本發(fā)明涉及一種新型的抗體信號肽及其在缺少信號肽蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行分泌表達(dá)中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

信號肽是一類具有介導(dǎo)蛋白穿越細(xì)胞脂質(zhì)膜的蛋白短肽序列，它一般存在于分泌型蛋白或膜蛋白的末端，可以將目的蛋白定位于細(xì)胞外或者細(xì)胞膜上。信號肽的長度一般在30個氨基酸左右，位于蛋白序列的末端。如果將分泌型蛋白或膜蛋白的信號肽進(jìn)行缺失，該蛋白將會滯留于細(xì)胞內(nèi)，不能穿越細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞外或者細(xì)胞膜上。因此，蛋白質(zhì)穿越細(xì)胞膜需要一個完整的信號肽序列才能完成。信號肽的這一功能在真核表達(dá)中具有廣泛的應(yīng)用前景，如將細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白加入信號肽后，該蛋白就可以進(jìn)行分泌表達(dá)，這樣有利于該蛋白的純化?？贵w是哺乳動物的一類分泌型蛋白，由免疫系統(tǒng)中的B細(xì)胞分泌，由于抗體具有高度的多態(tài)性，每一個抗體分子的序列均不一樣，因此，每種抗體的信號肽序列也不同。我們在一株鼠抗豬B3-H7的抗體輕鏈中鑒定了一段包含18-21個氨基酸的短肽信號肽序列，該序列能指導(dǎo)缺乏信號肽的蛋白獲得分泌功能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新型的抗體信號肽，該信號肽可以實現(xiàn)缺少信號肽的蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)的分泌表達(dá)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

1.克隆小鼠重鏈的恒定區(qū)編碼基因(mFc)，并且使該克隆基因5’加上ATG起始密碼子，3’端帶上TAA終止密碼子，然后將該基因插入到真核表達(dá)載體pcDNA 3.1(+)BamHI和XhoI之間，構(gòu)成真核重組表達(dá)載體pcDNA-mFc。

2.克隆小鼠mFc(不帶起始密碼子，只帶終止密碼子)，并將其克隆到真核表達(dá)載體pcDNA 3.1(+)BamHI和XhoI之間，合成抗豬B7-H3抗體輕鏈5’端17-21位氨基酸的編碼基因片段，將這些基因片段分別連接于mFc前的HindIII與BamHI之間，分別構(gòu)成真核重組表達(dá)載體pcDNA-S 21-mFc(包含21個氨基酸的短肽)、pcDNA-S 20-mFc(包含20個氨基酸的短肽)、pcDNA-S 19-mFc(包含19個氨基酸的短肽)、pcDNA-S 18-mFc(包含18個氨基酸的短肽)和pcDNA-S 17-mFc(包含17個氨基酸的短肽)。

3.將構(gòu)建的各種真核重組載體(包括pcDNA-mFc、pcDNA-S 21-mFc、pcDNA-S 20-mFc、pcDNA-S 19-mFc、pcDNA-S 18-mFc和pcDNA-S 17-mFc)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后收集上清或細(xì)胞，收集的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行裂解，上清或裂解的細(xì)胞用protein G進(jìn)行純化，純化的產(chǎn)物進(jìn)行western Blot分析。

結(jié)果表明，本發(fā)明人在一株鼠抗豬B7-H3的抗體輕鏈中鑒定的一段包含18-21個氨基酸的短肽信號肽序列，該序列能指導(dǎo)缺乏信號肽的蛋白獲得分泌功能。

因此，在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出了一種新型的抗體信號肽，其是從一株鼠抗豬B7-H3的抗體輕鏈中鑒定出的一段包含18-21個氨基酸的短肽信號肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2-5所示。

編碼所述的抗體信號肽的核苷酸序列也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選的，所述的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.7-10所示。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的抗體信號肽在缺少信號肽的蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行分泌表達(dá)中的應(yīng)用。

其中，優(yōu)選的，所述的蛋白為單鏈抗體。

附圖說明

圖1為mFc蛋白的Western blot檢測結(jié)果；

A)不帶信號肽的mFc轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞進(jìn)行裂解，其中的mFc用protein G純化后進(jìn)行western Blot分析:1.蛋白質(zhì)marker；2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解產(chǎn)物經(jīng)protein G純化后進(jìn)行western Blot分析；3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清經(jīng)protein G純化后進(jìn)行western Blot分析；

B)帶不同長度信號肽的mFc基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后取上清，上清中的mFc用protein G純化后進(jìn)行western Blot分析：1.蛋白質(zhì)marker；2.N端帶21個氨基酸的信號肽的mFc基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的分析結(jié)果；3.N端帶20個氨基酸的信號肽的mFc基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的分析結(jié)果；4.N端帶19個氨基酸的信號肽的mFc基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的分析結(jié)果；5.N端帶18個氨基酸的信號肽的mFc基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的分析結(jié)果；6.N端帶17個氨基酸的信號肽的mFc基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的分析結(jié)果；7.培養(yǎng)基上清對照。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實施例1本發(fā)明的抗體信號肽及其在蛋白分泌表達(dá)中的應(yīng)用

1、小鼠重鏈的恒定區(qū)編碼基因(mFc)的擴(kuò)增及其表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)小鼠重鏈的恒定區(qū)編碼基因(mFc)設(shè)計克隆引物對如下：

mFc-F 1:5’GAGAGGATCCATGGAGCCCAGCGGGCCCATTTC3’和

mFc-R:5’GAGACTCGAGCCGGGTAAAGGTAAATGA3’

其中在上游引物(mFc-F 1)的5’端加入B amHI酶切位點(diǎn)(GGATCC)和起始密碼子(ATG)，下游引物(mFc-R)的5’端加入XhoI酶切位點(diǎn)(CTCGAG)。用該引物對從抗豬B7-H3雜交瘤細(xì)胞制備的cDNA中擴(kuò)增mFc片段(SEQ ID NO.11所示)，純化PCR產(chǎn)物后用B amHI和XhoI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化回收，將回收的mFc產(chǎn)物連接到用B amHI和XhoI酶切和純化的真核表達(dá)載體pcDNA 3.1(+)上，獲得真核重組表達(dá)載體pcDNA-mFc，該重組載體中不帶任何信號肽序列。

2、含有信號肽的小鼠mFc表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)克隆小鼠mFc設(shè)計克隆引物對如下：

mFc-F 2:5’GAGAGGATCCGAGCCCAGCGGGCCCATTTC3’(不帶起始密碼子)，用該引物與mFc-R一起配對擴(kuò)增mFc片段，該片段純化后用B amHI和XhoI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化回收，將回收的mFc產(chǎn)物連接到用B amHI和XhoI酶切和純化的真核表達(dá)載體pcDNA 3.1(+)上，獲得真核重組表達(dá)載體pcDNA-mFc 2(該重組載體中的mFc不含起始密碼子)。合成含有抗豬B7-H3抗體輕鏈5’端17-21個氨基酸的編碼基因片段，如下表1所示，將這些基因片段分別連接與mFc前的HindIII與BamHI之間，分別構(gòu)成真核重組表達(dá)載體pcDNA-S 21-mFc(包含21個氨基酸的短肽)、pcDNA-S 20-mFc(包含20個氨基酸的短肽)、pcDNA-S 19-mFc(包含19個氨基酸的短肽)、pcDNA-S 18-mFc(包含18個氨基酸的短肽)和pcDNA-S 17-mFc(包含17個氨基酸的短肽)。

表1

3、western Blot分析

將構(gòu)建的各種真核重組載體(包括pcDNA-mFc、pcDNA-S 21-mFc、pcDNA-S 20-mFc、pcDNA-S 19-mFc、pcDNA-S 18-mFc和pcDNA-S 17-mFc)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后收集上清或同時收集上清和細(xì)胞(pcDNA-mFc轉(zhuǎn)染的樣品)，收集的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行裂解，上清和裂解的細(xì)胞用protein G進(jìn)行純化，純化的產(chǎn)物進(jìn)行western Blot分析，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，本發(fā)明從一株鼠抗豬B7-H3的抗體輕鏈中鑒定出的包含18-21個氨基酸的短肽信號肽序列都可以指導(dǎo)缺乏信號肽的蛋白獲得分泌功能。

序列表

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

<120> 一種抗體信號肽及其應(yīng)用

<130> KLPI161220

<160> 11

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 信號肽

<400> 1

1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro

16 Ala Ser

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 短肽

1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro

16 Ala Ser Asn

<400> 3

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 短肽

<400> 1

1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro

16 Ala Ser Asn Ser

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 短肽

<400> 4

1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro

16 Ala Ser Asn Ser Asp

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 短肽

<400> 5

1 MET Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu MET Phe Trp Ile Pro

16 Ala Ser Asn Ser Asp Val

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 短肽編碼序列

<400> 6

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc c 51

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 短肽編碼序列

<400> 7

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caac 54

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 短肽編碼序列

<400> 8

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caacagt 57

<210> 9

<211> 60

<212> DNA

<213> 短肽編碼序列

<400> 9

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caacagtgat 60

<210> 10

<211> 63

<212> DNA

<213> 短肽編碼序列

<400> 10

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caacagtgat 60

gtt 63

<210> 11

<211> 726

<212> DNA

<213> mFc

<400> 11

gagcccagcg ggcccatttc aacaatcaac ccctgtcctc catgcaagga gtgtcacaaa 60

tgcccagctc ctaaccttga gggtggacca tccgtcttca tcttccctcc aaatatcaag 120

gatgtactca tgatctccct gacacccaag gtcacgtgtg tggtggtgga tgtgagcgag 180

gatgacccag acgtccagat cagctggttt gtgaacaacg tggaagtaca cacagctcag 240

acacaaaccc acagagagga ttacaacagt actatccggg tggtcagcac cctccccatc 300

cagcaccagg actggatgag tggcaaggag ttcaaatgca aggtcaacaa caaagacctc 360

ccatcaccca tcgagagaac catctcaaaa attaaagggc tagtcagagc tccacaggta 420

tacatcttgc cgccaccagc agagcagttg tccaggaaag atgtcagtct cacttgcctg 480

gtcgtgggct tcaaccctgg agacatcagt gtggagtgga ccagcaatgg gcatacagag 540

gagaactaca aggacaccgc accagtcctg gactctgacg gttcttactt catatatagc 600

aagctcaata tgaaaacaag caagtgggag aaaacagatt cctactcatg caacgtgaga 660

cacgagggtc tgaaaaatta ctacctgaag aagaccatct cccggtctcc gggtaaaggt 720

aaatga 726