本發(fā)明涉及分子檢測技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種用于檢測D型流感病毒的RT-LAMP引物及檢測方法。
背景技術(shù):
流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒感染引起的急性呼吸道傳染病,它發(fā)病率高、傳染性強、潛伏期短,對人群尤其是兒童、老年人及機體免疫力低下的易患人群造成很大的危害。該病癥狀可累及全身,主要表現(xiàn)為急性高熱、全身疼痛、顯著乏力和輕度的呼吸道癥狀,可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥導(dǎo)致死亡。20世紀(jì)以來全球至少有4次流感大流行[雷達,等,2009;宋樂,江曉靜,2014]。流感屬于乙類傳染性,其致病因子流感病毒(Influenza virus)屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),是一種帶包膜并且分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA病毒(候文郁,等,2014)。根據(jù)流感病毒的NP蛋白和M蛋白的抗原性質(zhì)不同,可將流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒的傳染性、致病性和變異性都明顯高于其他兩種血清型,能引起世界性流感大流行(許沙沙,等,2015);乙型流感病毒常引起局部暴發(fā),不引起世界性流感大流行;丙型流感病毒主要以散在形式出現(xiàn),侵襲嬰幼兒,一般不引起流行(KAITLIN RL,et a1.2013)。
流感病毒的檢測方法包括分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測。分離培養(yǎng)法是一種基于細胞病變的檢測方法,有TCID50的測定和空斑實驗,是流感病毒滴度測定的常規(guī)實驗方法,TClD50實驗測得結(jié)果的主觀性較強,結(jié)果不夠精確;空斑實驗是病毒學(xué)中一種比較準(zhǔn)確的定量方法,但實驗操作的熟練程度要求較高,以上兩種方法比較費時費力,且我國大部分實驗室達不到重大傳染病病毒分離培養(yǎng)要求,因而實驗室通常采用免疫學(xué)檢測與核酸檢測法進行診斷(蘇明權(quán),等,2011)。免疫學(xué)檢測方法包括血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗、免疫熒光(IF)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。免疫學(xué)檢測方法具有特異性強,敏感性高,適應(yīng)面廣,方法簡便快速,制樣簡單等特點,但存在操作費時且敏感性較差的問題(Brittain-long R,et a1.2008)。在血凝(HA)與血凝抑制(HI)試驗中,紅細胞濃度、稀釋液、反應(yīng)的溫度、加抗原與加紅細胞之間的時間間隔及結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)均會影響試驗結(jié)果,而且HI試驗需預(yù)處理血清中的非特異性血凝抑制因子,其缺點是存在一定的假陽性。免疫熒光技術(shù)的非特異性染色問題也尚未完全解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。與免疫熒光相似,ELISA檢測過程中,同樣會出現(xiàn)假陽性。分子生物學(xué)檢測是業(yè)內(nèi)公認(rèn)靈敏度和特異度最好的一種檢測方法。該方法是在PCR原理的基礎(chǔ)上,先后建立了多種PCR相關(guān)檢測方法,最常用的如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實時熒光PCR以及新型的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(1oop-mediaed isothermal amplification,LAMP)是日本Notomi等(Notomi T,et a1.2000)在2000年報道的一種新的核酸擴增技術(shù)。與傳統(tǒng)的擴增技術(shù)相比,該技術(shù)擴增的特異性更強,反應(yīng)過程只需在60~65℃的恒溫條件下60~90min即可完成,不需要熱循環(huán)。由于反應(yīng)過程中不需要開啟試管蓋,因此大大降低了實驗室污染的可能性,并且具有重復(fù)性好、特意性強、敏感度高和易于操作等特點,是未來流感病毒檢測應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。目前,國內(nèi)外尚未見以熒光RT-LAMP方法檢測D型流感病毒的報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種用于檢測D型流感病毒的RT-LAMP引物及檢測方法,選取D型流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列,針對病毒的高保守區(qū)域的6個特異性序列(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3)設(shè)計了6條特異性引物,旨在建立一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)的D型流感病毒檢測方法,該方法在60℃~65℃恒溫條件下1h甚至更短的時間即可完成基因擴增。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:
一種用于檢測D型流感病毒的RT-LAMP引物,包括正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、正向環(huán)引物L(fēng)F和反向環(huán)引物L(fēng)B;所述正向內(nèi)引物FIP如SEQ NO.1所示,反向內(nèi)引物BIP如SEQ NO.2所示,正向外引物F3如SEQ NO.3所示,反向外引物B3如SEQ NO.4所示,正向環(huán)引物L(fēng)F如SEQ NO.5所示,反向環(huán)引物L(fēng)B如SEQ NO.6所示。
上述RT-LAMP引物檢測D型流感病毒的檢測方法,它包括以下步驟:
S1.提取流感病毒樣本的總RNA,并以此為模板RNA;
S2.將2μL的模板RNA、12.5μL的反應(yīng)液RM、40μM的FIP和BIP各1μL、20μM的LF和LB各1μL、5μM的F3和B3各1μL、1μL的Bst DNA聚合酶、0.5μL的逆轉(zhuǎn)錄酶、0.5μL熒光染料混合,加水至25mL混勻,加入20μL密封液,密封,混勻離心;
S3.進行RT-LAMP反應(yīng)程序:63℃30S,1個循環(huán);63℃15s、63℃45s,60個循環(huán);于63℃45s處收集熒光信號。
進一步地,所述密封液為液體石蠟。
本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明選取D型流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列,針對病毒的高保守區(qū)域的6個特異性序列(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3)設(shè)計了6條特異性引物,旨在建立一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)的D型流感病毒檢測方法,該方法在60℃~65℃恒溫條件下1h甚至更短的時間即可完成基因擴增,實現(xiàn)檢測方法簡單,檢測迅速,便捷的檢測。
附圖說明
圖1為本發(fā)明RT-LAMP體系檢測結(jié)果;
圖2為本發(fā)明RT-LAMP特異性檢測結(jié)果;
圖3為本發(fā)明RT-LAMP靈敏度檢測結(jié)果(由左向右為109-101)。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術(shù)方案,但本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。
試驗例
按照引物設(shè)計原則,選取D型流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列,針對病毒的高保守區(qū)域的6個特異性序列(3’端的F3c、F2c、F1c以及5’端的B1、B2、B3),用LAMP designer1.14軟件設(shè)計6條引物,分別為正向內(nèi)引物(FIP)、反向內(nèi)引物(BIP)、正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向環(huán)引物(LF)及反向環(huán)引物(LB),引物序列見表1;引物由上海Invitrogen生物科技有限公司合成;合成后的引物用滅菌DEPC水稀釋成100pmol/μL溶液,-20℃保存。
表1 D型流感病毒RT-LAMP引物
病毒RNA的提取方法參照OMEGA公司的Mag-Bind Viral DNA/RNA Kit說明書進行,提取流感病毒樣本的總RNA,并以總DNA為模板RNA;
配制25μL的RT-LAMP反應(yīng)體系成分,見表2;同時設(shè)立不含模板RNA的陰性對照組;
表2 RT-LAMP反應(yīng)混合物
將上述體系充分混勻后,加入20μL密封液(液體石蠟),混勻離心,封口膠封住蓋緊的管蓋;RT-LAMP反應(yīng)程序為:63℃30S,1個循環(huán);63℃15s、63℃45s,60個循環(huán);于63℃45s處收集熒光信號,熒光通道選為FAM;檢測結(jié)果如圖1所示。
特異性試驗
將提取的7株A型流感病毒RNA、21株B型流感病毒的RNA和重組的C型流感病毒質(zhì)粒、D型流感病毒質(zhì)粒,分別進行RT-LAMP擴增,對其擴增結(jié)果進行鑒定,以驗證所用引物及所建立方法的特異性,結(jié)果如圖2。
靈敏度試驗
將D型流感病毒的合成質(zhì)粒,用ND-1000微量分光光度計測定質(zhì)粒濃度,根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)換算為目的基因的拷貝數(shù),以10倍比稀釋至10拷貝/μL,對梯度稀釋的陽性對照進行RT-LAMP反應(yīng)檢測,結(jié)果如圖3。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式,應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式,不應(yīng)看作是對其他實施例的排除,而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境,并能夠在本文所述構(gòu)想范圍內(nèi),通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍,則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
<120> 一種用于檢測D型流感病毒的RT-LAMP引物及檢測方法
<130> 2016
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
TCAGAATTTG GAGAAGTGGA C 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
AGAGTTCACC ATCGCTACT 19
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
CAGAAGGGAT CTGTTTCACA TCCAGTTGTT GCCGTTGATG C 41
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GAGAAGGCGC AACTACTGGA GCCAGCTTGG ACTTCAATCT TA 42
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
CGTCTGATCT CATCTCTAGA TTCC 24
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
AGGTTCAGGA GTTGCTTGG 19