本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白及其基因工程突變菌株的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

鴨疫里默氏桿菌病是鴨、鵝、火雞和其他鳥類的一種高致病性、接觸性傳染病之一，其病原體為鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)，主要侵害1～8周齡(尤其2～3周齡)雛鴨、雛鵝及雛火雞等。鴨疫里默氏桿菌病多呈急性或慢性敗血癥病程，主要以神經(jīng)癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征，發(fā)病率90％以上，死亡率高達(dá)75％，耐過(guò)的病鴨常長(zhǎng)成殘次鴨或僵鴨，飼料轉(zhuǎn)化率降低，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，且由RA引起的輸卵管炎嚴(yán)重影響鴨成年后產(chǎn)蛋率。因此，鴨疫里默氏桿菌病的廣泛流行，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

基因敲除是在80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來(lái)的一門新技術(shù)。基因敲除是指對(duì)一個(gè)已知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因敲除，或用其它基因取代，然后對(duì)敲除后的個(gè)體進(jìn)行研究，通過(guò)其性狀的變化而研究被敲除基因的功能。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌突變株的構(gòu)建。

鐵是生命系統(tǒng)所必需的分子，在脊椎動(dòng)物體液中，鐵絕大部分與轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白結(jié)合在一起，致病菌要想在宿主體內(nèi)建立感染，很大程度上依賴于其利用宿主鐵復(fù)合物的能力，因此微生物的鐵載體運(yùn)輸系統(tǒng)，是致病菌戰(zhàn)勝宿主非特異性防御機(jī)制，并在宿主體內(nèi)繁殖的關(guān)鍵。鐵載體運(yùn)輸系統(tǒng)主要由鐵載體、鐵載體受體蛋白(Siderophore Receptor Protein，SRP)組成，其中，SRP在細(xì)菌鐵離子攝取機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，是細(xì)菌重要的毒力因子和潛在的疫苗靶分子。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于鴨疫里默氏桿菌鐵載體受體蛋白未見(jiàn)公開(kāi)，因此，開(kāi)發(fā)一種鴨疫里默氏桿菌SRP基因工程突變菌株將有助于為鴨疫里默氏桿菌的毒力研究和防控開(kāi)辟新的思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白SRP的氨基酸序列及編碼SRP蛋白的核苷酸序列，另一目的是提供一種缺失SRP基因的鴨疫里默氏桿菌血清1型基因工程突變菌株及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白SRP，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

編碼鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白SRP的核苷酸序列，優(yōu)選的，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白SRP基因工程突變菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)以鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白SRP的核苷酸序列為目的缺失基因，分別設(shè)計(jì)SRP左臂基因片段的上、下游引物、SRP右臂基因片段的上、下游引物以及抗性基因的上、下游引物，其中所述SRP左臂基因片段的上游引物與所述SRP右臂基因片段的上游引物均具有相同的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)；

(2)采用步驟(1)所述的SRP左臂基因片段的上、下游引物擴(kuò)增SRP左臂基因片段，SRP右臂基因片段的上、下游引物擴(kuò)增SRP右臂基因片段，抗性基因的上、下游引物擴(kuò)增抗性基因；

(3)采用步驟(1)所述的SRP左臂基因片段的上游引物、SRP右臂基因片段上游引物和抗性基因的上、下游引物組成的引物組，以SRP左臂基因片段、SRP右臂基因片段和抗性基因?yàn)槟０澹丿B延伸擴(kuò)增將SRP左臂基因片段、抗性基因、SRP右臂基因片段串聯(lián)，構(gòu)建出缺失SRP基因的片段，記為ΔSRP；

(4)將步驟(3)制備得到ΔSRP基因片段和自殺性質(zhì)粒pDS132分別用步驟(1)所述的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并將酶切后的自殺性質(zhì)粒pDS132用CIAP去磷酸化后，用T4DNA連接酶連接，得到pDS132：：ΔSRP自殺性質(zhì)粒；

(5)將步驟(4)制備的得到的pDS132：：ΔSRP自殺性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入鴨疫里默氏桿菌血清1型GDGZ菌株感受態(tài)細(xì)胞，氯霉素抗性平板篩選重組突變菌株即為鴨疫里默氏桿菌血清1型SRP基因工程突變菌株。

優(yōu)選的，步驟(3)所述的模板濃度比為SRP左臂基因片段∶SRP右臂基因片段∶抗性基因＝1∶1∶1。

優(yōu)選的，所述的抗性基因?yàn)榘逼S抗性基因。

優(yōu)選的，所述的限制性內(nèi)切酶為SalI。

優(yōu)選的，所述SRP左臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SRP右臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述ΔSRP基因片段核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

一種鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白SRP基因工程突變菌株，采用上述鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白SRP基因工程突變菌株的構(gòu)建方法構(gòu)建而成。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供了一種鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白SRP及其編碼基因，利用其SRP編碼基因構(gòu)建的缺失SRP基因的突變菌株在限鐵環(huán)境中生長(zhǎng)速度明顯晚于野生型鴨疫里默氏桿菌，并且該缺失SRP基因的突變菌株具有降低RA毒力的作用，因此，對(duì)SRP蛋白或基因的進(jìn)一步改造，有望獲得低毒株，在鴨疫里默氏桿菌的防控方面有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1：SRP左、右臂基因片段及氨芐抗性基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖【M：DNA Marker；1～3：SRP基因左臂片段；4～6：SRP基因右臂片段；7～9：氨芐抗性基因】；

圖2：ΔSRP基因的SOE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖【M：DNA Marker；1：ΔSRP基因】；

圖3：pDS132：：ΔSRP自殺性質(zhì)粒菌落PCR鑒定電泳圖【M：DNA Marker；1：pDS132：：ΔSRP質(zhì)粒】；

圖4：RA血清1型ΔSRP基因工程突變菌株的生長(zhǎng)曲線，其中，A：普通培養(yǎng)基野生型；B：普通培養(yǎng)基突變株；C：限鐵培養(yǎng)基野生型；D：限鐵培養(yǎng)基突變株。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步解釋，實(shí)施例中未詳細(xì)描述的培養(yǎng)基和分子生物學(xué)材料及操作方法為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

本發(fā)明涉及的RA血清1型鐵載體受體蛋白SRP的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，基因片段長(zhǎng)度2262bp。

選取SRP基因左右各1000bp左右的序列為構(gòu)建左右臂的基因序列，SRP左臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，SRP右臂基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，ΔSRP基因(如SEQ ID NO：5所示)由SRP左臂基因片段、SRP右臂基因片段、氨芐抗性基因組成。

實(shí)施例中未詳細(xì)描述的培養(yǎng)基和分子生物學(xué)材料及操作方法為該領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。

1、擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)SRP左臂基因片段、SRP右臂基因片段以及氨芐抗性基因設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，引物序列如下所示(下劃線顯示Sal I酶切位點(diǎn))：

左臂上游引物：5’-GCGGTCGACCGCTTTATTTTTGTTTGCAG-3’(SEO ID NO：6)；

左臂延伸引物：5’-CCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATTAGTTAAATCTACATTAGGG-3’(SEQ ID NO：7)；

右臂上游引物：5’-GCGGTCGAC GAAGCCCTAACTGATAGATTGG-3’(SEQ ID NO：8)：

右臂延伸引物：5’-TAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAAGCGGTTGGGGATAGGTTG-3’(SEQ ID NO：9)；

氨芐基因上游引物：5’-GTAGGAGAAGCCAGTTGTATATTAACCCTAATGTAGATTTAACTAATGAGTATTCAACATTTCCG-3’(SEQ ID NO：10)；

氨芐基因下游引物：5’-TCATTAAAATATTATTTTCCATAAAACCAACCTATCCCCAACCGCTTACCAATGCTTAATCAGTG-3’(SEQ ID NO：11)。

2、SRP左、右臂基因片段及氨芐抗性基因的擴(kuò)增

參照天根細(xì)菌基因組DNA試劑盒說(shuō)明書步驟提取的RA血清1型GDGZ菌株基因組DNA，作為擴(kuò)增模板。用SRP左臂基因片段的上、下游引物擴(kuò)增SRP左臂基因片段，SRP右臂基因片段的上、下游引物擴(kuò)增SRP右臂基因片段，氨芐基因的上、下游引物擴(kuò)增氨芐抗性基因。PCR擴(kuò)增體系為：PreMixTaq 10μL，GDGZ菌株基因組DNA 1μL，上下游引物各1μL，加滅菌水至50μL。PCR反應(yīng)程序：首先，94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min；4℃+∞。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)上述PCR擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)物，電泳結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增獲得1kb左右的目的條帶。

3、ΔSRP基因片段的擴(kuò)增

SRP左臂序列、SRP右臂和氨芐基因序列經(jīng)測(cè)序正確后，以SRP左臂上游引物、SRP右臂上游引物和氨芐基因的引物用重疊延伸PCR(SOE-PCR)將左臂基因、右臂基因和氨芐抗性基因序列按左臂-AMP-右臂串聯(lián)，構(gòu)建ΔSRP基因片段，即為缺失SRP基因的基因片段。SOE-PCR擴(kuò)增體系為：PreMixTaq 10μL，SRP左臂上游引物1μL，SRP右臂上游引物1μL，氨芐基因上、下游引物各1μL，左臂基因片段1μL，右臂基因片段1μL，氨芐基因片段1μL加滅菌水至50μL。PCR反應(yīng)程序：首先，94℃預(yù)變性5min；隨后，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min；4℃+∞。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，電泳結(jié)果如圖2所示，可見(jiàn)一條大片段3kb左右的目的條帶，另一條小片段1kb左右的條帶是非特異性擴(kuò)增。

4、pDS132：：ΔSRP自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建

將自殺性質(zhì)粒pDS132和ΔSRP基因片段分別用Sal I酶切，并將酶切的自殺性質(zhì)粒pDS132用CIAP去磷酸化后，pDS132 2μL，ΔSRP基因片段4μL，T4DNA連接酶1μL，T4連接酶緩沖液1μL，4℃連接16h，得到pDS132：：ΔSRP自殺性質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌SM10pir，然后進(jìn)行菌落PCR鑒定，1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，電泳結(jié)果如圖3所示，可見(jiàn)一條3kb左右的目的條帶。

5、RA血清1型ΔSRP基因工程菌株的構(gòu)建

將陽(yáng)性質(zhì)粒pDS132-ΔSRP化大腸桿菌β2155感受態(tài)細(xì)胞，得到供體菌大腸桿菌β2155(pDS132-ΔSRP。以轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pDS132-ΔSRP的大腸桿菌β2155為供體菌，RA血清1型為受體菌進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)移。供體菌和受體菌分別在適合的瓊脂平板上培養(yǎng)過(guò)夜，然后以TSB洗兩遍，調(diào)整菌濃度至OD₆₀₀為0.4，各取100μL菌液混合，將無(wú)菌硝酸纖維濾膜貼于含二氨基庚二酸(DAP)的TSA平板上，將混合菌液滴于濾膜上。37℃接合8h，接合結(jié)束后用無(wú)菌接種環(huán)將濾膜上的菌落刮下來(lái)，以TSB重懸，再用TSB洗兩遍，涂布于TSA平板(含氯霉素50μg/mL，不含DAP)，37℃培養(yǎng)24h。Cm抗性菌落分別影印到Cm抗性平板和10％蔗糖平板上。篩選帶有Cm抗性蔗糖敏感的接合子。將接合子接種于無(wú)NaCl的TSB中37℃培養(yǎng)過(guò)夜，適當(dāng)稀釋涂布含有10％蔗糖的TSA平板上，過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落分別影印到Cm抗性平板和10％蔗糖平板上。篩選Cm敏感蔗糖抗性的菌落，確定發(fā)生了交換。

6、RA血清1型ΔSRP基因工程突變菌株的生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將RA血清1型ΔSRP基因工程突變菌株在鐵豐富及限鐵環(huán)境下培養(yǎng)，以含5％血清的TSB培養(yǎng)基作為鐵豐富培養(yǎng)基；以加入2，2-吡啶作為螯合劑的TSB培養(yǎng)基作為限鐵培養(yǎng)基，以模擬體內(nèi)感染環(huán)境。

取RA血清1型ΔSRP基因工程突變菌株劃TSA瓊脂平板置于37℃培養(yǎng)，24h活化后挑取單菌落于5mL液體培養(yǎng)基中，200rpm/min，37℃過(guò)夜培養(yǎng)12h，得到的菌液作為菌種。取1ml菌種分別加入到100mL鐵豐富液體培養(yǎng)基和100mL限鐵液體培養(yǎng)基中混合均勻，200rpm/min37℃培養(yǎng)，每隔1h取一管之后測(cè)定每管的OD_600mm下的吸光值繪制時(shí)間與OD值之間的曲線。

結(jié)果如圖4所示，在鐵豐富環(huán)境中，ΔSRP基因工程突變菌株與野生型菌株生長(zhǎng)曲線無(wú)明顯差異，而在限鐵環(huán)境中，ΔSRP基因工程突變菌株生長(zhǎng)速度顯著慢于野生型菌株，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期起始時(shí)間較野生型晚約10個(gè)小時(shí)，這說(shuō)明SRP基因與鴨疫里默氏桿菌鐵離子攝取密切相關(guān)。

7、RA血清1型ΔSRP基因工程突變菌株的動(dòng)物攻毒試驗(yàn)

將7日齡雛鴨分為4組，將RA血清1型ΔSRP基因工程突變菌株和野生型菌株分別用1.5×10⁸CFU/mL、3×10⁷CFU/mL、6×10⁶CFU/mL、1.2×10⁶CFU/mL的攻毒劑量分別腿部肌肉注射，10只/組，每組分籠飼養(yǎng)，觀察7天，記錄每組雛鴨的死亡情況。

結(jié)果如表1所示，動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)表明6×10⁶CFU/mL和1.2×10⁶CFU/mL的攻毒劑量下，ΔSRP基因工程突變菌株的致死率低于野生菌株，觀察雛鴨開(kāi)始死亡時(shí)間發(fā)現(xiàn)，野生型菌株攻毒雛鴨24小時(shí)后開(kāi)始死亡，突變菌株是在攻毒48小時(shí)后開(kāi)始死亡。說(shuō)明突變菌株在體內(nèi)增值并達(dá)到致死數(shù)量的速度明顯要晚于野生型?？梢?jiàn)，構(gòu)建的RA血清1型ΔSRP基因工程突變菌株毒力有所下降，表明本發(fā)明的SRP蛋白與菌株的毒力相關(guān)。有望對(duì)SRP編碼基因進(jìn)一步改造，獲得更有效的減毒菌株，應(yīng)用于鴨疫里默氏桿菌的防控及相關(guān)毒力研究，具有廣闊的應(yīng)用前景。

表1 ΔSRP基因工程突變菌株動(dòng)物攻毒試驗(yàn)

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所

廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司

<120> 鴨疫里默氏桿菌血清1型鐵載體受體蛋白SRP及其基因工程突變菌株的構(gòu)建方

法

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 753

<212> PRT

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 1

Met Lys Lys Asn His Phe Tyr Gln Arg Asn Gly Tyr Tyr Leu Ser Thr

1 5 10 15

Met Leu Leu Lys Ala Cys Asn Ile Ala Leu Leu Thr Ala Pro Leu Phe

20 25 30

Ser Asn Ala Gln His Lys Glu Arg Ile Lys Asp Ile Gln Glu Val Glu

35 40 45

Leu Val Lys Arg Lys Leu Glu Ala Phe Glu Ser Arg Lys Leu Arg Glu

50 55 60

Val Glu Gly Thr Ser Ile Phe Ala Ala Lys Lys Thr Glu Val Val Leu

65 70 75 80

Met Asp Leu Lys Leu Ala Asn Lys Ala Leu Asn Asn Pro Arg Gln Val

85 90 95

Phe Ser Gln Val Ser Gly Val Asn Val Phe Asp Ser Asn Asp Gly Gly

100 105 110

Leu Gln Leu Asn Ile Gly Gly Arg Gly Leu Asn Pro Asn Arg Ser Ala

115 120 125

Asn Phe Asn Thr Arg Gln Asn Gly Tyr Asp Ile Ser Ala Asp Val Leu

130 135 140

Gly Tyr Pro Glu Ser Tyr Tyr Thr Pro Pro Ala Glu Ala Leu Glu Glu

145 150 155 160

Ile Gln Val Val Arg Gly Ala Ala Ser Leu Gln Tyr Gly Thr Gln Phe

165 170 175

Gly Gly Leu Leu Asn Phe Lys Leu Lys Thr Pro Thr Lys Thr Gln Pro

180 185 190

Leu Glu Leu Ile Ser Arg Asn Thr Tyr Ala Ser Phe Asn Thr Tyr Thr

195 200 205

Ser Phe Ser Ala Leu Ser Gly Thr Val Gly Lys Trp Ser Tyr Tyr Thr

210 215 220

Phe Phe Asn Tyr Lys Gln Gly Asp Gly Phe Gln Glu Asn Ser Glu Tyr

225 230 235 240

Asn Ala Arg Asn Phe Tyr Val His Leu Asn Tyr Glu Ile Thr Pro Gln

245 250 255

Thr Ser Ile Ser Thr Glu Phe Thr Arg Phe Asn Tyr Leu Ala His Gln

260 265 270

Pro Gly Gly Leu Thr Asp Phe Gln Phe Tyr Gln Asn Pro Tyr Gln Ser

275 280 285

Asn Arg Ala Arg Asn Trp Phe Lys Val Asp Trp Asn Leu Trp Asn Val

290 295 300

Ser Leu Lys His Gln Phe Thr Pro Arg Ala Lys Leu Ser Leu Ser Gly

305 310 315 320

Phe Gly Leu Gly Ala Ser Arg Tyr Ser Leu Lys Val Ser Ser Ile His

325 330 335

Val Ala Asp Val Asp Tyr Glu Gly Ala Thr Arg Asp Leu Ile Thr Gly

340 345 350

Asp Phe Lys Asn Trp Gly Val Glu Ala Arg Phe Leu Gln Gln Tyr Gly

355 360 365

Asn Lys Asn His Thr Phe Leu Val Gly Gly Lys Tyr Tyr Lys Ala Gln

370 375 380

Asn Ser Gly Lys Gln Gly Pro Gly Ser Ala Phe Ser Gly Ala Asp Phe

385 390 395 400

Asn Phe Asp Gln Thr Asn Lys Asn Tyr Phe Phe Gln Ser Asn Tyr Ser

405 410 415

Tyr Pro Asn Arg Asn Ile Ala Val Phe Ser Glu Asn Ile Phe Lys Leu

420 425 430

Gly Ala Pro Trp Ser Val Val Pro Gly Val Arg Trp Glu Phe Ile Asp

435 440 445

Thr Gly Ala Asp Gly Ala Tyr Gln Arg Val Ile Glu Asp Asn Ala Gly

450 455 460

Asn Val Ile Tyr Asn Lys Arg Phe Glu Glu Gln Glu Lys Arg Gln Arg

465 470 475 480

Asn Phe Ala Leu Phe Gly Leu Gly Val Ser Tyr Lys Pro Thr Lys Ala

485 490 495

Phe Glu Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Gln Asn Tyr Arg Ser Val Thr Phe

500 505 510

Ser Asp Ile Arg Val Glu Asn Asn Ser Gln Val Ile Asp Pro Asn Ile

515 520 525

Lys Asp Glu Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Leu Gly Ile Arg Gly Asn Trp

530 535 540

Lys Asn Thr Leu Ser Tyr Asp Ile Asn Met Phe Gly Leu Trp Tyr Asn

545 550 555 560

Asn Arg Ile Asp Asn Val Phe Arg Lys Arg Glu Gly Leu Phe Ser Asp

565 570 575

Val Ala Lys Val Arg Thr Asn Val Gly Ala Ala Phe Ile Ala Gly Leu

580 585 590

Glu Ser Leu Val Asp Val Asn Ile Asn Lys Leu Leu Leu Gly Asn Leu

595 600 605

Gln His Trp Lys Trp Asn Leu Phe Phe Asn Thr Ala Leu Thr His Ser

610 615 620

Gln Tyr Val Lys Ser Glu Ile Pro Gly Ile Lys Gly Asn Arg Val Glu

625 630 635 640

Tyr Val Pro Lys Val Asn Leu Lys Ser Gly Leu Asn Phe Gly Tyr Arg

645 650 655

Asn Phe Leu Gly Ser Leu Leu Phe Thr Tyr Met Ser Glu Gln Phe Thr

660 665 670

Thr Ala Thr Asn Glu Pro Thr Asp Lys Thr Asp His Leu Trp Gly Ile

675 680 685

Arg Gly Ser Ile Pro Ala Tyr Lys Leu Leu Asp Ala Ser Phe Ser Tyr

690 695 700

Arg Ile Thr Pro Asn Ile Arg Leu Glu Thr Gly Val Asn Asn Val Leu

705 710 715 720

Asn Glu Val Tyr Phe Thr Arg Arg Ala Thr Gly Tyr Pro Gly Pro Gly

725 730 735

Ile Ile Pro Ser Ala Pro Arg Gln Tyr Tyr Phe Thr Leu Glu Met Lys

740 745 750

Leu

<210> 2

<211> 2262

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 2

atgaagaaga atcattttta ccaaagaaat ggctattacc tttcaacgat gttattaaag 60

gcttgtaaca ttgcattgct taccgcacca ttattttcga atgctcaaca caaagaaaga 120

atcaaggata tacaggaggt agaactggtt aaaagaaagt tggaagcctt tgaatccaga 180

aaattgaggg aagtggaagg caccagcatc tttgccgcta aaaaaacgga agtggtgcta 240

atggatttaa agttggctaa taaagccctt aataatccca gacaggtctt ttcccaagta 300

tcgggcgtta atgtttttga tagtaacgac ggggggcttc agctcaacat aggagggcga 360

gggcttaacc ctaaccgttc agctaacttt aacaccagac agaatgggta cgatattagt 420

gccgatgtat tgggttatcc agagagctat tatacaccac ccgcagaggc attggaggag 480

attcaggtgg tgagaggagc ggcttcgttg caatacggaa cacagttcgg agggttgctt 540

aattttaaac taaaaacgcc aactaaaaca caaccgttgg agcttatcag caggaatact 600

tatgcaagtt ttaatactta cacgagtttc agtgctttga gcggaacggt gggcaagtgg 660

tcttattata ctttttttaa ttataagcaa ggggacggat ttcaagaaaa ttcggaatat 720

aatgccagaa acttttatgt tcatttaaac tatgagataa cgcctcaaac aagtatcagt 780

acggagttta cccgttttaa ttatttggca catcaacctg gggggcttac cgattttcag 840

ttctaccaaa atccttatca aagcaaccga gcaagaaatt ggtttaaagt ggactggaac 900

ctttggaatg tgtcattaaa gcatcagttt acccctcgtg ccaaattaag tttaagtggg 960

tttggcttgg gagcgtcccg ttattcttta aaagtctcgt ctatccatgt cgcagatgtg 1020

gattatgaag gggctacacg ggatttgatt acaggagatt ttaagaattg gggagtagaa 1080

gcaaggttcc tgcaacaata tgggaataaa aaccatactt ttttggtagg aggtaaatat 1140

tataaagctc aaaactcggg gaagcaagga ccgggaagtg ctttttctgg ggcagatttt 1200

aactttgacc agactaataa aaactatttc tttcagtcga attatagcta tcctaaccga 1260

aatatagcgg tgttttcaga gaatatattt aagttgggag ctccttggtc ggtagttcct 1320

ggtgtgcgtt gggagtttat agatactggt gcagatgggg cgtaccaaag ggtgatagaa 1380

gataatgcag gaaatgtaat ctataacaaa cgctttgaag aacaagagaa acgccaaagg 1440

aatttcgcac tatttgggtt gggtgtttct tataagccta ccaaagcgtt tgaattttac 1500

actaacttgt cccaaaatta ccgctctgta acctttagtg atattagagt agaaaataat 1560

tcccaagtga tagaccccaa cattaaggac gaaacaggct atacgggaga tttggggata 1620

agagggaatt ggaaaaatac actgtcttac gacatcaata tgtttggatt gtggtataat 1680

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aacaaacttc ttttagggaa tttgcaacat tggaaatgga atttgttttt taatacagca 1860

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gctcctcgcc aatattattt cactttggaa atgaagctgt ag 2262

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<211> 1094

<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

<400> 3

cgctttattt ttgtttgcag ggctaatggc ttttttagta atggtggggc ggtattaccg 60

aatggcaatc gttggttttt tcctttcgtt tacttacatc gaacttatgg ataagactaa 120

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gtgtaagctc aattccgatt ggctattgga agcaatgccg ctcaagttat ggttggcttc 360

aaagtttcat cttccgctga taggtggttt gatggataaa actataaccg cctatttgtt 420

cagttgggca ggagcattgt acgatttgag tatccctttt ttactattat atcgtaaaac 480

cagaggctgg gcatttggga gtgtggtggt ttttcatacg ctcacttggt ggttgtttcc 540

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gcatcagaag ttttggtaca ggctgtactc ttgtttcaaa tgggatttta aggcttactt 660

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<212> DNA

<213> Riemerella anatipestifer

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<213> Riemerella anatipestifer

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