本發(fā)明屬于生物分離
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及采用連續(xù)離子交換色譜技術(shù)分離核苷酸的工藝。
背景技術(shù)：
：5’-核苷酸是參與組成生物大分子核酸的基本單位，在農(nóng)業(yè)、食品行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)上有著廣泛的用途。尤其是在嬰兒食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用中，有著不可替代的功能。在嬰兒食品中，作為嬰兒食品的添加劑可以明顯提高嬰兒的免疫能力，促進腸道的成熟，促進脂蛋白和多不飽和脂肪酸的合成，減少嬰兒感冒和腹瀉等疾病的發(fā)生，有利于嬰兒的正常生長和發(fā)育。作為醫(yī)藥中間體，核苷酸可以合成許多抗病毒、抗腫瘤藥物，其相應(yīng)的衍生物在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等方面疾病有很重要的作用。目前，國內(nèi)外生產(chǎn)核苷酸的方法主要有以下三種：化學合成法、微生物發(fā)酵法及RNA酶解法。首先，化學法生產(chǎn)核苷酸，主要是利用核苷進行磷酸酯化反應(yīng)，而化學法所涉及的試劑具有一定毒性，生產(chǎn)成本偏高；其次是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸，主要是利用微生物菌株的生物合成途徑來生產(chǎn)核苷酸。但由于核苷酸是一種糖基磷酸酯，即核苷的磷酸酯，難于透過細胞膜，因此增加了菌體發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸的難度。再次，利用酶法生產(chǎn)核苷酸，核酸酶P1降解RNA可以一次得到四種核苷酸的混合物，且酶反應(yīng)收率較高，該方法較適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)核苷酸。需要注意的是，在酶解完成之后，需要通過色譜分離技術(shù)分離酶解液混合物中的四種核苷酸。色譜分離技術(shù)根據(jù)操作過程的特性分為：批處理色譜和連續(xù)色譜。批處理色譜即柱式固定床色譜，它是一種間歇制備色譜。固定床制備色譜的缺點是床層和吸附劑的利用率低，溶劑消耗大，產(chǎn)品的濃度低，增加了回收投入；并且操作不連續(xù)，原料的處理量較小。而連續(xù)色譜的優(yōu)點是連續(xù)進樣，使填料得到充分利用，降低溶劑消耗量，產(chǎn)量也有所提高。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種采用連續(xù)離子交換色譜技術(shù)分離酶解液中四種5’-核苷酸的方法，以解決核苷酸分離難度大、收率低等難題。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種采用連續(xù)離子交換色譜技術(shù)分離核苷酸的工藝，RNA酶解液經(jīng)脫色預(yù)處理后，采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸UMP、GMP、CMP和AMP。其中，所述的RNA酶解液為RNA經(jīng)過核酸酶P1酶解得到的溶液。其中，所述的酶解液脫色預(yù)處理采用脫色樹脂柱進行脫色處理。其中，所述的脫色樹脂為吸附型樹脂SX-1。其中，采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸為利用7～25根裝有凝膠型強酸性陽離子交換樹脂柱的連續(xù)分離裝置分離四種5’-核苷酸。其中，所述的凝膠型強酸性陽離子交換樹脂以聚苯乙烯二乙烯基苯為骨架，磺酸基-SO3-為功能基團，其型號優(yōu)選為NH-1，平均粒徑為394.1～416.5μm，濕密度為1.02～1.06g/L，含水量為30～60％。第一種處理工藝：當連續(xù)分離裝置中樹脂柱數(shù)量為7根時，采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸的方法包括循環(huán)操作的兩個步驟：步驟1：7根樹脂柱分為吸附區(qū)、解吸區(qū)和再生區(qū)三個區(qū)，其中，吸附區(qū)為1根樹脂柱，解吸區(qū)為2根樹脂柱，再生區(qū)為4根樹脂柱；吸附區(qū)：按0.02～0.05g5’-核苷酸/g濕樹脂的上樣量吸附預(yù)處理后的酶解液，大部分UMP未被樹脂柱吸附而流出，吸附完成后，用水洗脫樹脂柱，水洗脫初期剩余UMP被快速洗出，隨后部分GMP也被洗出同時與UMP完全分離，水洗脫過程持續(xù)到CMP即將流出為止；解析區(qū)：兩根樹脂柱獨立設(shè)置，分別用稀堿洗脫兩根樹脂柱，分別得到AMP和CMP；再生區(qū)：四根樹脂柱獨立設(shè)置，分別通入堿、水、酸、水進行再生；步驟2：7根樹脂柱分為解吸區(qū)和再生區(qū)兩個區(qū)，其中，解吸區(qū)為2根樹脂柱，再生區(qū)為5根樹脂柱；步驟1中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中吸附區(qū)的樹脂柱之后與其串聯(lián)，形成步驟2中的解吸區(qū)；步驟1中解吸區(qū)的兩根樹脂柱同時切換到步驟1中的再生區(qū)，串聯(lián)后作為步驟2中再生區(qū)的第一根和第二根樹脂柱；解吸區(qū)：兩根樹脂柱串聯(lián)，通入水洗脫，步驟1中未洗脫完全的剩余GMP完全洗出，通入水洗脫至兩根樹脂柱中的第一根樹脂柱內(nèi)完全為AMP，第二根樹脂柱中完全是CMP；再生區(qū)：串聯(lián)的兩個樹脂柱通入堿，其余樹脂柱依舊獨立，分別通入水、酸、水進行再生；將步驟2中解吸區(qū)中的兩根串聯(lián)的樹脂柱分開，切換至步驟1中解析區(qū)；步驟2中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中的吸附區(qū)，同時將再生區(qū)串聯(lián)的樹脂柱分開；循環(huán)進行步驟1和步驟2；保證所有樹脂柱同步切換，同時再生區(qū)按照堿-水-酸-水的方向進行切換，樹脂柱切換時間優(yōu)選為120min～300min。其中，解吸區(qū)中所述的稀堿為濃度為0.05～0.50mol/L的氫氧化鈉水溶液。其中，再生區(qū)中所述的酸為濃度為0.80～1.50mol/L的鹽酸水溶液；所述的堿為濃度為0.80～1.50mol/L的氫氧化鈉水溶液。其中，吸附區(qū)，吸附流速為0.2～2.5BV/h；解吸區(qū)，解吸流速為1.5～5.5BV/h；再生區(qū)，再生流速為0.3～3.5BV/h。第二種處理工藝：當連續(xù)分離裝置中樹脂柱數(shù)量為8～25根時，采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸的方法包括循環(huán)操作的兩個步驟：步驟1：樹脂柱分為吸附區(qū)、解吸區(qū)和再生區(qū)三個區(qū)，其中，吸附區(qū)為1根樹脂柱，解吸區(qū)為3根以上的樹脂柱，再生區(qū)為4根以上的樹脂柱；吸附區(qū)：按0.02～0.05g5’-核苷酸/g濕樹脂的上樣量吸附預(yù)處理后的酶解液，大部分UMP未被樹脂柱吸附而流出，吸附完成后，用水洗脫樹脂柱，水洗脫初期剩余UMP被快速洗出，隨后部分GMP也被洗出同時與UMP完全分離，水洗脫過程持續(xù)到CMP即將流出為止；解析區(qū)：3根以上的樹脂柱串聯(lián)，用稀堿洗脫，在倒數(shù)第二根樹脂柱出口處安裝三通閥，使得倒數(shù)第二根樹脂柱流出液中一半流出收集AMP，另外一半流入最后一根樹脂柱，最后一根樹脂柱出口收集CMP；再生區(qū)：4根樹脂柱獨立設(shè)置，分別通入堿、水、酸、水進行再生；超過4根的樹脂柱則并入堿、水、酸再生的任一環(huán)節(jié)與該環(huán)節(jié)中的其他樹脂柱串聯(lián)；步驟2：樹脂柱分為解吸區(qū)和再生區(qū)兩個區(qū)，其中，再生區(qū)中樹脂柱數(shù)量不變；其余樹脂柱為解吸區(qū)；步驟1中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中吸附區(qū)的樹脂柱之后與其串聯(lián)，形成步驟2中的解吸區(qū)的第一部分；步驟1中解吸區(qū)的第一根樹脂柱同時切換到步驟1中的再生區(qū)，作為步驟2中再生區(qū)的第一根樹脂柱；步驟1中解析區(qū)的第二根及與其串聯(lián)的之后的樹脂柱依舊保持串聯(lián)，作為步驟2中解吸區(qū)的第二部分；步驟2中解析區(qū)的第一部分和第二部分獨立處理；解吸區(qū)：第一部分，通入水洗脫，將步驟1中未洗脫完全的剩余GMP完全洗出，通入水洗脫至兩根樹脂柱中的第一根樹脂柱內(nèi)完全為AMP，第二根樹脂柱中完全是CMP；第二部分，通入稀堿洗脫至最后一根樹脂柱中無AMP流出，并且在最后一根樹脂柱出口收集AMP；再生區(qū)：4根樹脂柱獨立設(shè)置，分別通入堿、水、酸、水進行再生；超過4根的樹脂柱則并入堿、水、酸再生的任一環(huán)節(jié)與該環(huán)節(jié)中的其他樹脂柱串聯(lián)；將步驟2中解吸區(qū)第二部分第一根樹脂柱切換至步驟2中的再生區(qū)作為步驟1中再生區(qū)的第一根樹脂柱；步驟2中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中的吸附區(qū)；步驟2中解吸區(qū)第二部分的第二根樹脂柱與解吸區(qū)第一部分的樹脂柱串聯(lián)，作為步驟1中的解吸區(qū)；循環(huán)進行步驟1和步驟2；保證所有樹脂柱同步切換，同時再生區(qū)按照堿-水-酸-水的方向進行切換，樹脂柱切換時間優(yōu)選為120min～300min。其中，解吸區(qū)中所述的稀堿為濃度為0.05～0.50mol/L的氫氧化鈉水溶液。其中，再生區(qū)中所述的酸為濃度為0.80～1.50mol/L的鹽酸水溶液；所述的堿為濃度為0.80～1.50mol/L的氫氧化鈉水溶液。其中，吸附區(qū)，吸附流速為0.2～2.5BV/h；解吸區(qū)，解吸流速為1.5～5.5BV/h；再生區(qū)，再生流速為0.3～3.5BV/h。通過上述兩種工藝，得到的四種核苷酸產(chǎn)品中除UMP外其他三種核苷酸的純度可達98％，UMP純度為92％～95％，另外，產(chǎn)品中四種核苷酸的平均收率可達到97％。有益效果：本發(fā)明開發(fā)了一種新型的連續(xù)離子交換色譜技術(shù)分離四種核苷酸，具有如下優(yōu)點：1)該分離工藝所用的吸附劑只有一種凝膠型強酸性陽離子交換樹脂，再生較容易；而邱蔚然等人在2001年發(fā)表的專利《從核糖核酸酶解液中分離核苷酸的方法》中提出采用兩根陽離子交換樹脂柱、一根大孔弱堿性陰離子交換樹脂柱和一根弱堿性陰離子交換樹脂柱分離核苷酸，不僅操作繁瑣，而且再生困難，我們的工藝與之相比較，優(yōu)勢明顯。2)該分離工藝使用了較少的樹脂柱(7～25根)分離四種組分；而應(yīng)漢杰、呂浩等人在2006年發(fā)表專利《一種利用模擬移動床分離制備5”-核苷酸的方法》，該篇專利中使用樹脂柱數(shù)目較多(6～60根)，我們的工藝與之相比，樹脂柱數(shù)目較少，分離效率較高。3)該分離工藝采用稀堿作為洗脫CMP和AMP的解吸劑，洗脫速率比用水作洗脫劑時速度有所提高，而應(yīng)漢杰、呂浩等人2006年的專利《一種利用模擬移動床分離制備5”-核苷酸的方法》中使用水作為洗脫劑，我們的工藝與之相比，洗脫速率比用水作為洗脫劑的洗脫速率快，從而降低核苷酸在樹脂中的停留時間，減少核苷酸的降解，因此核苷酸的收率也比2006年專利中核苷酸產(chǎn)品的收率更高。4)本發(fā)明采用一種新型的三區(qū)式、兩步驟的連續(xù)離子交換技術(shù)完成四種核苷酸的連續(xù)分離，突破了傳統(tǒng)的四區(qū)式模擬移動床的方法，這種新型的兩步驟的操作方式在核苷酸以及其他物質(zhì)分離工藝上很少有使用，應(yīng)漢杰、呂浩等人2006年的專利《一種利用模擬移動床分離制備5”-核苷酸的方法》中采用四區(qū)式的分離方式，缺乏創(chuàng)新性，我們的工藝與之相比大大提高了分離效率。5)本發(fā)明較四區(qū)式工藝分離四種核苷酸，可實現(xiàn)樹脂用量節(jié)約40％～60％，解吸劑、再生劑的用量節(jié)約20％～45％，操作費用節(jié)約35％～65％，投資費用節(jié)約45％～60％，所有操作均可在室溫下進行，大大降低了分離過程的能耗。6)本發(fā)明的連續(xù)分離工藝簡單易行，設(shè)備投資、運行成本低廉，并可進行工藝放大，實現(xiàn)從公斤級到噸級的分離，效果好。廢水排放量低，避免環(huán)境污染問題，是一種簡單高效的生產(chǎn)工藝，不僅可用于核苷酸的分離，還可應(yīng)用于其他糖類、同分異構(gòu)體等化學物質(zhì)的分離提純。附圖說明圖1實施例2連續(xù)分離工藝的步驟1的示意圖；圖2實施例2連續(xù)分離工藝的步驟2的示意圖；圖3實施例3連續(xù)分離工藝的步驟1的示意圖；圖4實施例3中步驟1中的吸附區(qū)出口UMP、GMP的流出曲線；圖5實施例3中步驟1中的解吸區(qū)出口CMP的流出曲線；圖6實施例3中步驟1中的解吸區(qū)出口AMP的流出曲線；圖7實施例3連續(xù)分離工藝的步驟2的示意圖；圖8實施例3中步驟2中的解吸區(qū)出口GMP的流出曲線；圖9實施例2中步驟2中的解吸區(qū)出口AMP的流出曲線；圖10實施例4連續(xù)分離工藝的步驟1的示意圖；圖11實施例4連續(xù)分離工藝的步驟2的示意圖。具體實施方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。以下實施例中使用外標法對料液中的5’-尿嘧啶核苷酸、5’-胞嘧啶核苷酸、5’-鳥嘌呤核苷酸、5’-腺嘌呤核苷酸濃度進行檢測，色譜條件為：1)檢測器：Agilent1200型高效液相色譜儀-紫外檢測器；2)色譜柱：安捷倫液相色譜柱(C18，5μm，250×4.6mm)；3)流動相：20mmol/L磷酸二氫銨，3.5％甲醇；4)流速：1mL/min；5)柱溫：25℃；檢測方法及步驟：1)色譜柱的平衡：配制好的流動相20mmol/L磷酸二氫銨用孔徑0.22μm的混合微孔濾膜過濾，再進行超聲處理30min。用處理好的流動相以梯度洗脫的方法流速沖洗色譜柱，同時開啟柱溫箱，開始采集基線，待基線趨于直線時，平衡結(jié)束。梯度洗脫方法見表1。表1時間％B％C流速0.00100.00.01.0002.00100.00.01.0008.0089.011.01.0009.0089.011.01.00010.00100.00.01.00015.00100.00.01.0002)樣品的檢測：按照色譜條件編寫進樣序列及方法，將過膜處理后的標準品及樣品按照進樣序列置于自動進樣器的相應(yīng)位置上，開始進樣并收集圖譜信息。使用以下公式計算解吸后的核苷酸的收率：收率(％)＝m解吸/m進×100％其中m解吸、m進分別表示為核苷酸在吸附段進樣與解吸段流出的質(zhì)量之比。以下實施例采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸為利用7～25根裝有凝膠型強酸性陽離子交換樹脂柱的連續(xù)分離裝置分離四種5’-核苷酸。其中，所述的凝膠型強酸性陽離子交換樹脂以聚苯乙烯二乙烯基苯為骨架，磺酸基-SO3-為功能基團，其型號優(yōu)選為NH-1，平均粒徑為394.1～416.5μm，濕密度為1.02～1.06g/L，含水量為30～60％。實施例1：酶解液的獲得。稱取質(zhì)量30～70gRNA粉末，用超純水溶解，然后升溫至70℃，在其中加入占RNA粉末5～8wt％的核酸酶P1進行酶解反應(yīng)，酶解進行4h后，在溶液中加入0.2wt％的活性炭，繼續(xù)酶解1h，然后再在溶液中加入占RNA粉末的10wt％的殼聚糖絮凝劑，酶解液制作完成。將酶解得到的酶解液經(jīng)過10min的離心之后，再經(jīng)過脫色樹脂柱SX-1脫色，脫色10h后得到我們所需要的酶解液。實施例2：連續(xù)離子交換色譜技術(shù)分離酶解液中四種核苷酸。連續(xù)分離裝置中樹脂柱數(shù)量為7根，采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸的方法包括循環(huán)操作的兩個步驟：步驟1(圖1)：7根樹脂柱分為吸附區(qū)、解吸區(qū)和再生區(qū)三個區(qū)，其中，吸附區(qū)為1根樹脂柱，解吸區(qū)為2根樹脂柱，再生區(qū)為4根樹脂柱；每根樹脂柱裝填100g樹脂(NH-1)，樹脂柱直徑3.0cm，高度23cm。吸附區(qū)：按0.036g5’-核苷酸/g濕樹脂的上樣量吸附預(yù)處理后的酶解液，酶解液濃度：尿嘧啶核苷酸4g/L，胞嘧啶核苷酸6g/L，鳥嘌呤核苷酸10g/L，腺嘌呤核苷酸11g/L，上樣時間為2h，上樣流速為0.42BV/h；此時大部分UMP不與樹脂發(fā)生離子交換流出，其余幾種核苷酸與樹脂發(fā)生離子交換并吸附至樹脂中，吸附完成后，用水洗脫樹脂柱，洗脫流速為1.56BV/h，水洗脫初期樹脂間隙中剩余UMP被快速洗出，隨后部分GMP也被洗出同時與UMP完全分離，洗脫出來的GMP的量大約為440mL，水洗脫過程持續(xù)到CMP即將流出為止；解吸區(qū)：兩根樹脂柱獨立設(shè)置，分別用0.2mol/L氫氧化鈉水溶液洗脫兩根樹脂柱，分別得到AMP和CMP，流速為2.39BV/h。再生區(qū)：四根樹脂柱獨立設(shè)置，分別通入堿、水、酸、水進行再生；即：使用1.2mol/L氫氧化鈉對再生區(qū)中第一根樹脂柱進行雜質(zhì)的去除，流量1.3BV/h，使用純水以1.5BV/h流量將再生區(qū)中第二根樹脂柱中氫氧化鈉沖洗干凈至流出液pH為9.5，使用1.2mol/L的鹽酸將再生區(qū)中第三根樹脂轉(zhuǎn)化為氫離子型，流量1.3BV/h，使用純水以1.5BV/h流量將再生區(qū)中第四根樹脂柱中樹脂間隙里的鹽酸沖洗干凈至流出液pH為4，再生完全。步驟2(圖2)：7根樹脂柱分為解吸區(qū)和再生區(qū)兩個區(qū)，其中，解吸區(qū)為2根樹脂柱，再生區(qū)為5根樹脂柱；步驟1中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中吸附區(qū)的樹脂柱之后與其串聯(lián)，形成步驟2中的解吸區(qū)；步驟1中解吸區(qū)的兩根樹脂柱同時切換到步驟1中的再生區(qū)，串聯(lián)后作為步驟2中再生區(qū)的第一根和第二根樹脂柱；解吸區(qū)：兩根樹脂柱串聯(lián)，通入水洗脫，洗脫流速為1.52BV/h。步驟1中未洗脫完全的剩余GMP完全洗出，通入水洗脫至兩根樹脂柱中的第一根樹脂柱內(nèi)完全為AMP，第二根樹脂柱中完全是CMP；再生區(qū)：串聯(lián)的兩個樹脂柱通入堿，其余樹脂柱依舊獨立，分別通入水、酸、水進行再生；其中，使用1.2mol/L氫氧化鈉對再生區(qū)中第一根樹脂柱進行雜質(zhì)的去除，流量0.65BV/h，使用純水以1.5BV/h流量將再生區(qū)中第二根樹脂柱中氫氧化鈉沖洗干凈至流出液pH為9.5，使用1.2mol/L的鹽酸將再生區(qū)中第三根樹脂轉(zhuǎn)化為氫離子型，流量1.3BV/h，使用純水以1.5BV/h流量將再生區(qū)中第四根樹脂柱中樹脂間隙里的鹽酸沖洗干凈至流出液pH為4，再生完全。將步驟2中解吸區(qū)中的兩根串聯(lián)的樹脂柱分開，切換至步驟1中解吸區(qū)；步驟2中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中的吸附區(qū)，同時將再生區(qū)串聯(lián)的樹脂柱分開；循環(huán)進行步驟1和步驟2；所有樹脂柱同步切換，同時再生區(qū)按照堿-水-酸-水的方向進行切換，樹脂柱切換時間為240min。通過該連續(xù)離子交換色譜工藝實現(xiàn)了四種5’-核苷酸的連續(xù)分離，四種核苷酸也實現(xiàn)完全分離，并且經(jīng)過六次切換之后得到四種核苷酸產(chǎn)物，分別是：尿苷酸(UMP)、鳥苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)和腺苷酸(AMP)，經(jīng)檢測純度分別為91.64％、98.25％、98.12％、98.36％，收率分別為98.75％、98.35％、98.34％、97.56％。另外四種核苷酸產(chǎn)物的濃度分別為2.51g/L、0.65g/L、0.40g/L、0.36g/L。實施例3：連續(xù)離子交換色譜技術(shù)分離酶解液中四種核苷酸。連續(xù)分離裝置中樹脂柱數(shù)量為9根，采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸的方法包括循環(huán)操作的兩個步驟：步驟1(圖3)：樹脂柱分為吸附區(qū)、解吸區(qū)和再生區(qū)三個區(qū)，其中，吸附區(qū)為1根樹脂柱，解吸區(qū)為3根樹脂柱，再生區(qū)為5根樹脂柱；吸附區(qū)：按0.025g5’-核苷酸/g濕樹脂的上樣量吸附預(yù)處理后的酶解液，酶解液濃度：尿嘧啶核苷酸4g/L，胞嘧啶核苷酸6g/L，鳥嘌呤核苷酸10g/L，腺嘌呤核苷酸11g/L，上樣時間為2h，上樣流速為0.26BV/h；此時大部分UMP不與樹脂發(fā)生離子交換流出，其余幾種核苷酸與樹脂發(fā)生離子交換并吸附至樹脂中，吸附完成后，用水洗脫樹脂柱，洗脫流速為1.52BV/h，水洗脫初期樹脂間隙中剩余UMP被快速洗出，隨后部分GMP也被洗出同時與UMP完全分離，洗脫出來的GMP的量大約為200mL，水洗脫過程持續(xù)到CMP即將流出為止；如圖4核苷酸隨時間變化的濃度曲線可知，UMP與GMP實現(xiàn)完全分離。解吸區(qū)：3根樹脂柱串聯(lián)，用0.05mol/L氫氧化鈉溶液洗脫，洗脫流速為2.39BV/h在倒數(shù)第二根樹脂柱出口處安裝三通閥，使得倒數(shù)第二根樹脂柱流出液中一半流出收集AMP，另外一半流入最后一根樹脂柱，最后一根樹脂柱出口收集CMP；如圖5和圖6所示，AMP隨時間變化的濃度曲線呈現(xiàn)上升的趨勢，而CMP隨時間變化呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，因此CMP和AMP可以實現(xiàn)完全分離，圖中沒有其他核苷酸的滲入。再生區(qū)：5根樹脂柱左邊3根樹脂柱獨立設(shè)置從左往右分別泵入再生劑水、酸、水進行再生，后面兩根樹脂柱串聯(lián)泵入堿進行再生；即使用1.2mol/L氫氧化鈉對再生區(qū)中前兩根即右邊兩根樹脂柱進行雜質(zhì)的去除，流量0.65BV/h，使用純水以1.5BV/h流量將再生區(qū)中第二根樹脂柱中氫氧化鈉沖洗干凈至流出液pH為9.5，使用1.2mol/L的鹽酸將再生區(qū)中第三根樹脂轉(zhuǎn)化為氫離子型，流量1.3BV/h，使用純水以1.5BV/h流量將再生區(qū)中第四根樹脂柱中樹脂間隙里的鹽酸沖洗干凈至流出液pH為4，再生完全。步驟2(圖7)：9根樹脂柱分為解吸區(qū)和再生區(qū)兩個區(qū)，其中，解吸區(qū)為4根樹脂柱，再生區(qū)為5根樹脂柱；步驟1中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中吸附區(qū)的樹脂柱之后與其串聯(lián)，形成步驟2中的解吸區(qū)的第一部分；步驟1中解吸區(qū)的第一根樹脂柱同時切換到步驟1中的再生區(qū)，作為步驟2中再生區(qū)的第一根樹脂柱；步驟1中解析區(qū)的第二根及與其串聯(lián)的之后的樹脂柱依舊保持串聯(lián)，作為步驟2中解吸區(qū)的第二部分；步驟2中解析區(qū)的第一部分和第二部分獨立處理；解吸區(qū)：第一部分，通入水洗脫，將步驟1中未洗脫完全的剩余GMP完全洗出，通入水洗脫至兩根樹脂柱中的第一根樹脂柱內(nèi)完全為AMP，第二根樹脂柱中完全是CMP，洗脫流速為1.26BV/h；如圖8所示，GMP隨時間變化呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，并且沒有其他核苷酸的滲入。第二部分，通入0.05mol/L氫氧化鈉水溶液洗脫至前一根樹脂柱中無AMP流出，并且在最后一根樹脂柱出口收集AMP，體積大約為600mL；如圖9所示，AMP隨時間變化呈現(xiàn)上升的趨勢，并沒有下降的趨勢。再生區(qū)：同步驟1中的操作。將步驟2中解吸區(qū)第二部分第一根樹脂柱切換至步驟2中的再生區(qū)作為步驟1中再生區(qū)的第一根樹脂柱；步驟2中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中的吸附區(qū)；步驟2中解吸區(qū)第二部分的第二根樹脂柱與解吸區(qū)第一部分的樹脂柱串聯(lián)，作為步驟1中的解吸區(qū)；循環(huán)進行步驟1和步驟2；保證所有樹脂柱同步切換，同時再生區(qū)按照堿-水-酸-水的方向進行切換。樹脂柱切換時間優(yōu)選為240min。通過該連續(xù)離子交換色譜工藝實現(xiàn)了四種5’-核苷酸的連續(xù)分離，四種核苷酸也實現(xiàn)完全分離，并且經(jīng)過六次切換之后得到四種核苷酸產(chǎn)物，分別是：尿苷酸(UMP)、鳥苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)和腺苷酸(AMP)，經(jīng)檢測純度分別為91.65％、97.28％、97.16％、97.39％，收率分別為97.76％、97.32％、97.39％、96.58％。另外四種核苷酸產(chǎn)物的濃度分別為2.53g/L、0.68g/L、0.39g/L、1.96g/L，其中AMP濃度較實施例2中濃度有所提高。實施例4：連續(xù)離子交換色譜技術(shù)分離酶解液中四種核苷酸。連續(xù)分離裝置中樹脂柱數(shù)量為12根，采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸的方法包括循環(huán)操作的兩個步驟：步驟1(圖10)：樹脂柱分為吸附區(qū)、解吸區(qū)和再生區(qū)三個區(qū)，其中，吸附區(qū)為1根樹脂柱，解吸區(qū)為5根樹脂柱，再生區(qū)為6根樹脂柱；吸附區(qū)：按0.042g5’-核苷酸/g濕樹脂的上樣量吸附預(yù)處理后的酶解液，酶解液濃度：尿嘧啶核苷酸4g/L，胞嘧啶核苷酸6g/L，鳥嘌呤核苷酸10g/L，腺嘌呤核苷酸11g/L，上樣時間為2h，上樣流速為0.52BV/h；此時大部分UMP不與樹脂發(fā)生離子交換流出，其余幾種核苷酸與樹脂發(fā)生離子交換并吸附至樹脂中，吸附完成后，用水洗脫樹脂柱，洗脫流速為1.65BV/h，水洗脫初期樹脂間隙中剩余UMP被快速洗出，隨后部分GMP也被洗出同時與UMP完全分離，洗脫出來的GMP的量大約為540mL水洗脫過程持續(xù)到CMP即將流出為止；解吸區(qū)：5根樹脂柱串聯(lián)，用0.2mol/L氫氧化鈉溶液洗脫，洗脫流速為3.9mL/min在倒數(shù)第二根樹脂柱出口處安裝三通閥，使得倒數(shù)第二根樹脂柱流出液中一半流出收集AMP，另外一半流入最后一根樹脂柱，最后一根樹脂柱出口收集CMP；再生區(qū)：6根樹脂柱左邊兩根樹脂柱串聯(lián)設(shè)置，第三根樹脂柱獨立設(shè)置，第四根和第五根樹脂柱串聯(lián)，最后一根獨立設(shè)置，從左往右分別泵入再生劑水、酸、水、堿進行再生，即：使用1.2mol/L氫氧化鈉對再生區(qū)中最右邊一根樹脂柱進行雜質(zhì)的去除，流量1.3BV/h，使用純水以0.75BV/h流量將再生區(qū)中第四根和第五根樹脂柱中氫氧化鈉沖洗干凈至流出液pH為9.5，使用1.2mol/L的鹽酸將再生區(qū)中第三根樹脂轉(zhuǎn)化為氫離子型，流量1.3BV/h，使用純水以0.75BV/h流量將再生區(qū)中第一根和第二根樹脂柱中樹脂間隙里的鹽酸沖洗干凈至流出液pH為4，再生完全。步驟2(圖11)：12根樹脂柱分為解吸區(qū)和再生區(qū)兩個區(qū)，其中，解吸區(qū)為6根樹脂柱，再生區(qū)為6根樹脂柱；步驟1中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中吸附區(qū)的樹脂柱之后與其串聯(lián)，形成步驟2中的解吸區(qū)的第一部分；步驟1中解吸區(qū)的第一根樹脂柱同時切換到步驟1中的再生區(qū)，作為步驟2中再生區(qū)的第一根樹脂柱；步驟1中解析區(qū)的第二根及與其串聯(lián)的之后的樹脂柱依舊保持串聯(lián)，作為步驟2中解吸區(qū)的第二部分；步驟2中解析區(qū)的第一部分和第二部分獨立處理；解吸區(qū)：第一部分，通入水洗脫，將步驟1中未洗脫完全的剩余GMP完全洗出，通入水洗脫至兩根樹脂柱中的第一根樹脂柱內(nèi)完全為AMP，第二根樹脂柱中完全是CMP，洗脫流速為3.6mL/min；第二部分，通入0.2mol/L的氫氧化鈉水溶液洗脫至前一根樹脂柱中無AMP流出，并且在最后一根樹脂柱出口收集AMP，體積大約為800mL；再生區(qū)：同步驟1中再生區(qū)的操作。將步驟2中解吸區(qū)第二部分第一根樹脂柱切換至步驟2中的再生區(qū)作為步驟1中再生區(qū)的第一根樹脂柱；步驟2中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中的吸附區(qū)；步驟2中解吸區(qū)第二部分的第二根樹脂柱與解吸區(qū)第一部分的樹脂柱串聯(lián)，作為步驟1中的解吸區(qū)；循環(huán)進行步驟1和步驟2；保證所有樹脂柱同步切換，同時再生區(qū)按照堿-水-酸-水的方向進行切換。樹脂柱切換時間優(yōu)選為240min。通過該連續(xù)離子交換色譜工藝實現(xiàn)了四種5’-核苷酸的連續(xù)分離，四種核苷酸也實現(xiàn)完全分離，并且經(jīng)過六次切換之后得到四種核苷酸產(chǎn)物，分別是：尿苷酸(UMP)、鳥苷酸(GMP)、胞苷酸(CMP)和腺苷酸(AMP)，經(jīng)檢測純度分別為92.89％、98.79％、98.54％、98.89％，收率分別為98.57％、98.82％、98.94％、97.39％。另外四種核苷酸產(chǎn)物的濃度分別為2.53g/L、0.68g/L、0.46g/L、2.03g/L，其中AMP濃度較實施例2中濃度有所提高，與實施例3中濃度相類似。當前第1頁1 2 3