本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種功能蛋白POX01167及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：木質(zhì)纖維素是世界上最豐富的可再生資源。利用木質(zhì)纖維素生物煉制生產(chǎn)生物液體燃料和生物基化學(xué)品對(duì)緩解當(dāng)今能源危機(jī)和日益惡化的環(huán)境問題具有重大的戰(zhàn)略意義。(Vishnu，M.，Mala，R.Trendsinbioconversionoflignocellulose：biofuels，platformchemicals&biorefineryconcept[J].ProgressinEnergyandCombustionScience2012，(38)：522-550；Miguel，V.，Jose，L.G.，Joaquina，L.，Juna-Lius，R.Biofuels2020：Biorefineriesbasedonlignocellulosicmaterials[J].MicrobBiotechnol2016，9(5)：585-594)。但是，目前以木質(zhì)纖維素為原料進(jìn)行生物煉制還沒有真正實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，主要瓶頸是微生物的纖維素酶產(chǎn)量低和成本高。(C.，Reyes-Sosa，F(xiàn)M.，Díez，B.Enzymatichydrolysisofbiomassfromwood[J].MicrobBiotechnol2016，9(2)：149-156；Klei-Maarcuschamer，D.，Oleskowicz-Popiel，P.，Simmons，BA.，Blanch，HW.Thechallengeofenzymecostintheproductionoflignocellulosicbiofuels[J].BiotechnolBioeng2012，109(4)：1083-1087)。在深入研究微生物纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)上，通過遺傳操作提高微生物纖維素酶基因的表達(dá)量，進(jìn)而提高纖維素酶的產(chǎn)量，是降低纖維素酶成本的重要途徑之一。生產(chǎn)中，纖維素酶主要來自于絲狀真菌，例如，木霉、青霉和曲霉等。(Gusakov，AV.AlternativestoTrichodermareeseiinbiofuelproduction[J].TrendsBiotechnol2011，29(9)：419-425；Yao，GS.，Li，ZH.，Gao，LW.，Wu，RM.，Kan，QB.，Liu，GD.，Qu，YB.RedesiginingtheregulatorypathwaytoenhancecellulaseproductioninPenicilliumoxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71；Florencio，C.，Cunha，F(xiàn).，Badino，A.，F(xiàn)arinas，C.，Ximenes，E.，Ladisch，M.SecretomeanalysisofTrichodermareeseiandAspergillusnigercultivatedbysubmergedandsequentialfermentationprocesses：Enzymeproductionforsugarcanebagassehydrolysis[J].EnzymeMicrobTech2016，90：53-60)。根據(jù)作用方式的不同，纖維素酶主要分為三類：內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EG，EC3.2.1.4)、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，CBH，EC3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL，EC3.2.1.21)(Lynd，LR，Weimer，PJ，vanZyl，WH，Pretorius，IS.Microbialcelluloseutilization：fundamentalsandbiotechnology[J].MicrobiolMoleculBiolR2002，66(3)：506-577；Glass，NL.，Schmoll，M.，Cate，JH.，Coradetti，S.Plantcellwalldeconstructionbyascomycetefungi[J].AnnuRevMicrobiol2013，67：477-498)。EG作用于纖維素鏈分子內(nèi)部，隨機(jī)水解纖維素分子內(nèi)的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生短的纖維素鏈或可溶性纖維寡糖，暴露出新的纖維素鏈末端。CBH沿著纖維素鏈末端由外向里水解β-1，4-糖苷鍵，釋放纖維二糖。上述酶解反應(yīng)為固相反應(yīng)，反應(yīng)速度慢，是纖維素酶水解的限速步驟。繼而是液相反應(yīng)，反應(yīng)速度快。在液相反應(yīng)中，EG和CBH繼續(xù)水解上述固相反應(yīng)產(chǎn)生的可溶性纖維寡糖產(chǎn)生纖維二糖，BGL將上述固相反應(yīng)和液相反應(yīng)產(chǎn)生的纖維二糖水解成葡萄糖。通過這三種酶的協(xié)同作用，纖維素酶將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，葡萄糖可以被微生物利用產(chǎn)生化學(xué)品如被釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精。(Wang，J.，Quirk，A.，Lipkowski，J.，Dutcher，JR.andClarke.AJ.Directinsituobservationofsynergismbetweencellulolyticenzymesduringthebiodegradationofcrystallinecellulosefibers[J].Langmuir2013，29(48)：14997-15005；Zhang，YHP.，Himmel，ME.，Mielenz，JR.Outlookforcellulaseimprovement：screeningandselectionstrategies[J].BiotechnolAdv2006，24(5)：452-481；Dashtban，M.，Schraft，H.，Qin，W.Fungalbioconversionoflignocellulosicresidues：opportunityandperspectives[J].IntJBiolSci2009，5(6)：578-595)。真菌纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。(Amore，A.，Giacobbe，S.andFaraco，V.Regulationofcellulaseandhemicellulasegeneexpressioninfungi[J].CurrGenomics2013，14(4)：230-249)。目前，鑒定的絲狀真菌纖維素酶基因的關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子為數(shù)不多，主要分為正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。例如，正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子主要包括草酸青霉(Penicilliumoxalicum)中ClrB(Li，ZH.，Yao，G.，Wu，R.，Gao，L.，Kan，Q.，Liu，M.，Yang，P.，Liu，G.，Qin，Y.，Song，X.，Zhong，Y.，F(xiàn)ang，X.，Qu，Y.Synergisticanddose-controlledregulationofcellulasegeneexpressioninPenicilliumoxalicum.PLoSGenet2015，11：e1005509)、ClrC(Lei，YF.，Liu，GD.，Yao，GS.，Li，ZH.，Qin，YQ.，Qu，YB.AnovelbZIPtranscriptionfactorClrCpositivelyregulatesmultiplestressresponses，conditionandcellulaseexpressioninPenicilliumoxalicum[J].ResMicrobiol2016(167)：424-435)和FlbC(Yao，GS.，Li，ZH.，Wu，RM.，Qin，YQ.，Liu，GD.，Qu，YB.PenicilliumoxalicumPoFlbCregulatesfungalasexualdevelopmentandisimportantforcellulasegeneexpression[J].FungalGenetBiol2016(86)：91-102)、粗糙脈胞菌(Neurosporacrassa)中Vib1(Xiong，Y.，Sun，JP.，Glass，NL.VIB1，alinkbetweenglucosesignalingandcarboncataboliterepression，isessentialforplantcellwalldegradationbyNeurosporacrassa[J].PLoSGenet2014，10：e1004500)和Clr1(Coradetti，ST.，Craig，JP.，Xiong，Y.，Shock，T.，Tian，C.，Glass，NL.Conservedandessentialtranscriptionfactorsforcellulasegeneexpressioninascomycetefungi.PNatlAcadSciUSA2012，109：7397-7402)、瑞氏木霉(Trichodermareesei)中Xyr1(Lichius，A.，Bidard，F(xiàn).，Buchholz，F(xiàn).，LeCrom，S.，Martin，J.，Schackwitz，W.，Austerlitz，T.，Grigoriev，IV.，Baker，SE.，Margeot，A.，Seiboth，B.，Kubicek，CP.GenomesequencingoftheTichodermareeseiQM9136mutantidentifiesatruncationofthetranscriptionalregulatorXYR1asthecauseforitscellulase-negativephenotype[J].BMCGenomics2015，16：326)和ACE3(Hakkinen，M.，Valkonen，M.，Westerholm-Parvinen，A.，Aro，N.，Arvas，N.，Vitikainen，M.，Penttila，M.，Saloheimo，M.，Pakula，T.ScreeningofcandidateregulatorsforcellulaseandhemicellulaseproductioninTrichodermareeseiandidentificationofafactoressentialforcellulaseproduction[J].BiothechnolBiofuel2014，7：14.)；負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子主要包括草酸青霉中的AmyR和CreA(Li，H.，Yao，G.，Wu，R.，Gao，L.，Kan，Q.，Liu，M.，Yang，P.，Liu，G.，Qin，Y.，Song，X.，Zhong，Y.，F(xiàn)ang，X.，Qu，Y.Synergisticanddose-controlledregulationofcellulasegeneexpressioninPenicilliumoxalicum[J].PLoSGenet2015，11：e1005509)和瑞氏木霉中的Ace1(Portnoy，T.，Margeot，A.，Seidl-Seiboth，V.，LeCrom，S.，Chaabane，F(xiàn)B.，Linke，R.，Seiboth，B.，Kubicek，CP.DifferentregulationofthecellulasetranscriptionfactorsXYR1，ACE2，andACE1inTrichodermareeseistrainproducinghighandlowlevelsofcellulase[J].EukaryotCell2011，10(2)：262-271)。鑒定的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的生物功能具有冗余性，且相互調(diào)控?；阼b定的真菌調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建的基因工程菌株比野生型菌株明顯提高了纖維素酶的產(chǎn)量。例如，在瑞氏木霉中過量表達(dá)ace3后纖維素酶的產(chǎn)量比野生型菌株的顯著提高(Hakkinen，M.，Valkonen，M.，Westerholm-Parvinen，A.，Aro，N.，Arvas，N.，Vitikainen，M.，Penttila，M.，Saloheimo，M.，Pakula，T.ScreeningofcandidateregulatorsforcellulaseandhemicellulaseproductioninTrichodermareeseiandidentificationofafactoressentialforcellulaseproduction[J].BiothechnolBiofuel2014，7：14)。最近，Yao等遺傳改造草酸青霉菌株114-2，通過缺失cre1和bgl2，過量表達(dá)clrB，構(gòu)建突變菌株RE-10。菌株RE-10的纖維素酶產(chǎn)量比野生型的提高了20倍(Yao，G.，Li，Z.，Gao，L.，Wu，R.，Kan，Q.，Liu，G.，Qu，Y.RedesigningtheregulatorypathwaytoenhancecellulaseproductioninPenicilliumoxalicum[J].BiotechnolBiofuel2015，8：71)。但是，真菌纖維素酶的產(chǎn)量仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足木質(zhì)纖維素工業(yè)規(guī)模生物煉制的需求。因此，鑒定絲狀真菌纖維素酶基因更多新的關(guān)鍵調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種功能蛋白POX01167及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自草酸青霉，命名為POX01167蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或兒個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a1)中的POX01167蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a2)中的POX01167蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(a2)中的POX01167蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或兒個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或兒個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述POX01167蛋白的基因(POX01167基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因具體可為如下(1)-(4)中任一所述的DNA分子：(1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；(2)序列表的序列3所示的DNA分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼所述POX01167蛋白的DNA分子；(4)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼所述POX01167蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實(shí)驗(yàn)中65℃下雜交并洗膜。含有所述POX01167基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)所述POX01167蛋白或POX01167基因的應(yīng)用，為如下(b1)-(b20)中的至少一種：(b1)調(diào)控微生物纖維素酶產(chǎn)量；(b2)調(diào)控微生物半纖維素酶產(chǎn)量；(b3)調(diào)控微生物羧甲基纖維素酶產(chǎn)量；(b4)調(diào)控微生物外切纖維素酶產(chǎn)量；(b5)調(diào)控微生物β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量；(b6)調(diào)控微生物木聚糖酶產(chǎn)量；(b7)調(diào)控微生物纖維素酶活力；(b8)調(diào)控微生物半纖維素酶活力；(b9)調(diào)控微生物羧甲基纖維素酶活力；(b10)調(diào)控微生物外切纖維素酶活力；(b11)調(diào)控微生物β-葡萄糖苷酶活力；(b12)調(diào)控微生物木聚糖酶活力；(b13)調(diào)控微生物纖維素酶基因的表達(dá)量；(b14)調(diào)控微生物半纖維素酶基因的表達(dá)量；(b15)調(diào)控微生物內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因的表達(dá)量；(b16)調(diào)控微生物纖維二糖水解酶基因的表達(dá)量；(b17)調(diào)控微生物β-葡萄糖苷酶基因的表達(dá)量；(b18)調(diào)控微生物木聚糖酶基因的表達(dá)量；(b19)調(diào)控微生物纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的表達(dá)量；(b20)調(diào)控微生物木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的表達(dá)量。所述(b1)-(b12)中，所述調(diào)控為正向調(diào)控。所述纖維素酶基因具體可為POX05587、POX04786、POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983、POX07535或POX06835。所述纖維二糖水解酶基因具體可為POX05587或POX04786。所述內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶基因具體可為POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983或POX07535。所述β-葡萄糖苷酶基因具體可為POX06835。所述半纖維素酶基因具體可為POX05916、POX06783或POX08484。所述木聚糖酶基因具體可為POX05916、POX06783或POX08484。所述纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄因子或所述木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄因子具體可為PoxCreA(碳代謝阻遏因子)、PoxClrB(纖維素降解調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子)、PoxFlbC(無性繁殖調(diào)控因子)、POX02484(纖維素酶和木聚糖酶基因表達(dá)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子)。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制微生物生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力的方法，包括如下步驟：抑制所述微生物中POX01167基因的表達(dá)，得到生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力降低的微生物。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制微生物生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力的方法，包括如下步驟：降低POX01167蛋白的表達(dá)量和/或活性，得到生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力降低的微生物。所述“抑制所述微生物中POX01167基因的表達(dá)”是通過向所述微生物中導(dǎo)入POX01167基因敲除盒實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明還保護(hù)一種制備重組微生物的方法，包括如下步驟：將抑制POX01167基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入出發(fā)微生物，得到生產(chǎn)纖維素酶和/或半纖維素酶的能力低于所述出發(fā)微生物的重組微生物。所述抑制POX01167基因表達(dá)的物質(zhì)具體可為POX01167基因敲除盒。所述抑制POX01167基因表達(dá)的物質(zhì)還可為干擾載體；所述干擾載體為含有POX01167基因敲除盒的重組載體。以上任一所述POX01167基因敲除盒具體為序列表的序列4所示的DNA分子。以上任一所述微生物或出發(fā)微生物可為青霉，具體可為草酸青霉，更具體可為草酸青霉HP7-1。以上任一所述微生物或出發(fā)微生物更具體可為以草酸青霉HP7-1為出發(fā)菌，敲除其Ku70基因得到的重組菌。以上任一所述微生物或出發(fā)微生物更具體可為草酸青霉突變體ΔPoxKu70。本發(fā)明還保護(hù)采用以上任一所述方法制備得到的重組微生物。所述重組微生物具體可為實(shí)施例中的ΔPOX01167-6，又稱為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)ΔPOXO1167，已于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNO.12965。本發(fā)明通過同源重組的方法敲除草酸青霉突變體ΔPoxKu70中的POX01167基因(將所有敲除POX01167基因的重組菌均命名為突變株ΔPOX01167)。突變株ΔPOX01167具有如下特點(diǎn)：(1)在葡萄糖誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，突變株ΔPOX01167能夠正常生長；在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，突變株ΔPOX01167生長受到影響。(2)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，突變株ΔPOX01167基本上喪失了分泌纖維素酶和木聚糖酶的能力。(3)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，相對(duì)于背景菌株ΔPoxKu70中，突變株ΔPOX01167中纖維素酶基因和木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低/升高。(4)在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，相對(duì)于背景菌株ΔPoxKu70中，突變株ΔPOX01167中已知關(guān)鍵纖維素酶基因和木聚糖酶基因的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低/升高。本發(fā)明提供了一種草酸青霉的功能蛋白POX01167，通過實(shí)驗(yàn)證明功能蛋白POX01167在調(diào)控纖維素酶基因和木聚糖酶基因的表達(dá)過程中起關(guān)鍵性作用，在提高纖維素酶產(chǎn)量中具有應(yīng)用潛力。附圖說明圖1為構(gòu)建基因POX01167敲除盒過程中的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖2為融合PCR產(chǎn)物的元件示意圖。圖3為突變株ΔPOX01167的PCR驗(yàn)證圖。圖4為突變株ΔPOX01167的Southern雜交驗(yàn)證圖。圖5為ΔPoxKu70、ΔPOX01167-6、ΔPOX01167-9和ΔPOX01167-11的纖維素酶和木聚糖酶活力檢測結(jié)果。圖6為ΔPoxKu70、ΔPOX01167-6、ΔPOX01167-9和ΔPOX01167-11的羧甲基纖維素酶活力檢測結(jié)果。圖7為ΔPoxKu70、ΔPOX01167-6、ΔPOX01167-9和ΔPOX01167-11的外切纖維素酶活力檢測結(jié)果。圖8為ΔPoxKu70、ΔPOX01167-6、ΔPOX01167-9和ΔPOX01167-11的β-葡萄糖苷酶活力檢測結(jié)果。圖9為ΔPoxKu70、ΔPOX01167-6、ΔPOX01167-9和ΔPOX01167-11的木聚糖酶活力檢測結(jié)果。圖10為ΔPoxKu70與突變株ΔPOX01167在葡萄糖培養(yǎng)條件下的生物量檢測結(jié)果。圖11為ΔPoxKu70與突變株ΔPOX01167在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的生長情況以及分泌的纖維素酶水解Avicel的能力分析。圖12為突變株ΔPOX01167在Avicel誘導(dǎo)條件下纖維素酶和半纖維素酶基因的RT-PCR檢測結(jié)果。圖13為突變株ΔPOX01167在Avicel誘導(dǎo)條件下已知轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的RT-PCR檢測結(jié)果。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。質(zhì)粒pCPXG418：參考文獻(xiàn)：Chen，MM.，JiangMG.，Shang，JJ.，Lan，XW.，YangF.，Huang，JK.，Nuss，DL.，Chen，BS.CYP1，ahypovirus-regulatedcyclophilin，isrequiredforvirulenceinthechestnutblightfungus[J].MolPlantPathol2011，12(3)，239-246；質(zhì)粒pCPXG418在文獻(xiàn)中的名稱為“transformationvectorpCPXG418”，公眾可以從廣西大學(xué)獲得。DNA純化試劑盒：天根生化科技有限公司，貨號(hào)：DP214。溶菌酶：索萊寶公司，貨號(hào)：L8120。蝸牛酶：索萊寶公司，貨號(hào)：S8280。裂解酶：Sigma公司，貨號(hào)：L1412-5G。PDA培養(yǎng)基：BD公司，貨號(hào)：5056836。再生培養(yǎng)基：酸水解酪蛋白1.0g、酵母提取物1.0g、蔗糖342.0g、瓊脂17.0g，蒸餾水定容至1L，115℃滅菌20分鐘?；九囵B(yǎng)基：KH2PO44.0g、(NH4)2SO44.0g、MgSO4·7H2O0.6g、CaCl20.6g、FeSO4·7H2O0.005g、MnSO40.0016g、ZnCl20.0017g、CoCl20.002g、Tween801.0g，蒸餾水定容至1L，pH5.5；115℃滅菌20分鐘。葡萄糖培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入葡萄糖，葡萄糖在培養(yǎng)基中的終濃度為1g/100mL。Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中加入微晶纖維素(Avicel)，Avicel在培養(yǎng)基中的終濃度為2g/100mL。CM培養(yǎng)基：20×硝酸鹽50mL、微量元素混合液1mL、葡萄糖10.0g、蛋白胨2.0g、酵母提取物1.0g、酸水解酪蛋白1.0g，調(diào)pH至6.5；115℃滅菌20分鐘。20×硝酸鹽：NaNO3120g、KCl10.4g、MgSO4.7H2O10.4g、KH2PO430.4g，蒸餾水定容至1L；高壓滅菌后室溫保存。微量元素混合液：ZnSO4.7H2O2.2g、H3BO31.1g、MnCl2.4H2O0.5g、FeSO4.7H2O0.5g、CoCl2.6H2O0.17g、CuSO4.5H2O0.16g、Na2MoO4.2H2O0.15g、Na4EDTA5.0g，蒸餾水定容至100mL。酶解液：溶菌酶0.2g、蝸牛酶0.3g、裂解酶0.3g，溶于50mLOM溶液中；28℃，180rpm震蕩30分鐘后離心，將上清液過濾除菌，得到酶解液。OM溶液：MgSO4·7H2O73.92g、NaH2PO40.3g，溶于400mL去離子水；用1MNa2HPO4水溶液調(diào)節(jié)pH至5.8，蒸餾水定容至500mL。Trappingbuffer溶液：山梨醇36.4g、Tris6.05g，溶于400mL去離子水中，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，蒸餾水定容至500mL。STC溶液：山梨醇91g、Tris6g、CaCl25.55g，溶于400mL去離子水中，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，蒸餾水定容至500mL。PTC溶液：聚乙二醇335040g、Tris3g、CaCl22.25g，溶于200mL去離子水中，用稀HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，蒸餾水定容至250mL。0.1％吐溫80溶液：由吐溫80和水組成，吐溫80的體積百分含量為0.1％。實(shí)施例1、功能蛋白POX01167及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)經(jīng)過對(duì)草酸青霉(Penicilliumoxalicum)菌株HP7-1的基因組進(jìn)行大量序列分析、表達(dá)量分析與功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新蛋白及其編碼基因。草酸青霉菌株HP7-1的基因組序列分析的文獻(xiàn)如下：Zhao，S.，Yan，YS.，He，QP.，Yang，L.，Yin，X.，Li，CX.，Mao，LC.，Liao，LS.，Huang，JQ.，XieSB.，Nong，QD.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，YR.，Duan，CJ.，Liu，JL.，F(xiàn)eng，JX.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutantEU2106，andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[J].BiotechnolBiofuel2016，9：203；草酸青霉菌株HP7-1在文獻(xiàn)中的名稱為“PenicilliumoxalicumstrainHP7-1”。草酸青霉菌株HP7-1保藏號(hào)為：CGMCC10781，公眾也可以從廣西大學(xué)獲得。將序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)命名為POX01167，由733個(gè)氨基酸殘基組成。將編碼POX01167的基因命名為POX01167基因，POX01167基因的開放閱讀框(ORF)如序列表的序列2所示。POX01167基因的基因組DNA如序列表的序列3所示。實(shí)施例2、POX01167基因敲除盒的構(gòu)建1、提取草酸青霉菌株HP7-1的基因組DNA。2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用引物POX01167-left-F和引物POX01167-left-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到POX01167基因ORF上游的2299bp片段(電泳結(jié)果見圖1的泳道1)，稱為POX01167左臂。POX01167-left-F：5’-GATCTGGTAGCCAATCCATTTC-3’；POX01167-left-R：5’-TTTAGAGGTAATCCTTCTTTCTAGAGGCCGACGACTTGAGAAACTAT-3’。3、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用引物POX01167-right-F和引物POX01167-right-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到POX01167基因ORF下游的2336bp片段(電泳結(jié)果見圖1的泳道3)，稱為POX01167右臂。POX01167-right-F：5’-TCCTTCAATATCATCTTCTGTCGACGGCAGCCCGCGGAGTG-3’；POX01167-right-R：5’-GACACGAAAAGGGGGGAAAAA-3’。4、以質(zhì)粒pCPXG418為模板，采用引物G418-F和引物G418-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到抗生素G418抗性基因的編碼序列(1890bp)(電泳結(jié)果見圖1的泳道2)。G418-F：5’-TCTAGAAAGAAGGATTACCTCTAAA-3’；G418-R：5’-GTCGACAGAAGATGATATTGAAG-3’。5、將步驟2、步驟3和步驟4得到的三個(gè)PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化，然后按照摩爾比1∶1∶1混合后，進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，得到PCR混合產(chǎn)物。融合PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性98℃3min；98℃30s，58℃30s，72℃2min，一共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)；72℃10min。融合PCR產(chǎn)物的元件示意圖見圖2。6、以步驟5得到的PCR混合產(chǎn)物為模板，采用引物POX01167-nest-F和引物POX01167-nest-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到5482bpPCR產(chǎn)物(電泳結(jié)果見圖1的泳道4)。POX01167-nest-F：5’-CAATGATGGCGAGTGGAGT-3’；POX01167-nest-R：5’-TCTGACTAAGTATGTCCCTTTGATT-3’。經(jīng)測序，得到的融合PCR產(chǎn)物如序列表的序列4所示。將序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子命名為POX01167基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-1905位核苷酸為POX01167左臂區(qū)段，第1906-3795位核苷酸為G418抗性基因區(qū)段，第3796-5482位核苷酸為POX01167右臂區(qū)段。實(shí)際應(yīng)用中，也可以直接人工合成序列4所示DNA分子。實(shí)施例3、草酸青霉POX01167基因缺失突變株ΔPOX01167的構(gòu)建與驗(yàn)證一、草酸青霉突變株ΔPOX01167的構(gòu)建1、以草酸青霉菌株HP7-1為出發(fā)菌，敲除其Ku70基因，得到草酸青霉突變體ΔPoxKu70。記載草酸青霉突變體ΔPoxKu70，以及敲除PoxKu70基因的具體步驟的文獻(xiàn)如下：Zhao，S.，Yan，YS.，He，QP.，Yang，L.，Yin，X.，Li，CX.，Mao，LC.，Liao，LS.，Huang，JQ.，XieSB.，Nong，QD.，Zhang，Z.，Jing，L.，Xiong，YR.，Duan，CJ.，Liu，JL.，F(xiàn)eng，JX.Comparativegenomic，transcriptomicandsecretomicprofilingofPenicilliumoxalicumHP7-1anditscellulaseandxylanasehyper-producingmutantEU2106.andidentificationoftwonovelregulatorygenesofcellulaseandxylanasegeneexpression[J].BiotechnolBiofuel2016，9：203；草酸青霉突變體ΔPoxKu70在文獻(xiàn)中的名稱為“PenicilliumoxalicummutantΔPoxKu70”。草酸青霉突變體ΔPoxKu70保藏號(hào)為：CGMCC3.15650，公眾也可從廣西大學(xué)獲得。2、制備草酸青霉突變體ΔPoxKu70的原生質(zhì)體(1)將步驟1得到的草酸青霉突變體ΔPoxKu70接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)6天后，用0.1％吐溫80溶液將平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液(1×108個(gè)孢子/mL)。(2)取2mL步驟(1)的孢子懸浮液，接種至200mLCM培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)8小時(shí)。(3)完成步驟(2)后，4℃、3500rpm離心，收集菌絲，用0.6MMgSO4水溶液洗滌2次。(4)取(3)得到的菌絲，用酶解液重懸，28℃、180rpm振蕩反應(yīng)2-3小時(shí)以進(jìn)行酶解；用顯微鏡觀察到大部分菌絲形成原生質(zhì)體后，按每管12.5mL分裝到50mL離心管中，加入2倍體積的Trappingbuffer溶液，4℃、3500rpm離心30分鐘，觀察到明顯的分層現(xiàn)象。(5)用巴氏吸管小心地吸出步驟(4)中間層的原生質(zhì)體至新的50mL離心管中，加入2倍體積1M山梨醇水溶液漂洗2次，4℃、3500rpm離心15分鐘，再使用20mLSTC溶液漂洗2次后離心，棄上清，得到原生質(zhì)體。3、突變株ΔPOX01167的構(gòu)建(1)將4體積份的STC溶液和1體積份的PTC溶液混合，得到混合液，用混合液重懸步驟2得到的原生質(zhì)體，得到原生質(zhì)體溶液(調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL)。(2)用實(shí)施例2得到的POX01167基因敲除盒DNA轉(zhuǎn)化ΔPoxKu70原生質(zhì)體(方法參照文獻(xiàn)：Churchill，ACL.，Ciuffetti，LM.，Hansen，DR.，VanEtten，HD.，VanAlfen，NK.TransformationofthefungalpathogenCryphonectriaparasiticawithavarietyofheterologousplasmids[J].CurrGenetics1990，17：25-31)，具體步驟如下：①將5μgPOX01167敲除盒DNA和1μL100mM亞精胺溶液混合后加入到100μL步驟(1)制備的原生質(zhì)體溶液中，混合均勻，冰上反應(yīng)30分鐘；②反應(yīng)結(jié)束后向溶液中加入1mLPTC溶液，混合均勻，室溫放置25分鐘；③向混合液中加入2mLSTC溶液混合均勻，將混合液加入到30mL預(yù)熱的再生培養(yǎng)基中，混合均勻，將上述混合液倒入到無菌培養(yǎng)皿中(按每個(gè)培養(yǎng)皿分別倒入2-5mL)；待完全凝固后，室溫放置30分鐘，加入40mL含有G418(800μg/mL)與潮霉素(250μg/mL)的PDA培養(yǎng)基，覆蓋在再生培養(yǎng)基的表面，完全凝固后28℃倒置培養(yǎng)5天。④將步驟③的轉(zhuǎn)化雙層板的孢子用0.1％吐溫80溶液沖洗，放入到新的離心管中，用無菌水梯度稀釋孢子懸浮液，將每個(gè)稀釋梯度的孢子懸浮液涂在兩個(gè)含有G418(800μg/mL)與潮霉素(250μg/mL)的PDA平板上，28℃培養(yǎng)4天，挑選單菌落，隨機(jī)選取三個(gè)候選突變株(Δ6、Δ9和Δ11)，提取各候選突變株基因組DNA，采用引物POX01167-left-F和引物POXG418-R、引物POXG418-F和引物POX01167-right-R、引物POX01167-F和引物POX01167-R進(jìn)行PCR驗(yàn)證。POX01167-left-F：5’-GATCTGGTAGCCAATCCATTTC-3’：POXG418-R：5’-ATGCTCCTCTTCTTTACTCTGATAG-3’；POXG418-F：5’-GATAATAATGTCCTCGTTCCTGTCT-3’；POX01167-right-R：5’-GACACGAAAAGGGGGGAAAAA-3’；POX01167-F：5’-CCAAAAGGTATGGGGGGATG-3’；POX01167-R：5’-GGTAGCACAAATGGCGTCCC-3’。結(jié)果如圖3所示。圖3中，泳道M為1kbDNAMarker，泳道1為Δ6的鑒定結(jié)果，泳道2為Δ9的鑒定結(jié)果，泳道3為Δ11的鑒定結(jié)果，泳道4為突變體ΔPoxKu70的對(duì)照，泳道5為ddH2O陰性對(duì)照。圖3A為用引物對(duì)POX01167-left-F/POXG418-R擴(kuò)增的左臂的PCR產(chǎn)物；圖3B為用引物對(duì)POXG418-F/POX01167-right-R擴(kuò)增的右臂的PCR產(chǎn)物；圖3C為用引物對(duì)POX01167-F/POX01167-R檢測POX01167基因是否被敲除。結(jié)果表明，菌株Δ6、Δ9和Δ11都給出2399bp的左臂DNA片段(圖3A)、2436bp的右臂DNA片段(圖3B)，突變體ΔPoxKu70對(duì)照因沒有G418抗性基因的存在都沒有給出上述左臂DNA片段和右臂DNA片段。突變體ΔPoxKu70對(duì)照給出了1677bp的POX01167基因片段(圖3C中的泳道4)，而菌株Δ6、Δ9和Δ11都沒有給出1677bp的POX01167基因片段(圖3C中的泳道1-3)，這些結(jié)果表明菌株Δ6、Δ9和Δ11中POX01167基因已被敲除。⑤提取三個(gè)候選突變株(Δ6、Δ9和Δ11)和突變體ΔPoxKu70的基因組DNA，將基因組DNA采用SacII酶切后進(jìn)行Southern雜交分析，結(jié)果如圖4所示。圖4中，泳道M為1kbDNAMarker，泳道1為突變體ΔPoxKu70的對(duì)照，泳道2為Δ6的鑒定結(jié)果，泳道3為Δ9的鑒定結(jié)果，泳道4為Δ11的鑒定結(jié)果。結(jié)果表明，Δ6、Δ9和Δ11均得到大小為6251bp的雜交帶，突變體ΔPoxKu70得到4133bp的雜交帶，與預(yù)計(jì)結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，將POX01167基因敲除盒導(dǎo)入草酸青霉突變體ΔPoxKu70得到的三個(gè)轉(zhuǎn)化子(Δ6、Δ9和Δ11)均為POX01167基因被敲除的突變菌株，分別命名為ΔPOX01167-6、ΔPOX01167-9和ΔPOX01167-11。將敲除POX01167基因的該3個(gè)突變菌株均命名為突變株ΔPOX01167。實(shí)施例4、草酸青霉突變株ΔPOX01167纖維素酶和木聚糖酶活力的測定待測菌株為：ΔPoxKu70、ΔPOX01167-6、ΔPOX01167-9和ΔPOX01167-11。1、將待測菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)6天。2、完成步驟1后，用0.1％吐溫80溶液將平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液(1×108個(gè)孢子/mL)。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，離心收集菌體，用無菌水洗滌2-3次。4、取步驟3得到的菌體(濕重為1g)，轉(zhuǎn)接到100mLAvicel液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)5天。分別于培養(yǎng)1天、2天、3天、4天和5天后取樣，8000rpm離心10min，收集上清液，即為粗酶液。檢測粗酶液的如下各項(xiàng)酶活：濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力(CMC酶活力)、外切纖維素酶活力(pNPC酶活力)、β-葡萄糖苷酶活力(pNPG酶活力)和木聚糖酶活力。檢測方法參照文獻(xiàn)：Ghose，T.K.Measurementofcellulaseactivities[J].PureandAppliedChemistry1959，(59)：257-268；Gokhale，D.V.，Puntambekar，U.S.，Deobagkar，D.N.，Peberby，J.F.ProductionofcellulolyticenzymesbymutantsofAspergillusnigerNCIM1207[J].EnzymeMicrobialTechnol1988，(10)：442-445。結(jié)果如圖5-圖9所示。與ΔPoxKu70相比，三株突變株(ΔPOX01167-6、ΔPOX01167-9和ΔPOX01167-11)的濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力、外切纖維素酶活力、β-葡萄糖苷酶活力和木聚糖酶活力均顯著降低。結(jié)果表明，POX01167為菌株生產(chǎn)濾紙酶、羧甲基纖維素酶、外切纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的正調(diào)控蛋白。實(shí)施例5、草酸青霉突變株ΔPOX01167在葡萄糖液體培養(yǎng)基中生物量的測定待測菌株為：ΔPOX01167-6和ΔPoxKu70。1、將待測菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃靜置培養(yǎng)6天。2、完成步驟1后，用0.1％吐溫80溶液將PDA平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液(1×108個(gè)孢子/mL)。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。分別于培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)和72小時(shí)后，收集培養(yǎng)體系中的所有菌絲體，50℃烘干至恒重，測定生物量(菌絲體干重)。結(jié)果如圖10所示。結(jié)果表明，ΔPOX01167-6在葡萄糖液體培養(yǎng)基中的生物量與ΔPoxKu70菌株的生物量沒有顯著差異，表明POX01167基因的缺失不影響草酸青霉的基本代謝，ΔPOX01167-6能利用葡萄糖正常生長。實(shí)施例6、POX01167基因的缺失對(duì)草酸青霉在Avicel培養(yǎng)條件下的生長情況和分泌的纖維素酶的水解能力檢測待測菌株為：ΔPOX01167-6和ΔPoxKu70。1、將待測菌株接種于無菌PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)6天。2、用0.1％吐溫80溶液將PDA平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液并將濃度調(diào)整到1×108個(gè)/mL。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm培養(yǎng)24小時(shí)，收集菌絲體；將菌絲體轉(zhuǎn)接至100mLAvicel誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28℃、180rpm培養(yǎng)4天后，8000rpm離心10min，收集上清液，即為胞外粗酶液。采用等體積的水替代孢子懸浮液作為空白對(duì)照。突變株ΔPOX01167-6與ΔPoxKu70的生長情況如圖11A，結(jié)果顯示突變株ΔPOX01167-6不能利用Avicel，生長受到影響。取胞外粗酶液，以1％Avicel為底物，進(jìn)行酶水解實(shí)驗(yàn)。酶水解實(shí)驗(yàn)的具體方法：取25mL胞外粗酶液與25mL的1％Avicel混合均勻，將混合物置于50℃恒溫水浴鍋反應(yīng)24小時(shí)。分別取6小時(shí)、9小時(shí)、12小時(shí)與24小時(shí)的酶解產(chǎn)物，通過高效液相色譜法(HPLC)分析酶解液中的組分，用濃度為1mg/mL的葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果如圖11B所示。結(jié)果表明，酶水解24小時(shí)時(shí)，ΔPoxKu70粗酶液酶解反應(yīng)的葡萄糖產(chǎn)量可以達(dá)到約1.4g/L，而ΔPOX01167-6粗酶液酶解反應(yīng)的整個(gè)過程中基本上沒有葡萄糖產(chǎn)生，表明ΔPOX01167-6的粗酶液中沒有足夠的纖維素酶，說明在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，ΔPOX01167-6不能正常產(chǎn)生纖維素酶。實(shí)施例7、POX01167基因的缺失對(duì)草酸青霉纖維素酶編碼基因與其它轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)錄水平的影響待測菌株為：ΔPOX01167-6和ΔPoxKu701、將待測菌株接種于無菌PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)6天。2、用0.1％吐溫80溶液將PDA平板表面的孢子洗脫，得到孢子懸浮液并將濃度調(diào)整到1×108個(gè)/mL。3、將1mL步驟2得到的孢子懸浮液接種至100mL葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm培養(yǎng)24小時(shí)，收集菌絲體；將菌絲體轉(zhuǎn)接至100mLAvicel誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28℃、180rpm培養(yǎng)。分別收集、提取誘導(dǎo)培養(yǎng)第4小時(shí)、第12小時(shí)、第24小時(shí)、第48小時(shí)的待測菌株總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行定量RT-PCR檢測，檢測關(guān)鍵纖維素酶基因(2個(gè)CBH基因：POX05587和POX04786；7個(gè)EG基因：POX01166、POX02740、POX04173、POX05571、POX06147、POX06983和POX07535；1個(gè)BGL基因：POX06835)和半纖維素酶基因(3個(gè)XYN基因：POX05916、POX06783和POX08484)的表達(dá)情況。采用actin基因作為內(nèi)參基因。RT-PCR檢測引物如下所示(5’→3’)：actin-F：CTCCATCCAGGCCGTTCTG；actin-R：CATGAGGTAGTCGGTCAAGTCAC；POX05587-F：GTACTTGCGATCCTGATGGG；POX05587-R：CCACGGTGAAGGGAGACTTG；POX04786-F：TACTACGCTTCCGAGGTTCAGAGPOX04786-R：GTGTCCAGCCAAACGAAGG；POX01166-F：CGATACTACGGCAACATCATCAC；POX01166-R：AGGCACCAGTCCACGAGTTT；POX07535-F：CGACTACTTGACCCAGCACCA；POX07535-R：CTAGTACACGCTCGCAGACCA；POX06983-F：GATCAACCACCAGGGTCTCAA；POX06983-R：CAAACAACAGCCACGGAGTAAG；POX06147-F：CACAATTACGCTCGCTGGAA；POX06147-R：GGCTCGTTCATCACACCAAA；POX02740-F：GTTCAGTTCCTGATGGAAAGATTG；POX02740-R：CATAACCGCCTGCTTGAGTG；POX04137-F：CGGCACTCTCGGCAAGGATTA；POX04137-R：CATCAGGAAGGGGACACGGAA；POX05571-F：AACCTGGAAGAACGGCACC；POX05571-R：CCTTGTCACAGTCATCGGAGC；POX06835-F：GTGCTGGATGGGAACAGGA；POX06835-R：TACGAACGCCGAGAGGAGA；POX08484-F：ACAAGCACACGCAGGTCAA；POX08484-R：CGCTGAAGTGGTTGGCAGT；POX06783-F：TGAGCCCAGGACCATCAACTT；POX06783-R：TACCCTTGCTTTTGCCGCC；POX05916-F：ATCGAGAATCAGGGCACAAAG；POX05916-R：ATCCGCCAACGAAGGTGT。結(jié)果如圖12所示，其中差異表達(dá)量表示的是突變株ΔPOX01167-6中纖維素酶基因或木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄水平減去ΔPoxKu70中這些基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，在Avicel誘導(dǎo)第4小時(shí)時(shí)，ΔPOX01167-6中4個(gè)EG基因(POX06147、POX02740、POX04173和POX05571)與3個(gè)XYN基因(POX08484和POX06783)的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于ΔPoxKu70中這些基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，上調(diào)程度介于50.01％-341.44％之間，相反，其它纖維素酶基因明顯下調(diào)，下調(diào)程度介于25.96％-87.75％之間。在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)第12小時(shí)、第24小時(shí)和第48小時(shí)時(shí)，ΔPOX01167-6中兒乎所有纖維素酶基因與木聚糖酶基因明顯下調(diào)，下調(diào)程度介于22.30％-99.49％之間。進(jìn)一步繼續(xù)檢測轉(zhuǎn)錄因子PoxCreA(碳代謝阻遏因子)、PoxClrB(纖維素降解調(diào)控子)、PoxFlbC(無性繁殖調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子)、轉(zhuǎn)錄因子POX02484(纖維素酶和木聚糖酶基因表達(dá)的調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子)的編碼基因相對(duì)表達(dá)水平。采用actin基因作為內(nèi)參基因。RT-PCR檢測引物如下所示(5’→3’)：PoxCreA-F：TCCCCTCCTCACTCCTTCTC；PoxCreA-R：GCATCGTCATCCTCGTTGG；PoxClrB-F：CTTCCAGGCGTCTCTCGTTC；PoxClrB-R：CGCTTGCTGGCTTCGTAAA；PoxFlbC-F：AACTTTTGGAGACGCCCTTG；PoxFlbC-R：GGAGGAGGTAGATGAGTGATTGGT；POX02484-F：GCCCTTTTATGTCCCCTTACGA；POX02484-R：CAAACCATCCTTCATCACCAAA。結(jié)果如圖13所示，其中差異表達(dá)量表示的是突變株ΔPOX01167-6中已知轉(zhuǎn)錄因子基因的轉(zhuǎn)錄水平減去ΔPoxKu70中這些基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，在Avicel為誘導(dǎo)碳源的培養(yǎng)條件下，ΔPOX01167-6中除了轉(zhuǎn)錄因子編碼基因PoxClrB在誘導(dǎo)培養(yǎng)第12小時(shí)時(shí)上調(diào)外，其余所有已知轉(zhuǎn)錄因子編碼基因在誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)后明顯下調(diào)，下調(diào)程度介于13.25％-88.35％之間。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子POX01167在Avicel誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，對(duì)草酸青霉關(guān)鍵纖維素酶基因與木聚糖酶基因的表達(dá)，以及已知重要的纖維素酶基因和木聚糖酶基因的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)起關(guān)鍵調(diào)控作用。將上述實(shí)施例中的ΔPOX01167-6，又稱為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)ΔPOXO1167，于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；郵編：100101)，保藏編號(hào)為CGMCCNO.12965。<110>廣西大學(xué)<120>功能蛋白POX01167及其編碼基因與應(yīng)用<130>GNCYXMN161915<160>4<210>1<211>733<212>PRT<213>草酸青霉<400>1MetThrThrProIleSerThrSerAspProThrAlaThrThrValLys151015ProArgArgValLeuAlaCysValLeuCysGlnGlnArgLysSerLys202530CysAspArgLysPheProCysAlaAsnCysValArgAlaAsnValGln354045CysGluGlnAlaValArgGlnArgArgArgArgPheProGluArgGlu505560LeuLeuAlaArgLeuArgLeuTyrGluSerValLeuArgGlnHisAsn65707580IleLysPheAspProLeuHisThrProThrAlaAspHisArgSerPro859095SerAspAspGlyArgAspAspLeuProAspGlyAlaGluSerGluGly100105110ThrLeuGlyAspThrAsnAlaLeuProSerLysGluLysProAlaVal115120125GlnProLysAlaLeuAsnLeuTrpHisAlaMetSerGlnLysAlaVal130135140AsnSerGlyAspAspGlyAsnAlaGlyGluAspAspGluAsnAspThr145150155160GlyPheLeuHisAspAsnAspAspLeuArgHisAlaValIleLysLys165170175AlaTrpAsnHisMetPheGlnGlyGlnGlyAsnAspHisLeuLeuPhe180185190GlyProProValGlyThrIleAspLeuSerAlaSerHisProSerGln195200205AlaHisIlePheArgLeuTrpGlnIleTyrLeuAspAsnValAsnPro210215220LeuLeuLysValThrHisThrProThrLeuGlnSerArgIleIleAsp225230235240AlaValSerAspIleAlaAsnIleSerProThrLeuGluAlaLeuMet245250255PheSerIleTyrCysValSerLeuMetSerLeuSerGlyGluGlnCys260265270ArgAlaMetPheGlyAlaAlaArgLysGluLeuLeuAlaSerTyrGln275280285PheAlaCysGlnGlnAlaLeuArgArgCysGlyValLeuArgSerSer290295300AspArgGluCysLeuThrAlaLeuTyrLeuTyrLeuValSerIleArg305310315320SerGluThrAspProAlaSerLeuSerSerLeuLeuSerIleAlaIle325330335ArgIleAlaGlnArgMetGlyIleHisValGluSerMetTyrSerLys340345350CysSerValLeuGluAlaGluMetArgArgArgLeuTrpTrpSerLeu355360365IleIlePheAspAsnArgIleCysGluMetSerAspTyrLysThrAla370375380SerLeuThrProThrTrpAspCysLysValProLeuAsnValAsnAsp385390395400PheGluLeuGlnProGluMetLysIleProProValValAsnAsnArg405410415ProThrGluMetLeuPheAlaIleValArgSerGluLeuAlaAspPhe420425430ValArgHisSerAlaPheHisLeuAsnPheThrAsnSerTyrLeuAsn435440445ThrIleAlaProArgProProThrThrAspLeuThrAspGluAlaGlu450455460ArgLeuValSerLeuGluArgThrLeuGluGluLysTyrLeuAlaPhe465470475480CysAsnLeuGluAsnProLeuHisPheMetThrIleTrpThrMetArg485490495GlySerLeuAlaLysAsnArgLeuLeuGlnLeuTyrSerGlnSerSer500505510AsnThrProThrProProThrAspAlaGlnArgAsnAlaGlyIleAla515520525HisAlaLeuArgMetLeuGluCysAspThrLysLeuMetThrAlaPro530535540LeuAlaArgProTyrLeuTrpLeuLeuHisPheHisPheProPhePro545550555560AlaTyrIleHisLeuLeuGlnAspLeuLysLysArgProValGluAsp565570575HisAlaAspArgAlaTrpGluValMetSerAspAsnTyrGluValArg580585590IleMetAspValLysGlnAspAspArgProPheTyrValValPheSer595600605GlnIleValPheGlnAlaTrpGluAlaArgGluLysValAlaArgGln610615620LeuGlyThrProPheValLeuProArgMetValValAspIleArgLys625630635640LysLeuThrHisMetThrThrSerPheGlyGlnGluAlaAspAlaAla645650655GlnSerAspGlyAspAlaGlyValGluIleAsnAlaAspAspLeuAla660665670MetProMetSerIleAspPheAsnValLeuGlyMetAlaTyrGlyAla675680685GlyGlyGlnGlyProThrSerSerGlyProTrpGlyTyrProAspLeu690695700ProGlyProGlySerValAsnValGluAspThrAsnGlnPheLeuVal705710715720AsnThrMetGluTrpAsnArgLeuHisAlaHisGlyArg725730<210>2<211>2202<212>DNA<213>草酸青霉<400>2atgaccacgccgatctctacatccgatccgaccgccaccaccgtcaagccccgacgcgtg60ctggcatgcgtgttgtgtcagcaacgcaagagcaaatgtgaccgtaaatttccctgcgca120aactgtgtccgagccaacgtacagtgtgagcaagctgtccgccagcgacggcgcagattt180cccgagagagaattattggcccgtctacgactctatgagagtgtactccggcagcacaac240atcaagttcgatcctctgcacaccccaaccgcggaccatcgatctcccagtgacgatggc300cgtgatgatctaccagatggagccgagtcagagggcactctcggtgataccaatgcgctt360ccgtcgaaagagaagcccgcagtacagcccaaggcattaaacctctggcatgcaatgagc420caaaaggctgtcaattctggagacgatggcaatgccggtgaggacgacgagaatgacacc480ggcttccttcacgataacgatgatttgcggcatgctgtcatcaagaaggcatggaatcac540atgtttcaaggccaaggcaacgaccatcttctattcggtccgccggtaggcacaatcgat600ctatccgcgtcacatccaagccaagcacatatcttccggctctggcaaatttacctggac660aacgtgaatccgctgctcaaagtcacccacacccccactctgcagtcacgaatcatcgac720gctgtcagtgatatcgccaatatcagccccactctagaagccctcatgttcagcatctac780tgcgtttccctgatgagtctctcaggcgagcaatgcagggcaatgttcggggctgcgaga840aaagaactcttggccagctatcaatttgcgtgtcagcaggcgctacgaaggtgcggtgtt900ctacgctccagcgaccgcgagtgtctgactgccctatatctgtacctggtttccattcgc960tcggagacggatcctgcctctctgtcctcgctgctgagcatcgcgatccgaattgcccag1020cgcatgggaatccacgtcgagtcgatgtacagcaaatgttccgtgctagaggcagagatg1080cgccgtcggctatggtggtcgctcatcatcttcgacaatcgcatctgcgagatgtccgac1140tacaaaacggcatcgctgacgccaacctgggactgcaaggtgcctctcaacgtgaacgac1200ttcgagttgcagcccgagatgaaaatcccacccgtcgtcaacaaccgacccacagagatg1260ttgttcgcaatagtgcgtagcgagctcgccgatttcgtgcggcacagtgctttccatctc1320aatttcacaaactcatacctaaacacgatcgccccccgtcctcccaccaccgaccttact1380gacgaggccgagcgactggtctcgctagagagaactctggaggagaaatatctggccttc1440tgcaacttggaaaacccacttcacttcatgactatctggactatgcgaggctcgctggcc1500aagaatcggctcctgcaactttactctcagtcctcaaacacccccacaccaccaaccgac1560gcccagcgcaacgcgggaatcgcccatgcgctgcgcatgctcgaatgtgacacgaagctc1620atgaccgcgccgctcgcgcgaccctacctgtggctgttgcactttcacttcccattcccg1680gcttacattcacttgctgcaagatctgaagaagcggcccgtcgaggaccatgccgatcgt1740gcgtgggaggtcatgagtgacaactacgaagtgcgtatcatggatgtgaaacaggacgat1800cggccattctacgtcgttttctcgcagattgtttttcaggcgtgggaggcgcgcgagaag1860gtagcgcggcagctcgggacgccatttgtgctaccaagaatggtagtggatattcggaag1920aagttaacccacatgacaacgagttttgggcaggaggccgatgcggcgcagtcggatgga1980gatgcgggggtggagatcaatgccgatgatctcgccatgcccatgtccatcgatttcaat2040gtacttggaatggcgtacggcgctggcgggcaaggcccgactagctctggaccgtggggg2100tatcccgatctacctgggcctgggtctgtaaacgtggaggatacgaatcaatttctggtg2160aataccatggagtggaataggctgcatgctcacggcaggtga2202<210>3<211>5972<212>DNA<213>草酸青霉<400>3caatgatggcgagtggagtgtagtatccgatctttgagttcacgatcccaccaccaacgg60acccgacgaccattgagagcatcattgggaggaggcgaatacccgactcgacagcagtgt120tacctttgatggactggaaccagattggaaggaagtacactatccttgagttagtggact180gtacaagcacttggaggcagatggtcgggagagggcttgagtaccaaagatgtaattccc240tgagcctacgcagagggtctgccagaagccagagatgatgctgcgctgcgaaaagatgcg300cacgggcagtgtcgcagtcttgggaacgaggatctgaacggcgacgaacgcgatgagcag360cacgcccatgagaaccagacacgccaccacacggccgttgctccactgcagatcattagt420tgaggtttcaaaaatcactcagtccgattcgacgtacagtatatgtctgaccaccccact480gtaatgccagcacaaggcaaaccaccccggtgactaagaaagtggttcccaggaagtcca540gctggagcagcttctccacccacggaatcctcgtggtatcctgtttggggatcttgaggc600agaaggcaataaagatcatcgccgcacctccgatcggaagattgacgtagaagcaccatc660gccaagtcacattggatgtaaaagcaccgccgatcaagggacccacgatcgaggcaaggc720cgaataaggcgccgaataagccctgaatctgcggacgtttctctagagggacggaatgaa780tgatgcacatgatctggacatagcctgtcagcccgacttgtatcaatggggagcgccgct840gtcgggggtcaacttacagttccagccagaataccagccgcacccactccgcagattgct900cttccgacgataaaagccacagagttgggagcagctccgcagatagcagaggccacctca960aacagtagaatactggcaagaaacacagttcgcaccgagaac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