

沙門氏菌crp基因編碼腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白，是細(xì)菌在哺乳動(dòng)物宿主中攝取cAMP的唯一途徑；如果使沙門氏菌缺失crp基因，就使其喪失了代謝碳水化合物、氨基酸和小肽能力從而降低其毒力。在前期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)（如CN104498418A），用阿拉伯糖調(diào)控豬霍亂沙門氏菌的crp毒力基因所產(chǎn)生的載體菌可以誘導(dǎo)出對(duì)成年BALB/c小鼠較好的細(xì)胞和黏膜免疫原性，但是疫苗株的減毒不夠，誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答偏弱，作為對(duì)仔豬疫苗株的安全性可能依然存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，需要繼續(xù)篩選更加減毒的基因，構(gòu)建安全的豬霍亂沙門菌疫苗載體。而沙門氏菌誘導(dǎo)的以細(xì)胞免疫為主的特性，對(duì)于需要體液免疫應(yīng)答的病原仍然是一個(gè)缺陷，迫切需要尋找到平衡細(xì)胞免疫和體液免疫的技術(shù)和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種安全性較高、較平衡的細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答的基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌。

本發(fā)明所述豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌是缺失ΔmanA、ΔP_fur::TT araC P_BADfur、ΔrelA::araC P_BADlacI TT和ΔasdA四種基因的C78-3豬霍亂沙門氏菌，命名為rSC0012。

rSC0012(ΔmanA、ΔP_fur::TT araC P_BADfur、ΔrelA::araC P_BADlacI TT和ΔasdA)保藏在位于中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日為2016年6月20日，保藏編號(hào)為CGMCC NO.12644，該生物材料的分類命名為：減毒豬霍亂沙門氏菌，拉丁文學(xué)名為:Salmonella choleraesuis。

本發(fā)明優(yōu)越性體現(xiàn)在：

1、減毒株的安全性更高：rSC0012株比擁有ΔP_crp::TT araCP_BADcrp突變的rSC0011減毒株更加減毒，作為幼齡動(dòng)物疫苗載體具有更高的安全性。

2、減毒株誘導(dǎo)出平衡的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答：攜帶豬鏈球菌2型的SaoA蛋白的rSC0012(pS-SaoA)可以誘導(dǎo)出更加平衡的細(xì)胞、體液和黏膜免疫應(yīng)答，并可以100%抵抗野生型豬鏈球菌2型的攻擊。結(jié)果證明延遲缺失fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體對(duì)于幼齡動(dòng)物的疫苗開發(fā)具有實(shí)踐意義。本發(fā)明可在制備遞送豬病原的疫苗載體方面應(yīng)用。

本發(fā)明另一目的是提出以上豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌rSC0012的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1）構(gòu)建在fur毒力基因的啟動(dòng)子中插入araC P_BAD結(jié)構(gòu)的自殺載體：

以減毒豬霍亂沙門氏菌C78-3為模板，分別使用引物P1和P2、P3和P4、以及P5和P6進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到擴(kuò)增產(chǎn)物片段1、片段2以及片段3，將片段1依次與片段3和片段2連接，產(chǎn)生ΔP_fur::TT araC P_BADfur 結(jié)構(gòu)序列；再將ΔP_fur::TT araC P_BADfur 結(jié)構(gòu)序列連接至自殺載體pRE112，獲得自殺載體質(zhì)粒；然后將自殺載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌χ7213中，取得fur毒力基因的啟動(dòng)子中插入araC P_BAD結(jié)構(gòu)的自殺載體，命名為χ7213(pS005)；

所述的引物P1、P2、P3、P4、P5和P6的核苷酸序列分別如下：

P1：5’-ACATGCATGCTGTGACTGGGATGACTTCTTCCCG- 3’；

P2：5’-TGCGAGCTCGTGTAAATCTTTCGAAGAGCCAA- 3’；

P3：5’-AAGCTCGAGAGTCATGCGGAATCTGTCCTG- 3’；

P4：5’-TCCCCCGGGCACTTTTCCGCAATCAAGGCAG- 3’；

P5：5’-CCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGT- 3’；

P6：5’-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG- 3’；

2）構(gòu)建減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0008：

在豬霍亂沙門氏菌C78-3中分別插入突變?chǔ)?i>manA和ΔrelA::araC P_BADlacI TT，得減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0008；

3）構(gòu)建rSC0009突變株：

將減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0008引入所述fur毒力基因的啟動(dòng)子中插入araC P_BAD結(jié)構(gòu)的自殺載體，得rSC0009突變株；

4）構(gòu)建基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌：

將rSC0009突變株中引入Δasd 突變基因，得基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌。

本發(fā)明利用阿拉伯糖調(diào)控豬霍亂沙門氏菌的鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白(ferric uptake regulator, Fur)延遲缺失，控制豬霍亂沙門氏菌毒力基因缺失的時(shí)機(jī)，使豬霍亂沙門氏菌對(duì)鐵的代謝發(fā)生紊亂而減毒，同時(shí)影響沙門氏菌在淋巴系統(tǒng)的定居能力，導(dǎo)致缺失Fur蛋白的減毒沙門氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫的水平發(fā)生變化，以其獲得足夠減毒，最終使減毒株能夠像野生型豬霍亂沙門氏菌那樣高效率入侵宿主淋巴系統(tǒng)，誘導(dǎo)出比較平衡的細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫應(yīng)答，獲得足夠安全和平衡的免疫應(yīng)答的仔豬霍亂沙門氏菌載體菌。

本發(fā)明是在豬霍亂沙門氏菌C78-3上構(gòu)建的，使用araC P_BAD 激活啟動(dòng)子技術(shù)在豬霍亂沙門氏菌的編碼鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白(ferric uptake regulator, Fur)的fur 基因的啟動(dòng)子序列中引入araC P_BAD基因，使基因fur在菌體染色體中的表達(dá)受到阿拉伯糖的調(diào)控，以使得沙門氏菌毒力基因延遲缺失和表達(dá)，構(gòu)建豬霍亂沙門氏菌fur 基因的含有ΔP_fur::TTaraC P_BADfur 結(jié)構(gòu)序列的自殺載體。本發(fā)明使豬霍亂沙門氏菌C78-3獲得ΔmanA、ΔrelA::araC P_BAD lacI TT、ΔP_fur::TT araCP_BADfur 和ΔasdA 突變（優(yōu)選地，通過(guò)同源重組方法獲得這些突變），構(gòu)建成含有ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araCP_BADfur 和ΔasdA 突變的豬霍亂沙門氏菌減毒載體rSC0012。

本發(fā)明的構(gòu)建技術(shù)的有益效果：

1、本發(fā)明在構(gòu)建載體的設(shè)計(jì)中是使用阿拉伯糖啟動(dòng)子基因araC P_BAD調(diào)控豬霍亂沙門氏菌fur毒力基因的表達(dá)，即：利用動(dòng)物體內(nèi)沒(méi)有阿拉伯糖的特性，在體外人工培養(yǎng)載體菌時(shí)可以人為加入一定濃度的阿拉伯糖，載體菌的fur毒力基因能完全被表達(dá)，使載體菌在入侵宿主的初期具有像野生型菌株一樣的入侵能力，定植在宿主的淋巴系統(tǒng)，誘導(dǎo)出像野生菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；而在載體菌進(jìn)入宿主體內(nèi)，隨著細(xì)菌的復(fù)制，體外人工加入的阿拉伯糖濃度不斷被稀釋，載體菌表達(dá)的Fur蛋白濃度也不斷減少，使細(xì)菌逐漸減毒獲得作為疫苗載體的安全性；本方法是首次用于豬霍亂沙門氏菌fur毒力基因的構(gòu)建。

2、本發(fā)明采用無(wú)抗性標(biāo)記的自殺載體作為構(gòu)建豬霍亂沙門氏菌載體的方法，可以避免使用抗生素標(biāo)記的載體，避免減毒載體產(chǎn)生耐藥性。

3、本發(fā)明還采用了平衡-致死的細(xì)菌/載體系統(tǒng)法。其中平衡-致死的細(xì)菌/載體系統(tǒng)法是刪除了細(xì)菌的asd基因，強(qiáng)制性地使細(xì)菌的生長(zhǎng)需要人為加入二氨基庚二酸（是細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層的一種基本成分），同時(shí)在表達(dá)外源抗原質(zhì)粒載體上加入野生型細(xì)菌的asd基因。然后將asd⁺的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到asd^-的細(xì)菌載體上形成互補(bǔ)，可以保證只有攜帶外源抗原的疫苗株才能在生產(chǎn)疫苗和免疫的宿主體內(nèi)存活，提高疫苗的免疫效率。

附圖說(shuō)明

圖1是ΔP_fur::TT araCP_BADfur基因缺失構(gòu)建圖。

圖2是ΔP_fur::TT araCP_BADfur自殺載體圖。

圖3是ΔmanA缺失株陽(yáng)性菌的表型鑒定的LPS膠銀染色圖。圖中， 泳道A：ΔmanA缺失株無(wú)甘露糖；泳道B：ΔmanA缺失株有甘露糖；泳道C：C78-3野毒株。

圖4是阿拉伯糖調(diào)控LacI蛋白的表達(dá)的Western blot圖。圖中，泳道1～5分別為χ0008在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中傳的代次，LacI.38 kD；泳道M為蛋白marker。

圖5是ΔP_fur::TT araC P_BADfur缺失株陽(yáng)性菌的PCR電泳圖鑒定的電泳圖。泳道M：DL2000 DNA marker；泳道1～5：陽(yáng)性結(jié)果（即：鑒定為突變陽(yáng)性的樣品進(jìn)一步純化后隨機(jī)抽取菌落的PCR電泳圖；以下出現(xiàn)的“陽(yáng)性結(jié)果”，除非特殊說(shuō)明，均為這種情況）。

圖6是ΔasdA突變株的PCR電泳圖鑒定的電泳圖。泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1～6Δasd陽(yáng)性結(jié)果。

圖7是rSC0012(ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araC P_BADfur，ΔasdA)的PCR電泳圖鑒定。泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1：ΔP_fur::TT araC P_BADfur陽(yáng)性結(jié)果；泳道2：ΔmanA陽(yáng)性結(jié)果；泳道3、4：ΔrelA::araC P_BADlacI TT 前后單交換陽(yáng)性結(jié)果；泳道5：Δ asdA陽(yáng)性結(jié)果。

圖8是無(wú)甘露糖時(shí)rSC0012失去O抗原，有甘露糖時(shí)恢復(fù)O抗原的電泳圖。泳道A：C78-3強(qiáng)毒株；泳道B：rSC0018弱毒株；泳道C：rSC0012菌株(-mannose)；泳道D：rSC0012菌株(+mannose)。

圖9是阿拉伯糖調(diào)控SaoA蛋白的表達(dá)的Western blot圖。泳道M：蛋白marker；泳道1～5：分別為rSC0012(pS-SaoA)在NB培養(yǎng)液中盲傳的代次。

圖10是阿拉伯糖調(diào)控Fur蛋白的表達(dá)的Western blot圖。泳道M：蛋白marker；泳道1～5：分別為rSC0012(pS-SaoA)在NB培養(yǎng)液中盲傳的代次。

圖11是rSC0012在含DAP和不含DAP的LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)的比較圖。左側(cè)試瓶：rSC0012在不含DAP的LB液體培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)；右側(cè)試瓶：rSC0012在含DAP的LB液體培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。

圖12是SaoA基因的擴(kuò)增電泳圖。泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1、2：SaoA基因。

圖13是純化SaoA蛋白的Western Blot鑒定圖。泳道M：蛋白Marker；泳道1：純化SaoA蛋白；泳道2：BL21(pET28a-SaoA)菌體蛋白。

圖14是asd⁺的未插入外源基因的質(zhì)粒pYA3493的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖15是asd⁺的插入SaoA基因的質(zhì)粒pS-SaoA的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖16是減毒株在6周齡BALB/c小鼠肝臟中定植能力比較圖。

圖17是減毒株在6周齡BALB/c小鼠脾臟中定植能力比較圖。

圖18是減毒株在6周齡BALB/c小鼠腸道派伊爾氏淋巴小結(jié)中定植能力比較圖。

圖19是減毒株在21d BALB/c小鼠肝臟中的定植能力比較圖。

圖20是減毒株在21d BALB/c小鼠脾臟中的定植能力比較圖。

圖21是減毒株在21d BALB/c小鼠腸道派伊爾氏淋巴小結(jié)中定植能力比較圖。

圖22是pS-SaoA質(zhì)粒在rSC0012(pS-SaoA)中傳10-50代PCR結(jié)果的鑒定電泳圖。泳道M：DL10000 DNA marker；泳道1～5：分別為rSC0012(pS-SaoA)的第10～50代。

圖23是pS-SaoA質(zhì)粒在rSC0012(pS-SaoA)中傳 10-50代酶切結(jié)果結(jié)果的鑒定電泳圖。泳道M：DL10000 DNA marker；泳道1～5：分別為rSC0012(pS-SaoA) 的第10～50代。

圖24是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導(dǎo)的抗SaoA 的IgG圖。

圖25是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導(dǎo)的抗沙門氏菌減毒株外膜蛋白OMPs的IgG圖。

圖26是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導(dǎo)的抗SaoA IgA水平圖。

圖27是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導(dǎo)IFN-γ水平圖。

圖28是減毒株免疫6周齡BALB/c小鼠誘導(dǎo)IL-4水平圖。

圖29是減毒株免疫21dBALB/c小鼠誘導(dǎo)的抗SaoA IgG圖。

圖30是減毒株免疫21dBALB/c小鼠誘導(dǎo)的抗沙門氏菌減毒株OMPs的IgG圖。

圖31是減毒株免疫21dBALB/c小鼠誘導(dǎo)的抗SaoA IgA的圖。

圖32是減毒株免疫21d BALB/c小鼠誘導(dǎo)IFN-γ水平的圖。

圖33是減毒株免疫21d BALB/c小鼠誘導(dǎo)IL-4水平的圖。

具體實(shí)施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。

一、構(gòu)建減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0012。

1、構(gòu)建在fur毒力基因的啟動(dòng)子中插入araC P_BAD結(jié)構(gòu)的自殺載體（ΔP_fur::TT araCP_BADfur）：

在Genbank中搜索豬霍亂沙門氏菌的全基因序列，找到豬霍亂沙門氏菌的fur基因及其上游啟動(dòng)子序列，在fur基因啟動(dòng)子的左右側(cè)設(shè)計(jì)同源臂引物序列，刪除fur基因啟動(dòng)子區(qū)的238個(gè)核苷酸，然后插入轉(zhuǎn)錄終止子（TT）和araC P_BAD激活啟動(dòng)子序列1335bp，其刪除和插入的系統(tǒng)為：fur基因上游fldA部分序列、刪除fur基因啟動(dòng)子區(qū)238bp后右側(cè)的序列、插入的轉(zhuǎn)錄終止子（TT）和araC P_BAD激活啟動(dòng)子序列1335bp、刪除fur基因啟動(dòng)子238bp后左側(cè)序列，全稱為ΔP_fur::TT araCP_BADfur（P表示啟動(dòng)子，TT表示轉(zhuǎn)錄終止子）（如圖1所示。

具體步驟如下：

以豬霍亂沙門氏菌C78-3為模板，用引物P1和P2經(jīng)PCR擴(kuò)增得到fldA同源臂區(qū)，命名為片段1(330 bp)。

以豬霍亂沙門氏菌C78-3為模板，用引物P3和P4經(jīng)PCR擴(kuò)增得到刪除fur基因啟動(dòng)子區(qū)的238 bp核苷酸后其余的fur基因中的同源臂，命名為片段2(356 bp)。

以豬霍亂沙門氏菌C78-3為模板，用引物P5和P6經(jīng)PCR擴(kuò)增得到TT araC P_BAD結(jié)構(gòu)序列，命名為為片段3。

取22.8 μL 滅菌蒸餾水（SW）、0.6 μL上游引物、0.6 μL 下游引物、1 μL模板和25 μL Supermix組成總體積為50 μL的PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火溫度為58℃ 1min，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

隨后，將片段1與片段3經(jīng)平端連接，再將連接產(chǎn)物連接至pGEM-TEasyVector克隆載體（promega公司）；將連接產(chǎn)物酶切后，再與片段2經(jīng)平端連接；將連接產(chǎn)物再連接至pGEM-TEasyVector克隆載體，產(chǎn)生ΔP_fur::TT araC P_BADfur結(jié)構(gòu)序列，經(jīng)Takara公司測(cè)序，證明已獲得正確的ΔP_fur::TT araC P_BADfur結(jié)構(gòu)陽(yáng)性質(zhì)粒序列。

將上述陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)SphI和Xmal酶切，酶切產(chǎn)物連接至具有氯霉素和蔗糖篩選標(biāo)記的自殺載體pRE112 （由Dr.Curtiss Roy III惠贈(zèng)，Arizona State University）中，獲得的質(zhì)粒稱為pS005；通過(guò)酶切和測(cè)序雙重鑒定，將含有正確的ΔP_fur::TT araC P_BADfur結(jié)構(gòu)的自殺載體質(zhì)粒pS005通過(guò)電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌χ7213中，取得在fur毒力基因的啟動(dòng)子中插入araC P_BAD結(jié)構(gòu)的自殺載體，如圖2所示，命名為χ7213(pS005)，保存于-20℃環(huán)境中。

引物P1、P2、P3、P4、P5和P6的核苷酸序列分別如下：

P1：5’-ACATGCATGCTGTGACTGGGATGACTTCTTCCCG- 3’。

P2：5’-TGCGAGCTCGTGTAAATCTTTCGAAGAGCCAA- 3’。

P3：5’-AAGCTCGAGAGTCATGCGGAATCTGTCCTG- 3’。

P4：5’-TCCCCCGGGCACTTTTCCGCAATCAAGGCAG- 3’。

P5：5’-CCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGT- 3’。

P6：5’-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG- 3’。

2、構(gòu)建rSC0008（ΔmanA和ΔrelA::araC P_BADlacI TT）及其表型的鑒定：

在豬霍亂沙門氏菌C78-3中分別插入突變?chǔ)?i>manA和ΔrelA::araC P_BADlacI TT，稱為減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0008（Ji Z, Shang J, Li Y, Wang S, Shi H. Live attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis vaccine vector displaying regulated delayed attenuation and regulated delayed antigen synthesis to confer protection against Streptococcus suis in mice. Vaccine. 2015 Sep 11;33(38):4858-67）。其中manA基因缺失后，在沙門氏菌的代謝過(guò)程中，6-磷酸果糖生成6-磷酸甘露糖的過(guò)程中缺少了磷酸甘露糖異構(gòu)酶，manA基因缺失菌就不能合成LPS O-抗原的側(cè)鏈，在LPS中O-抗原就會(huì)變成光滑的條帶；但是在體外培養(yǎng)時(shí)，人工加入甘露糖后，具有ΔmanA突變的細(xì)菌可以合成LPS O-抗原 ，見圖3所示：ΔmanA缺失株無(wú)甘露糖時(shí)失去O抗原。

在ΔrelA::araC P_BAD lacI TT突變的結(jié)構(gòu)中，由阿拉伯糖控制lacI基因的表達(dá)。即當(dāng)有阿拉伯糖存在時(shí)，lacI基因被表達(dá)，表達(dá)的lacI蛋白就抑制沙門氏菌突變株攜帶的原核表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白；反之，當(dāng)在沒(méi)有阿拉伯糖存在的動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，lacI基因不能被表達(dá)，沙門氏菌突變株攜帶的原核表達(dá)載體就能更高效地表達(dá)外源蛋白。因此在培養(yǎng)突變株χ0008第一代時(shí)，加入0.2%阿拉伯糖和0.2%甘露糖；從第二代培養(yǎng)開始，就不加阿拉伯糖和甘露糖，這樣連續(xù)傳代培養(yǎng)10代。隨著傳代代數(shù)的增加，細(xì)菌中阿拉伯糖的含量逐漸減少，lacI基因表達(dá)成蛋白的量就不斷減少，見圖4阿拉伯糖調(diào)控LacI蛋白的表達(dá)。

3、構(gòu)建含有ΔP_fur::TT araC P_BADfur突變的rSC0009突變株（C78-3ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araC P_BADfur）：

在受體菌rSC0008(C78-3ΔmanA, ΔrelA::araC P_BADlacI TT)中引入步驟1.1中所獲得的含有ΔP_fur::TT araC P_BADfur結(jié)構(gòu)的自殺載體χ7213(pS005)，構(gòu)建rSC0009突變株：

具體步驟如下：

1）供體菌和受體菌的結(jié)合：

受體菌液的制備：在1mL LB培養(yǎng)基中加入rSC0008（C78-3ΔmanA, ΔrelA::araCP_BADlacI TT），37℃培養(yǎng)10-12小時(shí)，得受體菌液。

供體菌的制備：在含有50mg/mL的2,6-二氨基庚二酸（2,6-diaminopimelic acid，DAP），25mg/mL的氯霉素（chloramphenicol，Cm）的1mL LB培養(yǎng)液中加入自殺載體χ7213（pS005）37℃培養(yǎng)10-12小時(shí)，得供體菌液。

然后將受體菌液和供體菌液混合，使受體菌和供體菌發(fā)生結(jié)合，取得結(jié)合的菌落。

2）ΔP_fur::TT araC P_BADfur缺失株的篩選：

將結(jié)合的菌落在含氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上劃單菌落；取生長(zhǎng)的單菌落在1mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃搖震培養(yǎng)至菌液濃度混濁；每個(gè)菌液按照10倍稀釋至10^-3，涂布于含5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)出單菌落，并將其命名為rSC0009突變株。

3）rSC0009(C78-3ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araC P_BADfur)突變株的PCR鑒定：

將在5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)板上長(zhǎng)出的菌落，分別在LB固體培養(yǎng)板上和含氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上劃線；將在LB固體培養(yǎng)板上生長(zhǎng)，但是在含氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上不生長(zhǎng)的菌落，用引物P1和P4進(jìn)行PCR鑒定，ΔP_fur::TT araC P_BADfur缺失株陽(yáng)性菌的PCR片段大小為2015 bp，陰性菌的PCR片段大小為919 bp。PCR鑒定結(jié)果如圖5所示：在泳道1～5上可見陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明已制得了rSC0009突變株。

4、構(gòu)建豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012。

在rSC0009突變株（ΔmanA ΔrelA::araC P_BADlacI TT ΔP_fur::TT araCP_BADfur）中引入Δasd突變，具體步驟如下：

1）供體菌和受體菌的結(jié)合：

受體菌液的制備：在1mL LB培養(yǎng)基中加入受體菌rSC0009（C78-3ΔmanA, ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araCP_BADfur ），37℃培養(yǎng)10-12小時(shí)，得受體菌液。

供體菌液的制備：在含有50 mg/mL的2,6- 二氨基庚二酸（2,6-diaminopimelic acid，DAP），25mg/mL的氯霉素（chloramphenicol，Cm）的1mL LB培養(yǎng)液中加入χ7213（pS004）(Δasd的自殺載體，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，具體方法見Ji Z, Shang J, Li Y, Wang S, Shi H. Live attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis vaccine vector displaying regulated delayed attenuation and regulated delayed antigen synthesis to confer protection against Streptococcus suis in mice. Vaccine. 2015 Sep 11;33(38):4858-67)，37℃培養(yǎng)10-12小時(shí)，得供體菌液。

將受體菌液和供體菌液混合，使受體菌和供體菌發(fā)生結(jié)合，取得結(jié)合的菌落。

2）Δasd缺失株的篩選：

將結(jié)合的菌落在含氯霉素和DAP的LB固體培養(yǎng)板上劃單菌落；取生長(zhǎng)的單菌落在含有DAP的1mL LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃搖震培養(yǎng)至菌液濃度混濁；每個(gè)菌液按照10倍稀釋至10^-3，涂布于含5%蔗糖的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)出單菌落。

3）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012 (C78-3ΔmanA，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔP_fur::TT araC P_BADfur，Δasd)突變株的PCR鑒定：

將在5%蔗糖和DAP的LB固體培養(yǎng)板上長(zhǎng)出的菌落，分別在LB固體培養(yǎng)板、含有DAP的LB固體培養(yǎng)板，和同時(shí)含有DAP和氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上劃線；將只在含有DAP得LB固體培養(yǎng)板上生長(zhǎng)，但是在LB固體培養(yǎng)板、同時(shí)含有DAP和氯霉素的LB固體培養(yǎng)板上不生長(zhǎng)的菌落，用引物P7（5’-TGCTCTAGA TGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3’）和P8（5’-TCCCCCGGG TATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3’）進(jìn)行PCR鑒定，Δasd陽(yáng)性菌的PCR片段大小633bp，陰性菌的PCR片段大小為1719bp。如圖6所示。

將rSC0009（ΔmanA ΔrelA::araC P_BADlacI TT ΔP_fur::TT araCP_BADfur）+Δasd突變株命名為減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0012。

減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0012保藏在位于中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日為2016年6月20日，保藏編號(hào)為CGMCC NO.12644，該生物材料的分類命名為：減毒豬霍亂沙門氏菌，拉丁文學(xué)名為:Salmonella choleraesuis。

二、對(duì)構(gòu)建的含fur基因啟動(dòng)子修飾的減毒豬霍亂沙門氏菌rSC0012進(jìn)行表型鑒定：

1、PCR鑒定rSC0012減毒豬霍亂沙門氏菌中的突變：

由引物P9（ΔmanA）和P10（ΔmanA）對(duì)rSC0012株中的ΔmanA突變進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

由引物P11（ΔrelA）和P12（ΔrelA）對(duì)rSC0012株中的ΔrelA::araC P_BADlacI TT突變進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

由引物P13（ΔP_fur）和P14（ΔP_fur）對(duì)rSC0012株中的ΔP_fur::TT araCP_BADfur突變進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

由引物P15（ΔasdA）和P16（ΔasdA）對(duì)rSC0012株中的ΔasdA突變進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

以上各引物序列見下：

P9（ΔmanA）：5’-GGGGAGCTCCGCTGGTAGTTTTGATAACTTAA-3’。

P10（ΔmanA）：5’- GGGGGTACCTACGGCGACGGACACATGTTCGCT-3’。

P11（ΔrelA）：5’- CCCAAGCTTGAGCTCGAGGGCGTTCCGGCGCTGGTAGAA-3’。

P12（ΔrelA）：5’- CGGGTACCCCAGATATTTTCCAGATCTTCAC-3’。

P13（ΔP_fur）：5’- ACATGCATGCTGTGACTGGGATGACTTCTTCCCG-3’。

P14（ΔP_fur）：5’- TCCCCCGGGCACTTTTCCGCAATCAAGGCAG-3’。

P15（ΔasdA）：5’- TGCTCTAGATGTGCATGGCAATCGCCCAAC-3’。

P16（ΔasdA）：5’- TCCCCCGGGTATCTGCGTCGTCCTACCTTC-3’。

其中，每個(gè)突變片段的PCR的反應(yīng)體系和條件分別如下：

1）ΔmanA PCR擴(kuò)增體系的總體積為 25μL，包括：15.7μL SW、2.5μL 10x buffer、3ul MgCl₂、1μL dNTP（2.5mM)、0.3μL 引物P9、0.3μL 引物P10、2μL 模板和0.2μL Taq DNA聚合酶；其反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性30s，退火溫度為58℃ 1min，72℃延伸 1min，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

2）ΔrelA::araC P_BADlacI TT PCR擴(kuò)增體系的總體積為 25 μL，包括：15.7μL SW、2.5μL 10x buffer、3μL MgCl₂、1μL dNTP（2.5mM)、0.3μL 引物P11、0.3μL 引物P12、2μL模板和0.2μL Taq DNA聚合酶。其反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性30s，退火溫度為60℃ 2 min，72℃延伸 3min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

3）ΔP_fur::TT araCP_BADfur PCR擴(kuò)增體系的總體積為 25 μL，包括：15.7μL SW、2.5μL 10x buffer、3μL MgCl₂、1μL dNTP（2.5mM)、0.3μL 引物P13、0.3μL 引物P14、2μL 模板和0.2μL Taq DNA聚合酶。其反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火溫度為58℃ 1min，72℃延伸 2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

4）ΔasdA PCR擴(kuò)增體系的總體積為 25 μL，包括：15.7μL SW、2.5μL 10x buffer、3μL MgCl₂、1μL dNTP（2.5mM)、0.3μL 引物P15、0.3μL 引物P16、2μL 模板和和0.2μL Taq DNA聚合酶。其反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火溫度為58℃ 1min，72℃延伸 1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

圖7反映了4個(gè)突變的PCR片段的結(jié)果，可見：該菌株上的4個(gè)突變的PCR片段大小與預(yù)期的結(jié)果完全符合。

2、rSC0012突變株的表型鑒定：

1）ΔmanA突變的表型鑒定：

將野生型豬霍亂沙門氏菌C78-3（購(gòu)自中監(jiān)所）、中國(guó)豬霍亂沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)弱毒疫苗株C500（購(gòu)自中監(jiān)所）作為對(duì)照；設(shè)rSC0012中加入和不加入甘露糖（mannose）組，進(jìn)行銀染色實(shí)驗(yàn)。由于ΔmanA導(dǎo)致突變株的LPS-O抗原側(cè)鏈缺失，LPS膠呈現(xiàn)光滑性(如圖8中泳道C所示)。而在培養(yǎng)基中添加甘露糖后，突變株能夠正常合成LPS-O抗原，LPS膠恢復(fù)條帶(如圖8中泳道D所示)。而對(duì)照組C78-3、C500的LPS膠皆呈現(xiàn)有條帶，且C78-3的條帶顏色更深。圖8顯示，泳道A為C78-3株，泳道B為C500株（rSC0018弱毒株），泳道C為沒(méi)有加甘露糖的rSC0012株，泳道D為加入甘露糖的rSC001株的LPS銀染色圖。

2）ΔrelA::araC P_BADlacI TT突變的表型鑒定：

在ΔrelA::araC P_BADlacI TT突變的結(jié)構(gòu)中，是由阿拉伯糖控制lacI基因的表達(dá)。即當(dāng)有阿拉伯糖存在時(shí)，lacI基因被表達(dá)，表達(dá)的lacI蛋白就抑制沙門氏菌突變株攜帶的原核表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白；反之，當(dāng)在沒(méi)有阿拉伯糖存在的動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，lacI基因不能被表達(dá)，沙門氏菌突變株攜帶的原核表達(dá)載體就能更高效地表達(dá)外源蛋白。因此本實(shí)驗(yàn)需要突變菌株攜帶能表達(dá)外源蛋白原核表達(dá)載體的配合，因此使用rSC0012(pS-SaoA)作為驗(yàn)證ΔrelA::araC P_BADlacI TT表型的菌株。

rSC0012(pS-SaoA)隨著阿拉伯糖濃度的稀釋，原核載體pS-SaoA表達(dá)的外源蛋白SaoA逐漸增加。具體方法如下：

取rSC0012(pS-SaoA)單菌落于2mL NB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫?fù)u床220rpm振蕩培養(yǎng)，以培養(yǎng)時(shí)間12h為一代，將菌液按體積比1:100接種5mL NB培養(yǎng)基傳單培養(yǎng)。在培養(yǎng)第一代時(shí)，向正常情況下不含阿拉伯糖的NB培養(yǎng)基中添加0.2 %阿拉伯糖，而從第二代培養(yǎng)開始不添加阿拉伯糖，如此盲傳10代。經(jīng)過(guò)蛋白表達(dá)最佳條件的摸索后，挑取每代單菌落于含有LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)過(guò)夜；按1:50接種50mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(含25 μg/mL Kan)，于37℃恒溫?fù)u床220 rpm培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為0.6～1.0，加入1% IPTG誘導(dǎo)4h，4℃ 6000rpm離心8min，棄去上清，加4mL PBS重懸沉淀，再次4 ℃離心收集菌體沉淀，加入4mL PBS，經(jīng)超聲波細(xì)胞裂解儀裂解細(xì)菌細(xì)胞(工作時(shí)間1s，工作間隙3s)直至溶液透亮，離心后分別收集上清和沉淀。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白條帶大?。灰酝每筍aoA血清為一抗溶液，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗溶液，用Western Blot方法檢測(cè)SaoA蛋白表達(dá)的情況。

在ΔrelA::araC P_BADlacI TT中，lacI基因的表達(dá)受到阿拉伯糖的控制。如果培養(yǎng)條件中有阿拉伯糖，菌株就會(huì)表達(dá)lacI基因，而沙門氏菌突變株所攜帶原核表達(dá)載體的外源蛋白的表達(dá)則受到抑制。相反，如果培養(yǎng)條件是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)（這里沒(méi)有阿拉伯糖），lacI基因就不能被表達(dá)，沙門氏菌突變株就能表達(dá)所攜帶原核表達(dá)載體的外源蛋白。

隨著盲傳代數(shù)的增加，培養(yǎng)基中首次加入的阿拉伯糖的含量逐漸減少，lacI基因的表達(dá)受到抑制，沙門氏菌突變株攜帶原核表達(dá)載體的外源抗原SaoA蛋白的表達(dá)量就逐漸增高。Western Blot 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9所示，其中泳道1～5分別為rSC0012(pS-SaoA)在NB培養(yǎng)液中盲傳的1～5代，由圖9可見，隨盲傳代數(shù)的增加，SaoA蛋白(35 kD)的表達(dá)量逐漸增加。

3）ΔP_fur::TT araC P_BADfur 突變的表型鑒定：

fur基因是沙門氏菌對(duì)鐵進(jìn)行代謝的調(diào)控基因。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)在fur基因的啟動(dòng)子中加入了araC P_BAD基因（由阿拉伯糖調(diào)控），使fur基因所表達(dá)的蛋白受到阿拉伯糖的調(diào)控。因此對(duì)fur基因缺失的表型鑒定也可以用以上rSC0012突變株的表型鑒定中對(duì)ΔrelA::araC P_BADlacI TT突變的表型鑒定的方法，即在體外培養(yǎng)第一代rSC0012菌株的NB培養(yǎng)基中加入阿拉伯糖，隨后的連續(xù)傳代培養(yǎng)，都不加阿拉伯糖。隨著菌株的分裂，培養(yǎng)基中可利用的阿拉伯糖濃度逐漸下降，而隨著培養(yǎng)基中阿拉伯糖濃度逐漸下降，菌株中的fur基因所表達(dá)的蛋白也就逐漸減少，直至缺失。圖10中泳道1～5分別為rSC0012(pS-SaoA)在NB培養(yǎng)液中盲傳至1～5代時(shí)的阿拉伯糖調(diào)控Fur蛋白的表達(dá)條帶，由圖10可知，隨之菌株傳代次數(shù)的增多，阿拉伯糖的濃度逐漸減少，F(xiàn)ur蛋白的表達(dá)量也逐漸減少。

4）ΔasdA 的表型鑒定：

挑取rSC0012單菌落分別接種5mL LB液體培養(yǎng)基和含DAP的LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL DAP)中，于37 ℃恒溫?fù)u床220rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，觀察該菌在兩種不同營(yíng)養(yǎng)條件中培養(yǎng)的生長(zhǎng)狀態(tài)。

二氨基庚二酸(DAP)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分。asd基因編碼的天冬氨酸脫氫酶是DAP生物合成途徑中的必須酶。所以Δasd突變株的生長(zhǎng)依賴于在培養(yǎng)條件下額外添加DAP。結(jié)果表明，rSC0012菌株在含有DAP的LB液體培養(yǎng)基中可以正常生長(zhǎng)（見圖11中右側(cè)試瓶），而在普通LB液體培養(yǎng)基中無(wú)法生長(zhǎng)（見圖11中左側(cè)試瓶）。

三、選擇大多數(shù)豬鏈球菌血清型菌株都有的SaoA（surface antigen one)蛋白作為減毒株的異源抗原，對(duì)本研究中構(gòu)建的可調(diào)控的延遲減毒的豬霍亂沙門氏菌疫苗候選株的相關(guān)特性（如：毒力（LD₅₀）、定植能力和穩(wěn)定性等）進(jìn)行了評(píng)價(jià)，以其為豬病的防控提供新的思路。

1、構(gòu)建遞送豬鏈球菌SaoA蛋白的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012平衡-致死系統(tǒng)：

1）豬鏈球菌2型saoA基因的克隆和表達(dá)：

豬鏈球菌2型是豬的重要疫病，為檢測(cè)本申請(qǐng)中構(gòu)建的延遲缺失fur基因豬霍亂沙門氏菌的免疫效率，選擇豬鏈球菌2型SaoA蛋白作為減毒豬霍亂沙門氏菌遞送的異源抗原。經(jīng)SaoA-F（ATGGATCGCAACCTGATGGAAGAC）、SaoA-R（GGGTCGAGCATTGCTACCTTAGAG）引物PCR，經(jīng)過(guò)膠回收、BamHI和SalI雙酶切處理，在T4連接酶作用下與同樣經(jīng)過(guò)雙酶切處理的原核表達(dá)載體pET-28a相連接，化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21中，得到BL21(pET28a-SaoA)菌株。將酶切鑒定陽(yáng)性的菌株送南京金斯瑞測(cè)序。結(jié)果可知，酶切后獲得了5639bp的載體pET28a的片段和777bp的SaoA片段，長(zhǎng)度為789bp，測(cè)序后獲得的基因序列見下：

ggatcccaac ctgatggggg acaggctact tcaaaggcgg ttaatgtcaa aataccagca 60

gtagtacgac tatttggtcg tgagcttcta gaaaatgaat ttaaatttga gcttagagaa 120

gcgaatggcg aggaactccc tgtccttgat acagctcaaa atacaaaaga gggtcaagtt 180

agatttaaaa atctatcatt cgataagcct ggcaaatact ggtatacaat ttcagaagta 240

aaagatgagc ttggtggtat tgagtatgat tcgaaatata ttgtagcaaa aataactgta 300

gaagatcgaa acgggcaatt acaggcaatg atcgaattta ttgataatga caatgtcttt 360

aacaatttct atacacctgc tccagctgct gctagtcttt cgataaaaaa agtcctcgag 420

ggacgtacct taaacaccgg tgaattcgaa tttgttttaa aaaatgaaaa aggcgatgaa 480

atcgaaaagg taagcaatca agcagatggt tctgtaaact ttagtgccct aacatttaca 540

aaagagggaa cctataccta cactgtttca gaagttgatg gtggacttgg cgatattatc 600

tatgacaaat cagatattaa ggccactgtt actgtgaaag ataacaatca cggacaacta 660

gtctcaacag tgacttatga aaatagcgat caaatcttcg agaatatttt gaatcctggg 720

aagttaatag cgccaaccac ggatagcgtt attactgata atgaagtctc taaggaagca 780

ctggtcgac 。

將以上酶切產(chǎn)物777bp的SaoA片段測(cè)序后獲得的基因序列與標(biāo)準(zhǔn)豬鏈球菌的SaoA序列比較，證明酶切的777bp的SaoA序列完全正確。

檢測(cè)BL21(pET28a-SaoA)中的SaoA蛋白表達(dá)結(jié)果見圖13所示：BL21(pET28a-SaoA)能夠有效表達(dá)外源插入的SaoA蛋白片段，條帶大小為35kD），與預(yù)期相符。

2）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012平衡-致死系統(tǒng)的構(gòu)建：

為避免使用含抗性基因的質(zhì)粒載體，保證減毒沙門氏菌中的質(zhì)粒載體在宿主體內(nèi)的穩(wěn)定性，本專利中我們構(gòu)建的減毒豬霍亂沙門氏菌載體rSC0012是缺失了asd基因的（asd^-），這是為了使asd^- 的載體與asd⁺ 的原核表達(dá)載體（pYA3493）形成互補(bǔ)。即：當(dāng)缺失asd基因的菌株在體外培養(yǎng)時(shí)可以通過(guò)加入二氨基庚二酸（diaminopimelic acid，DAP），彌補(bǔ)由于缺失asd基因后細(xì)菌不能生長(zhǎng)的缺陷。但是由于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)沒(méi)有二氨基庚二酸，缺失asd基因的沙門氏菌在動(dòng)物體內(nèi)就不能存活，而原核表達(dá)載體pYA3493為asd⁺ 的質(zhì)粒，在pYA3493中插入豬鏈球菌2型的SaoA基因后的pS-SaoA也是asd⁺ 的質(zhì)粒（見圖14和圖15所示）；然后將pYA3493或pS-SaoA轉(zhuǎn)化入asd^-的減毒沙門氏菌rSC0012中，asd⁺ 的質(zhì)粒與asd^-的細(xì)菌就形成互補(bǔ)，從而使缺失asd基因的沙門氏菌在動(dòng)物體內(nèi)可以存活的同時(shí)，避免因使用抗性基因質(zhì)粒載體而造成載體菌的耐藥。

因此本實(shí)施首先將突變菌株rSC0012（C78-3 ΔmanA ΔrelA::araC P_BADlacI TT ΔP_fur::TT araCP_BADfur Δasd）制作成感受態(tài)。具體步驟是：挑取單菌落rSC0012用含有50mg/mL DAP的2mL的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜；次日按1:100比例，將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接種至20 mL的LB培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀≈0.6，冰浴10 min，4℃、1500rpm離心10min收集細(xì)菌，沉淀細(xì)菌用冰浴預(yù)冷的10%甘油洗3遍，用25μl預(yù)冷的10%甘油重懸，即為rSC0012的感受態(tài)細(xì)胞。獲得rSC0012的感受態(tài)細(xì)胞后，用氯化鈣法，取1μL的質(zhì)粒pYA3493（由Dr.Curiss Roy III惠贈(zèng)，Arizona State University）或者pS-SaoA轉(zhuǎn)化至rSC0012的感受態(tài)細(xì)胞中；將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有0.2%阿拉伯糖和0.2%甘露糖的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)過(guò)夜（不含DAP）；取長(zhǎng)出的單個(gè)菌落繼續(xù)培養(yǎng)提取質(zhì)粒（pYA3493或者pS-SaoA），經(jīng)EcoRI單酶切，獲得3113bp條帶的菌株即為攜帶質(zhì)粒pYA3493的rSC0012，稱為rSC0012（pYA3493）；或者單酶切后獲得3890bp條帶的菌株為攜帶pS-SaoA的rSC0012，成為rSC0012(pS-SaoA)；rSC0012（pYA3493）或rSC0012(pS-SaoA)能夠在不加DAP的培養(yǎng)條件或在沒(méi)有DAP的動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制生長(zhǎng)。

3）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0011或rSC0018平衡-致死系統(tǒng)的構(gòu)建：

以公布于2015年(Zhenying Jib, Jing Shangb, Yuan Li, Shifeng Wang, Huoying Shi, Live attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis vaccinevector displaying regulated delayed attenuation and regulateddelayed antigen synthesis to confer protection againstStreptococcus suis in mice, Vaccine 33 (2015) 4858–4867)的不含有ΔsopB 的rSC0011株（ΔmanA、Δcrp::TT araC P_BAD、ΔrelA::araC P_BADlacI TT和ΔasdA）和rSC0018（C500ΔasdA）作為對(duì)照減毒株的準(zhǔn)備：

豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0018平衡-致死系統(tǒng)的構(gòu)建：

rSC0018（C500ΔasdA）菌株是本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中，以中國(guó)豬霍亂沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)弱毒疫苗株C500為模板，引入ΔasdA突變，命名為rSC0018株。然后挑取單菌落rSC0018用含有50mg/mL DAP的2mL的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜；次日按1:100比例，將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接種至20 mL的LB培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6，冰浴10 min，4℃、1500rpm離心10min收集細(xì)菌，沉淀細(xì)菌用冰浴預(yù)冷的10%甘油洗3遍，用25μl預(yù)冷的10%甘油重懸，即為rSC0018的感受態(tài)細(xì)胞。獲得rSC0018的感受態(tài)細(xì)胞后，用氯化鈣法，取1μL的質(zhì)粒pYA3493（由Dr.Curiss Roy III惠贈(zèng), Arizona State University）或者pS-SaoA轉(zhuǎn)化至rSC0018的感受態(tài)細(xì)胞中；將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有0.2%阿拉伯糖和0.2%甘露糖的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)過(guò)夜（不含DAP）；取長(zhǎng)出的單個(gè)菌落繼續(xù)培養(yǎng)提取質(zhì)粒（pYA3493或者pS-SaoA），經(jīng)EcoRI單酶切，獲得3113bp條帶的菌株即為攜帶質(zhì)粒pYA3493的rSC0018，稱為rSC0018（pYA3493）；或者單酶切后獲得3890bp條帶的菌株為攜帶pS-SaoA的rSC0018，成為rSC0018(pS-SaoA)；rSC0018（pYA3493）或rSC0018(pS-SaoA)能夠在不加DAP的培養(yǎng)條件或在沒(méi)有DAP的動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制生長(zhǎng)。

2、豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)與野毒株C78-3、減毒株rSC0011(pS- SaoA)、弱毒疫苗株rSC0018(pS-SaoA)的毒力比較：

為測(cè)定豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)的毒力，取豬霍亂沙門氏菌野毒株C78-3，中國(guó)現(xiàn)用豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗株rSC0018(pS-SaoA)、含有crp基因缺失的減毒株rSC0011(pS-SaoA)和含有fur基因缺失的減毒株rSC0012(pS-SaoA)株進(jìn)行半數(shù)致死量（LD₅₀）的測(cè)定和比較。

1）在6周齡BALB/c 小鼠中的LD₅₀的測(cè)定：

具體實(shí)施為，從-70℃超低溫冰箱中取出實(shí)驗(yàn)菌株，無(wú)菌劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)平板上，37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培養(yǎng)液中，37℃靜置培養(yǎng)18 h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培養(yǎng)液中；用于培養(yǎng)突變株的LB培養(yǎng)液加入0.2%的阿拉伯糖和0.2%甘露糖；等細(xì)菌濃度達(dá)到OD值為0.8～0.9時(shí)，取出菌株培養(yǎng)液，離心，將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)到10¹⁰CFU/ml后，用PBS 10倍稀釋到不同的稀釋濃度。

首先用腹腔注射途徑進(jìn)行攻毒。120只雌性6周齡 BALB/c鼠隨機(jī)分成12小組，每小組10只小鼠。3小組用于野毒株C78-3的LD₅₀的測(cè)定，稀釋度分別是10^-1，10^-2和10^-3；3小組用于中國(guó)現(xiàn)用弱毒疫苗株rSC0018的LD₅₀的測(cè)定，稀釋度分別是10^-6 ，10^-7 和10^-8 ；3小組用于豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0011(pS-SaoA)的LD₅₀的測(cè)定，稀釋度分別是10^-6 ，10^-7和10^-8；3小組用于豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)的LD₅₀的測(cè)定，稀釋度分別是10^-6 ，10^-7和10^-8；每只小鼠用100μL細(xì)菌懸液腹腔注射，連續(xù)觀察30日，計(jì)算小鼠的死亡數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野毒株C78-3的LD₅₀是2.2×10²； 疫苗株rSC0018的LD₅₀是2.6×10⁷；減毒株rSC0011(pS-SaoA)的LD₅₀是1.4×10⁷, 減毒株rSC0012(pS-SaoA)的LD₅₀是1.1×10⁸（見下表）。結(jié)果表明，減毒株rSC0012(pS-SaoA)的LD₅₀比強(qiáng)毒株C78-3降低了5×10⁵倍，比商用中國(guó)沙門氏菌疫苗株rSC0018的LD₅₀低4.2倍， 比含有ΔP_crp::TT araC P_BADcrp突變的減毒沙門氏菌rSC0011(pS-SaoA)的LD₅₀低7.9倍。證明豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)比中國(guó)現(xiàn)用弱毒疫苗株rSC0018和rSC0011(pS-SaoA)還要減毒。

通過(guò)口服方式進(jìn)行LD₅₀的測(cè)定。70只雌性6周齡 BALB/c鼠隨機(jī)分成7小組，每小組10只小鼠。3小組用于野毒株C78-3的LD₅₀的測(cè)定，稀釋度分別是10^-3，10^-4和10^-5；而中國(guó)現(xiàn)用弱毒疫苗株rSC0018(pS-SaoA)，豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0011(pS-SaoA)和豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)分別使用2小組，稀釋度為10^-8和10^-9；以上各組小鼠經(jīng)口服途徑攻毒，攻毒后連續(xù)觀察30日，每日記錄死亡小鼠。結(jié)果顯示，C78-3的LD₅₀為5.5×10⁴；rSC0018(pS-SaoA)，rSC0011(pS-SaoA)和rSC0012(pS-SaoA)在攻毒劑量大于10⁹時(shí)，小鼠都存活。說(shuō)明口服途徑這3株減毒株都不能致死6周齡 BALB/c小鼠（見下表）。下表中，口服和腹腔接種途徑，rSC0012(pS-SaoA)株和rSC0011(pS-SaoA)株的LD₅₀與C78-3比較差異顯著（ **： p<0.01 ）；通過(guò)腹腔接種途徑，rSC0012(pS-SaoA)株的LD₅₀比rSC0011(pS-SaoA)株的LD₅₀減毒7.8倍，差異顯著（##： p<0.01）。

2）在21日齡BALB/c 小鼠中的LD₅₀的測(cè)定：

具體實(shí)施為，從-70℃超低溫冰箱中取出實(shí)驗(yàn)菌株，無(wú)菌劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)平板上，37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培養(yǎng)液中，37℃靜置培養(yǎng)18 h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培養(yǎng)液中；用于培養(yǎng)突變株的LB培養(yǎng)液加入0.2%的阿拉伯糖和0.2%甘露糖；等細(xì)菌濃度達(dá)到OD值為0.8～0.9時(shí)，取出菌株培養(yǎng)液，離心，將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)到10¹⁰CFU/ml后，用PBS 10倍稀釋到不同的稀釋濃度。

通過(guò)口服方式進(jìn)行LD50的測(cè)定。120只雌性21日齡 BALB/c鼠隨機(jī)分成9小組，每小組10只小鼠。3小組用于野毒株C78-3的LD₅₀的測(cè)定，稀釋度分別是10^-3，10^-4和10^-5；而中國(guó)現(xiàn)用弱毒疫苗株rSC0018，豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0011(pS-SaoA)和豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)的分別使用3小組，稀釋度為10^-7、10^-8和10^-9；以上各組小鼠經(jīng)口服途徑攻毒，攻毒后連續(xù)觀察30日，每日記錄死亡小鼠。結(jié)果顯示，C78-3的LD₅₀為9.5×10²；rSC0018(pS-SaoA)和rSC0012(pS-SaoA)在攻毒劑量大于10⁹時(shí)，小鼠都存活（見下表）。說(shuō)明口服途徑這2株減毒株都不能致死小鼠，而rSC0011(pS-SaoA)組的小鼠在口服劑量為1.0×10⁹ 時(shí)小鼠開始出現(xiàn)皮毛粗糙，精神恍惚的癥狀，但是在攻毒后7d，這些癥狀消失，而在rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠未出現(xiàn)任何病理癥狀。說(shuō)明rSC0012(pS-SaoA)對(duì)幼鼠的毒力明顯小于rSC0011(pS-SaoA)株。

實(shí)驗(yàn)菌株在不同年齡段BALB/c鼠中的LD₅₀對(duì)比表：

3、豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012的定植能力評(píng)價(jià)：

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，含有crp基因延遲缺失的減毒豬霍亂沙門氏菌毒株rSC0011(pS-SaoA)經(jīng)口服21日齡仔豬時(shí)，可引起部分仔豬飲食下降，說(shuō)明rSC0011的減毒能力不夠，因此我們?cè)O(shè)計(jì)了基因調(diào)控延遲缺失豬霍亂沙門氏菌毒力基因fur的減毒株rSC0012，擬使其成為更加安全的疫苗候選株。因此本實(shí)施比較了含有fur基因缺失的減毒株rSC0012（pYA3493），和含有crp基因缺失的減毒株rSC0011（pYA3493），中國(guó)商用弱毒疫苗株rSC0018（pYA3493）（弱毒的對(duì)照組）和野毒株C78-3在6周齡和21d BALB/c小鼠的肝臟、脾臟和腸道派伊爾氏淋巴小結(jié)（payer`s patches）的定植能力。

1）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012在6周齡BALB/c小鼠中的定植能力：

從-70℃超低溫冰箱中取出實(shí)驗(yàn)菌株，無(wú)菌劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)平板上，37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜；次日挑取菌落置于5mL的LB培養(yǎng)液中，37℃靜置培養(yǎng)18 h；取其中的2.5mL置于47.5mL的LB培養(yǎng)液中；用于培養(yǎng)突變株的LB培養(yǎng)液加入0.2%的阿拉伯糖和0.2%甘露糖；等細(xì)菌濃度達(dá)到OD值為0.8～0.9時(shí)，取出菌株培養(yǎng)液，離心，將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)到10¹⁰CFU。

60只6周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分成20小組，每小組3只小鼠。5小組用于野毒株C78-3的定植實(shí)驗(yàn)；5小組用于疫苗株rSC0018的定植實(shí)驗(yàn)；5小組用于含有crp基因缺失的減毒株rSC0011（pYA3493）的定植實(shí)驗(yàn)；5小組用于含有fur基因缺失的減毒株rSC0012（pYA3493）的定植實(shí)驗(yàn)；每只小鼠口服10⁹ CFU/20ul細(xì)菌懸液；每菌株分別在接種后第3d、7d、14d、21d和28d取3只小鼠的肝臟、脾臟和腸道的派伊爾氏淋巴小結(jié)（payer s patches），經(jīng)稱重和無(wú)菌研磨，涂布于麥康凱培養(yǎng)基中分離細(xì)菌，計(jì)算組織的細(xì)菌量。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果為3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于豬霍亂野毒株C78-3是強(qiáng)毒株，BALB/c小鼠在口服10⁹ CFU的C78-3后的第3d就有大批小鼠死亡，無(wú)法將C78-3的定植實(shí)驗(yàn)進(jìn)行下去，口服C78-3后第3d在小鼠肝臟、脾臟和腸道派伊爾氏淋巴小結(jié)的定植菌量顯著高于rSC0018（pYA3493）、減毒株rSC0011（pYA3493）和rSC0012（pYA3493）的定植菌量（見圖16、17、18，$$，p<0.01）；而疫苗株rSC0018（pYA3493）、減毒株rSC0011（pYA3493）和rSC0012（pYA3493）在口服10⁹ CFU菌量后28d的時(shí)間內(nèi)，小鼠沒(méi)有發(fā)生死亡。

在肝臟，rSC0012（pYA3493）株只在攻毒后第3d能分離到，rSC0018（pYA3493）株在攻毒后第3-7d能分離到，但是rSC0011（pYA3493）株卻是在攻毒后第3-21d都能分離到，并且在接種rSC0011（pYA3493）株后第7-21d，其分離到的菌量都顯著高于rSC0012（pYA3493）株的定植菌量（見圖16，##，p<0.01）；rSC0018（pYA3493）株在第7d的定植菌量也顯著高于rSC0012（pYA3493）株的定植菌量（見圖16，**，p<0.01）；表明含有fur缺失的菌株rSC0012的毒力顯著弱于含有crp缺失菌株rSC0011。

在脾臟，rSC0012（pYA3493）株在攻毒后第3-7d能分離到，rSC0018（pYA3493）株只在攻毒后第3 d能分離到，但是rSC0011（pYA3493）株卻是在攻毒后第3-21d分離到,并且在接種rSC0011（pYA3493）株后第3-21d，其分離到的菌量都顯著高于rSC0012（pYA3493）株的定植菌量（見圖17，##，p<0.01）；結(jié)果表明，含有fur基因缺失的rSC0012（pYA3493）株對(duì)6周齡小鼠脾臟的入侵能力顯著弱于含有crp基因缺失的rSC0011（pYA3493）株，但是強(qiáng)于化學(xué)致弱毒株rSC0018（pYA3493）的入侵能力。表明rSC0012（pYA3493）株的毒力弱于rSC0011（pYA3493）株，強(qiáng)于rSC0018（pYA3493）株。

在腸道派伊爾氏淋巴小結(jié)，在攻毒后第3-28d，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力沒(méi)有差異；但是在攻毒后第7,21d ,28d，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力都顯著高于化學(xué)致弱株rSC0018（pYA3493）株的定植能力（見圖18，**，P<0.01）；表明在腸道派伊爾氏淋巴小結(jié)，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力相似；并在感染后期都顯著強(qiáng)于化學(xué)致弱株rSC0018（pYA3493）株。

2）豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)在21d BALB/c小鼠中的定植能力：

復(fù)蘇和擴(kuò)增菌株方法同豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012在6周齡BALB/c小鼠中的定植能力。

將60只21日齡BALB/c小鼠隨機(jī)分成20小組，每小組3只小鼠。5小組用于野毒株C78-3的定植實(shí)驗(yàn)；5小組用于疫苗株rSC0018的定植實(shí)驗(yàn)；5小組用于減毒株rSC0011（pYA3493）的定植實(shí)驗(yàn)；5小組用于減毒株rSC0012（pYA3493）的定植實(shí)驗(yàn)。每只小鼠口服10⁹ CFU/20μL（當(dāng)劑量為10⁹ CFU/20μL時(shí)，接種rSC0011（pYA3493）組小鼠出現(xiàn)顫抖，被毛粗糙等癥狀）；每菌株分別在接種后第3d、7d、14d、21d和28d取3只小鼠的肝臟、脾臟和腸道的派伊爾小結(jié)（payer s patches），經(jīng)稱重和無(wú)菌研磨，涂布于麥康凱培養(yǎng)基中分離細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由于豬霍亂野毒株C78-3是強(qiáng)毒株，BALB/c小鼠在口服10⁹ CFU的C78-3后的第2d就有大批小鼠死亡，無(wú)法將C78-3的定植實(shí)驗(yàn)進(jìn)行下去，口服C78-3后第3d在小鼠肝臟、脾臟和腸道派伊爾氏淋巴小結(jié)的定植菌量顯著高于rSC0018（pYA3493）、減毒株rSC0011（pYA3493）和rSC0012（pYA3493）的定植菌量（見圖19、20、21，$$,p<0.01）；而疫苗株rSC0018（pYA3493）、減毒株rSC0011（pYA3493）和rSC0012（pYA3493）在口服10⁹ CFU菌量后28d的時(shí)間內(nèi)，小鼠沒(méi)有發(fā)生死亡。

在肝臟，rSC0012（pYA3493）只在攻毒后第3-7d能分離到； rSC0018（pYA3493）株在攻毒后第3-14d分離到；而rSC0011（pYA3493）株在攻毒后的第3-21d都能分離到菌株，且分離的菌量都顯著高于rSC0012（pYA3493）株（圖19， #，P<0.05;##, P<0.01）；表明rSC0012（pYA3493）株的毒力弱于rSC0018（pYA3493）株(圖19， **,P<0.01)，更弱于rSC0011（pYA3493）株。

在脾臟，rSC0012（pYA3493）和rSC0018（pYA3493）株一樣，都只在攻毒后第3d能分離到，二者的分離菌量沒(méi)有差異，攻毒后第7-28d就分離不到菌株，而rSC0011（pYA3493）株在攻毒后的3-28d都能分離到菌株，分離的菌量顯著高于rSC0012（pYA3493）株（圖20，##，p<0.01）；表明rSC0011（pYA3493）株對(duì)21d小鼠的入侵能力顯著強(qiáng)于rSC0012（pYA3493）和rSC0018（pYA3493）株。

但是在腸道派伊爾氏淋巴小結(jié)中，只在接種后第7d，rSC0011（pYA3493）株的定植能力高于rSC0012（pYA3493）（圖21，#，p<0.05），其余時(shí)間段沒(méi)有差異；在接種后第14-28d，rSC0012（pYA3493）和rSC0011（pYA3493）株的定植能力都顯著高于rSC0018（pYA3493）株（圖21，**：P< 0.01）；表明在21d的BALB/c小鼠中，含有fur的基因缺失株在21d的小鼠腸道派伊爾氏淋巴小結(jié)的入侵能力與含有crp基因缺失株rSC0011（pYA3493）的侵襲能力相似，無(wú)顯著差異。

4、遞呈異源抗原pS-SaoA的減毒豬霍亂沙門氏菌株載體rSC0012的穩(wěn)定性：

挑取經(jīng)過(guò)PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定完全正確的rSC0012(pS-SaoA)單菌落接種于2mL LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。按培養(yǎng)12h為一代，將菌液按照1:100接種新鮮的LB液體培養(yǎng)基，如此連續(xù)傳至50代。取整10代單菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示有777 bp的SaoA基因的陽(yáng)性條帶（如圖22所示）。對(duì)菌株rSC0012(pS-SaoA)進(jìn)行抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后出現(xiàn)原核表達(dá)載體pYA3493和目的基因SaoA的條帶（777 bp）（如圖23所示）。檢測(cè)結(jié)果表明，pS-SaoA重組質(zhì)粒能在rSC0012中穩(wěn)定傳代。

四、對(duì)攜帶外源抗原的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)進(jìn)行在BALB/c小鼠中的免疫效果評(píng)價(jià)：

1、攜帶外源抗原的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)在6周齡BALB/c小鼠的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)：

為檢測(cè)rSC0012和rSC0011、rSC0018在遞送異源抗原誘導(dǎo)免疫原性能力的差異，用6周齡BALB/c小鼠比較了rSC0012(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)和rSC0018(pS-SaoA)作為豬鏈球菌疫苗抵抗野毒株豬鏈球菌2型（SS2）攻擊的保護(hù)性差異。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2次結(jié)果的綜合。

挑取實(shí)驗(yàn)株rSC0018(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0012(pYA3493)、rSC0012(pS- SaoA)、rSC0011(pYA3493)和rSC0011(pS-SaoA)于5 mL的LB液體培養(yǎng)基，于37℃震蕩培養(yǎng)8h，按體積比1:100接種于50mL的LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)至菌液的OD₆₀₀值為0.9左右，離心收集菌體，加入PBS重懸沉淀，連續(xù)10倍稀釋。取100μL連續(xù)10倍稀釋至合適的稀釋度并于麥康凱培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)，另外一部分菌液用于免疫小鼠。

用105只雌性6周齡BALB/c小鼠分成7組，每組15只小鼠。其中1組口服PBS作為陰性對(duì)照組，另外6組分別口服免疫10⁹CFU/20μL的疫苗株rSC0018(pYA3493)、rSC0018(pS-SaoA)、rSC0012(pYA3493)、rSC0012(pS-SaoA)、rSC0011(pYA3493)、rSC0011(pS-SaoA)菌液。首免后3周加強(qiáng)免疫一次。在加強(qiáng)免疫后7d， 每組取5只小鼠撲殺，取小鼠脾臟，肺臟制成勻漿，離心取上清，經(jīng)雙抗夾心ELISA法檢測(cè)上述樣品中抗豬鏈球菌SaoA蛋白的細(xì)胞因子的IFN-γ及IL-4含量；在首免后3周、5周，分別從小鼠的頜下靜脈采血，將收集到的血液于4℃過(guò)夜制得血清；同時(shí)用PBS沖洗陰道，收集陰道黏膜沖洗液。用間接ELISA檢測(cè)血清和陰道粘膜沖洗液中抗體效價(jià)；最后在加強(qiáng)免疫后2周，用野生型SS2經(jīng)腹腔注射攻毒，檢測(cè)各毒株的免疫保護(hù)效率。

結(jié)果顯示，除了PBS對(duì)照組(control)，首次免疫和加強(qiáng)免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產(chǎn)生的抗SaoA的血清抗體IgG都顯著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的血清抗體IgG（如圖24，**，P＜0.01）；各免疫組的小鼠均產(chǎn)生抗豬霍亂沙門氏菌外膜蛋白OMPs的IgG抗體，且加強(qiáng)免疫后抗體水平顯著增加，各組無(wú)明顯差異（如圖25所示）；首次免疫和加強(qiáng)免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產(chǎn)生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA都顯著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA（如圖26，**，P＜0.01）；在首免后第3周，免疫rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產(chǎn)生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA顯著高于免疫rSC0011(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA（如圖26，**，P＜0.01），但是到加強(qiáng)免疫后2周，免疫rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠和免疫rSC0011(pS-SaoA)組的小鼠產(chǎn)生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA沒(méi)有區(qū)別（如圖26所示）。

細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，rSC0011(pS-SaoA)及rSC0012(pS-SaoA) 免疫組肺臟和脾臟中細(xì)胞因子IFN-γ及IL-4的濃度均顯著高于rSC0018(pS-SaoA)免疫組（如圖27、28所示，**，P＜0.01）。rSC0011(pS-SaoA)免疫組肺臟及脾臟中IFN-γ水平均顯著高于rSC0012(pS-SaoA)（圖27，*，P＜0.05），而rSC0012(pS-SaoA)免疫組肺臟及脾臟中IL-4水平均顯著高于rSC0011(pS-SaoA)免疫組（圖28，*，P＜0.05；**，P＜0.01），表明含有延遲減毒fur突變比含有延遲減毒的crp突變的豬霍亂沙門氏菌減毒載體能誘導(dǎo)出更好的體液免疫水平應(yīng)答。

在加強(qiáng)免疫后2周，通過(guò)腹腔注射，對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行SS2的攻毒。結(jié)果表明，在rSC0011(pS- SaoA)接種組，經(jīng)5×LD₅₀，或者15×LD₅₀的豬鏈球菌2型菌攻毒后，在攻毒后的96h內(nèi)，有部分小鼠的皮毛蓬亂，但隨后恢復(fù)正常，連續(xù)觀察28天后，實(shí)驗(yàn)小鼠的存活率為100%（見下表：不同攻毒劑量下疫苗對(duì)6周齡BABL/C小鼠的保護(hù)效率比較表）。在rSC0012(pS-SaoA)接種組，用5×LD₅₀的SS2攻毒后，連續(xù)觀察28d，小鼠表現(xiàn)為健康，存活率為100%；而當(dāng)用15×LD₅₀的豬鏈球菌2型菌攻毒后，部分小鼠有精神萎靡，在攻毒后第5d，有2/20小鼠死亡，小鼠存活率為90%；在rSC0018(pS-SaoA)接種組，用5×LD₅₀的 SS2攻毒后，在攻毒后第3d，有6/20只小鼠死亡，連續(xù)觀察28d，存活率為30%；而當(dāng)用15×LD₅₀的SS2攻毒后，小鼠精神萎靡，在攻毒后第5d，所有小鼠死亡，小鼠存活率為0%；而空載體組rSC0011（pYA3493）、rSC0012（pYA3493）、rSC0018（pYA3493）以及PBS對(duì)照組，在攻毒后96小時(shí)內(nèi)所有小鼠死亡。結(jié)果表明（見表4），rSC0012(pS-SaoA)加強(qiáng)免疫后能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高的體液免疫應(yīng)答（IL-4）。

不同攻毒劑量下疫苗對(duì)6周齡BABL/C小鼠的保護(hù)效率比較表：

**： 與PBS免疫組和空載體免疫組的比較，差異顯著。

2、攜帶外源抗原的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)在21d BALB/c小鼠的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)：

為檢測(cè)rSC0012、rSC0011和rSC0018遞送豬鏈球菌SaoA蛋白在幼鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性的差異，本實(shí)施比較了用rSC0012(pS-SaoA)、rSC0011(pS-SaoA)和rSC0018(pS-SaoA)株在21d小鼠中的免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2次結(jié)果的綜合。

具體實(shí)施方法同攜帶外源抗原的豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012(pS-SaoA)在6周齡BALB/c小鼠的免疫保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，區(qū)別是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用21日齡的BALB/c小鼠。結(jié)果顯示，除了PBS對(duì)照組（control），首次免疫和加強(qiáng)免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產(chǎn)生的抗SaoA的血清抗體IgG都顯著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的血清抗體IgG（圖29，*，P＜0.05；**，P＜0.01）,并且首免后rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產(chǎn)生的抗SaoA的血清抗體IgG顯著高于免疫rSC0011(pS-SaoA)株的抗SaoA的血清抗體IgG（圖29，*，P＜0.05）；各免疫組的小鼠均產(chǎn)生抗豬霍亂沙門氏菌外膜蛋白OMPs的IgG抗體，且加強(qiáng)免疫后抗體水平顯著增加，各組無(wú)明顯差異（圖30）；首次免疫和加強(qiáng)免疫rSC0011(pS-SaoA)、rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產(chǎn)生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA都顯著高于免疫rSC0018(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA（圖31，**，P＜0.01）；首次免疫和加強(qiáng)免疫后，免疫rSC0012(pS-SaoA)組的小鼠產(chǎn)生的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA均顯著高于免疫rSC0011(pS-SaoA)株的抗SaoA的黏膜免疫抗體IgA（圖31，**，P＜0.01），表明在21d BALB/c小鼠中，缺失fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒株比缺失crp基因的減毒株能誘導(dǎo)出更強(qiáng)大的黏膜免疫應(yīng)答。

細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，rSC0011(pS-SaoA)及rSC0012(pS-SaoA) 免疫組肺臟和脾臟中細(xì)胞因子IFN-γ及IL-4的濃度均顯著高于rSC0018(pS-SaoA)免疫組（如圖32、33，**，P＜0.01）。rSC0011(pS-SaoA)免疫組肺臟及脾臟中IFN-γ水平均與免疫rSC0012(pS-SaoA)組沒(méi)有顯著差異（見圖32），而rSC0012(pS-SaoA)免疫組肺臟及脾臟中IL-4水平均顯著高于rSC0011(pS-SaoA)免疫組（圖33，**，P＜0.01），表明在21d小鼠中，含有延遲減毒fur突變比含有延遲減毒的crp突變的豬霍亂沙門氏菌減毒載體能誘導(dǎo)出更好的體液免疫水平應(yīng)答。

在加強(qiáng)免疫后2周，通過(guò)腹腔注射，對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行SS2的攻毒。結(jié)果表明，在rSC0011(pS-SaoA)接種組，經(jīng)10×LD₅₀，或者15×LD₅₀的SS2菌攻毒后，在攻毒后的96h內(nèi)，有部分小鼠的皮毛蓬亂，但隨后恢復(fù)正常，連續(xù)觀察28天后，實(shí)驗(yàn)小鼠的存活率為100%（見下表：不同攻毒劑量下疫苗對(duì)21日齡BABL/C小鼠的保護(hù)效率對(duì)比表）。在rSC0012(pS-SaoA)接種組，用10×LD₅₀的SS2攻毒后，連續(xù)觀察28d，小鼠表現(xiàn)為健康，存活率為100%；而當(dāng)用15×LD₅₀的豬鏈球菌2型菌攻毒后，部分小鼠有精神萎靡，在攻毒后第5d，有2/20小鼠死亡，小鼠存活率為90%；而空載體組rSC0011（pYA3493）、rSC0012（pYA3493）試驗(yàn)以及空白對(duì)照組在攻毒后96小時(shí)內(nèi)所有小鼠死亡。結(jié)果表明，在用10×LD₅₀劑量的SS2攻毒后，免疫rSC0012(pS-SaoA)與rSC0011(pS-SaoA)提供的保護(hù)效率相同；當(dāng)加大SS2的攻毒劑量后，免疫rSC0012(pS-SaoA)提供的保護(hù)效率要稍低于rSC0011(pS-SaoA) 提供的保護(hù)效率，但是二者沒(méi)有顯著差異。

不同攻毒劑量下疫苗對(duì)21日齡BABL/C小鼠的保護(hù)效率對(duì)比表：

**： 與PBS免疫組和空載體免疫組的比較，差異顯著。

綜上所述，本申請(qǐng)利用延遲減毒豬霍亂沙門氏菌的毒力基因fur的方法，成功地獲得了一株豬霍亂沙門氏菌減毒株rSC0012（C78-3 ΔmanA ΔrelA::araC P_BAD lacI TTΔP_fur33::TT araC P_BAD fur ΔasdA）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本申請(qǐng)的減毒菌株rSC0012在BALB/c小鼠上的LD₅₀比減毒菌株rSC0011（ΔmanA，ΔP_crp::TT araCP_BADcrp，ΔrelA::araC P_BADlacI TT，ΔasdA）要低7.9倍，比現(xiàn)有的豬霍亂沙門氏菌弱毒疫苗標(biāo)準(zhǔn)株低4.2倍，而比野生型菌株 C78-3低5×10⁵倍；結(jié)果表明，在相同基因背景的減毒菌株下，fur延遲缺失的菌株要比crp延遲缺失的菌株毒力低7.9倍。在6周齡BALB/c小鼠的定植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在接種菌株后28d，rSC0012株在派伊爾氏淋巴小結(jié)中的定植能力與減毒株rSC0011株的定植能力沒(méi)有顯著差異；而在21d BALB/c小鼠的定植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在接種菌株后7d，rSC0012株在派伊爾淋巴小結(jié)中的定植能力比減毒株rSC0011株低6倍，在肝臟和脾臟中細(xì)菌清除的時(shí)間顯著提前到接種第7d，相反在接種菌株21d，接種rSC0011株的6周齡和21d BALB/c小鼠的肝臟和脾臟中都可以分離到沙門氏菌；證明阿拉伯糖調(diào)控的fur基因缺失的毒株的毒力顯著低于阿拉伯糖調(diào)控的crp基因缺失的毒株的毒力。動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，攜帶豬鏈球菌2型SaoA蛋白的fur基因缺失減毒株rSC0012(pS-SaoA)株在6周齡21d的的BALB/c小鼠的肺臟和脾臟中，能誘導(dǎo)出更好的體液免疫應(yīng)答水平，同時(shí)能獲得很高的保護(hù)效率。

<110> 揚(yáng)州大學(xué)

<120> 一種基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌及其構(gòu)建方法

<160> 15

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acatgcatgc tgtgactggg atgacttctt cccg

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcgagctcg tgtaaatctt tcgaagagcc aa

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagctcgaga gtcatgcgga atctgtcctg

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcccccgggc acttttccgc aatcaaggca g

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctggtacct aggcctctag ataaataaaa gcagtttaca actcctagaa ttgt

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agaggtaccc tcgaggctag cccaaaaaaa cggg

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggggagctcc gctggtagtt ttgataactt aa

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gggggtacct acggcgacgg acacatgttc gct

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccaagcttg agctcgaggg cgttccggcg ctggtagaa

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgggtacccc agatattttc cagatcttca c

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acatgcatgc tgtgactggg atgacttctt cccg

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tcccccgggc acttttccgc aatcaaggca g

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgctctagat gtgcatggca atcgcccaac

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcccccgggt atctgcgtcg tcctaccttc

<210> 15

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工合成的SaoA片段

<400> 15

ggatcccaac ctgatggggg acaggctact tcaaaggcgg ttaatgtcaa aataccagca 60

gtagtacgac tatttggtcg tgagcttcta gaaaatgaat ttaaatttga gcttagagaa 120

gcgaatggcg aggaactccc tgtccttgat acagctcaaa atacaaaaga gggtcaagtt 180

agatttaaaa atctatcatt cgataagcct ggcaaatact ggtatacaat ttcagaagta 240

aaagatgagc ttggtggtat tgagtatgat tcgaaatata ttgtagcaaa aataactgta 300

gaagatcgaa acgggcaatt acaggcaatg atcgaattta ttgataatga caatgtcttt 360

aacaatttct atacacctgc tccagctgct gctagtcttt cgataaaaaa agtcctcgag 420

ggacgtacct taaacaccgg tgaattcgaa tttgttttaa aaaatgaaaa aggcgatgaa 480

atcgaaaagg taagcaatca agcagatggt tctgtaaact ttagtgccct aacatttaca 540

aaagagggaa cctataccta cactgtttca gaagttgatg gtggacttgg cgatattatc 600

tatgacaaat cagatattaa ggccactgtt actgtgaaag ataacaatca cggacaacta 660

gtctcaacag tgacttatga aaatagcgat caaatcttcg agaatatttt gaatcctggg 720

aagttaatag cgccaaccac ggatagcgtt attactgata atgaagtctc taaggaagca 780

ctggtcgac

<110> 揚(yáng)州大學(xué)

<120> 一種基于fur基因的豬霍亂沙門氏菌減毒載體菌及其構(gòu)建方法

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<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acatgcatgc tgtgactggg atgacttctt cccg

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tgcgagctcg tgtaaatctt tcgaagagcc aa

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aagctcgaga gtcatgcgga atctgtcctg

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcccccgggc acttttccgc aatcaaggca g

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cctggtacct aggcctctag ataaataaaa gcagtttaca actcctagaa ttgt

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<212> DNA

<213> 人工序列

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agaggtaccc tcgaggctag cccaaaaaaa cggg

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggggagctcc gctggtagtt ttgataactt aa

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<212> DNA

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gggggtacct acggcgacgg acacatgttc gct

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cccaagcttg agctcgaggg cgttccggcg ctggtagaa

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<212> DNA

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cgggtacccc agatattttc cagatcttca c

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 15

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工合成的SaoA片段

<400> 15

ggatcccaac ctgatggggg acaggctact tcaaaggcgg ttaatgtcaa aataccagca 60

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gcgaatggcg aggaactccc tgtccttgat acagctcaaa atacaaaaga gggtcaagtt 180

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aaagatgagc ttggtggtat tgagtatgat tcgaaatata ttgtagcaaa aataactgta 300

gaagatcgaa acgggcaatt acaggcaatg atcgaattta ttgataatga caatgtcttt 360

aacaatttct atacacctgc tccagctgct gctagtcttt cgataaaaaa agtcctcgag 420

ggacgtacct taaacaccgg tgaattcgaa tttgttttaa aaaatgaaaa aggcgatgaa 480

atcgaaaagg taagcaatca agcagatggt tctgtaaact ttagtgccct aacatttaca 540

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