本發(fā)明涉及分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR引物和探針及檢測方法。

背景技術(shù)：

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，它發(fā)病率高、傳染性強(qiáng)、潛伏期短，對人群尤其是兒童、老年人及機(jī)體免疫力低下的易患人群造成很大的危害。該病癥狀可累及全身，主要表現(xiàn)為急性高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度的呼吸道癥狀，可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥導(dǎo)致死亡。20世紀(jì)以來全球至少有4次流感大流行[雷達(dá)，等，2009；宋樂，江曉靜，2014]。流感屬于乙類傳染性，其致病因子流感病毒(Influenza virus)屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是一種帶包膜并且分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒(候文郁，等，2014)。根據(jù)流感病毒的NP蛋白和M蛋白的抗原性質(zhì)不同，可將流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒的傳染性、致病性和變異性都明顯高于其他兩種血清型，能引起世界性流感大流行(許沙沙，等，2015)；乙型流感病毒常引起局部暴發(fā)，不引起世界性流感大流行；丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn)，侵襲嬰幼兒，一般不引起流行(KAITLIN RL,et a1.2013)。

流感病毒的檢測方法包括分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。分離培養(yǎng)法是一種基于細(xì)胞病變的檢測方法，有TCID₅₀的測定和空斑實(shí)驗(yàn)，是流感病毒滴度測定的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，TClD₅₀實(shí)驗(yàn)測得結(jié)果的主觀性較強(qiáng)，結(jié)果不夠精確；空斑實(shí)驗(yàn)是病毒學(xué)中一種比較準(zhǔn)確的定量方法，但實(shí)驗(yàn)操作的熟練程度要求較高，以上兩種方法比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且我國大部分實(shí)驗(yàn)室達(dá)不到重大傳染病病毒分離培養(yǎng)要求，因而實(shí)驗(yàn)室通常采用免疫學(xué)檢測與核酸檢測法進(jìn)行診斷(蘇明權(quán)，等，2011)。免疫學(xué)檢測方法包括血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗(yàn)、免疫熒光(IF)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。免疫學(xué)檢測方法具有特異性強(qiáng)，敏感性高，適應(yīng)面廣，方法簡便快速，制樣簡單等特點(diǎn)，但存在操作費(fèi)時(shí)且敏感性較差的問題(Brittain-long R,et a1.2008)。在血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗(yàn)中，紅細(xì)胞濃度、稀釋液、反應(yīng)的溫度、加抗原與加紅細(xì)胞之間的時(shí)間間隔及結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)均會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，而且HI試驗(yàn)需預(yù)處理血清中的非特異性血凝抑制因子，其缺點(diǎn)是存在一定的假陽性。免疫熒光技術(shù)的非特異性染色問題也尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。與免疫熒光相似，ELISA檢測過程中，同樣會(huì)出現(xiàn)假陽性。分子生物學(xué)檢測是業(yè)內(nèi)公認(rèn)靈敏度和特異度最好的一種檢測方法。該方法是在PCR原理的基礎(chǔ)上，先后建立了多種PCR相關(guān)檢測方法，最常用的如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光PCR以及新型的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)技術(shù)。本研究利用熒光RT-PCR反應(yīng)的快速、靈敏及污染性小等特點(diǎn)，建立了基于TaqMan探針的多重?zé)晒釸T-PCR檢測方法，期望在D型流感病毒的檢測中發(fā)揮作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR引物和探針及檢測方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR引物和探針，包括一組用于檢測D型流感病毒的檢測引物和探針，具體如下：

F-primer：GAGAAACCAGCTTACTGCC(SEQ NO.1)，

R-primer：CTCATCTCTAGATTCCGCAT(SEQ NO.2)，

Probe：FAM-ATGACCCAGAGAAGTCAGTACGA-BHQ1(SEQ NO.3)。

一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR試劑盒，包括上述的引物和探針。

一種D型流感病毒的熒光PCR檢測方法，它包括以下步驟：

S1.提取待檢測樣品的RNA，并以此為模板RNA；

S2.以權(quán)利要求1所述的引物和探針進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；

S3.根據(jù)擴(kuò)增曲線，對照陽性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果，判斷樣品是否為D型流感病毒。

進(jìn)一步地，所述RT-PCR反應(yīng)體系為總體積為25μL，其中上游、下游引物10μmol/L各1.0μL，探針10μmol/L 0.5μL，模板RNA 5.0μL，最后補(bǔ)水至25μL；將加入反應(yīng)液的PCR管5000r/min離心30s后放入檢測儀器，反應(yīng)程序設(shè)置：第一階段：42℃10min，95℃3min；第二階段：95℃30s，45℃30s，72℃30s，5個(gè)循環(huán)；第三階段：95℃15s，55℃40s，40個(gè)循環(huán)，在55℃40s收集熒光信號。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明根據(jù)GenBank中公布的A型、B型、C型和D型流感病毒的NS基因序列，進(jìn)行多序列比對之后，使用分子生物學(xué)軟件Oligo7.0在D型流感病毒基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一套特異性的引物和探針，通過RT-PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)檢測方法簡單，檢測迅速，便捷的定量檢測，同時(shí)靈敏度試驗(yàn)顯示最低能夠檢測到10個(gè)拷貝。

附圖說明

圖1為本發(fā)明RT-PCR體系鑒定結(jié)果；

圖2為本發(fā)明RT-PCR靈敏度鑒定結(jié)果；

圖3為本發(fā)明RT-PCR特異性鑒定結(jié)果(由左向右為10⁹-10¹)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。

試驗(yàn)例

A型流感滅活病毒7株，分別為H1N1、H3N2、H5N1、H5N2、H6N2、H7N9和H9N2；B型流感病毒RNA 21份，均存放于-80℃冰箱保藏，C型和D型流感病毒NS基因克隆質(zhì)粒各1份，根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)上公布的C型和D型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)序列全基因合成并克隆到PES載體上。

病毒RNA柱式提取試劑盒為北京森康公司產(chǎn)品，RNA體系反應(yīng)液TaKaRa One step PrimeScriptTM RT-PCR Kit，為TaKaRa公司產(chǎn)品。

根據(jù)GenBank中公布的A型、B型、C型和D型流感病毒的NS基因序列，進(jìn)行多序列比對之后，使用分子生物學(xué)軟件Oligo7.0在D型流感病毒基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一套特異性的引物、探針，由上海輝睿生物科技有限公司合成。引物、探針用DEPC水稀釋成100pmol/μL溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄幸姳?。

表1 D型流感病毒引物、探針序列

RNA提取方法分別按照RNA提取試劑盒說明書的要求進(jìn)行，獲得的模板的260/280比值應(yīng)在1.8～2.0之間才說明提取的RNA適合做后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)。

以樣品RNA和質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，按照TaKaRa反應(yīng)試劑盒RR064A的說明書配制，其中上游、下游引物10μmol/L各1.0μL，探針10μmol/L 0.5μL，RNA模版5.0μL，最后補(bǔ)水至25μL。將加入反應(yīng)液的PCR管5000r/min離心30s后放入檢測儀器，反應(yīng)程序設(shè)置：第一階段：42℃10min，95℃3min；第二階段：95℃30s，45℃30s，72℃30s，5個(gè)循環(huán)；第三階段：95℃15s，55℃40s(收集熒光信號)，40個(gè)循環(huán)，檢測結(jié)果如圖1。

方法靈敏度試驗(yàn)：將合成D型流感病毒重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。用紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算為目的基因的拷貝數(shù)，以10倍梯度稀釋至10拷貝/μL，對梯度稀釋的陽性對照進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)檢測；

將濃度為10⁹至10¹的9個(gè)梯度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品使用上述的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)熒光RT-PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證建立方法的靈敏度，檢測結(jié)果如圖2。

方法特異性試驗(yàn)：將樣品RNA和質(zhì)粒作為模板，使用上述的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增擴(kuò)增，以驗(yàn)證所建立方法的特異性，檢測結(jié)果如圖3。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120> 一種用于檢測D型流感病毒的熒光PCR引物和探針及檢測方法

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GAGAAACCAG CTTACTGCC 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

CTCATCTCTA GATTCCGCAT 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ATGACCCAGA GAAGTCAGTA CGA 23