本發(fā)明屬于生物技術(shù)學(xué)領(lǐng)域，涉及血清/血漿微小rna(microrna，簡(jiǎn)稱mirna)的應(yīng)用，公開(kāi)了一種用于鉛暴露工人崗前入職篩選的血清/血漿mirna及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鉛因其在環(huán)境中不可降解而普遍存在，可通過(guò)消化道、呼吸道等途徑進(jìn)入機(jī)體影響神經(jīng)、消化、造血等多個(gè)系統(tǒng)的功能，造成機(jī)體損害。鉛所致的神經(jīng)發(fā)育毒性無(wú)閾值，有研究報(bào)道即使血鉛水平低于100μg/l仍然存在神經(jīng)發(fā)育毒性(akesson,aetal2005)。因此，尋找鉛中毒易感者標(biāo)志物有助于及早發(fā)現(xiàn)鉛中毒易感人群。在既往研究中，多種mirnas被證實(shí)出現(xiàn)了差異性表達(dá)，并參與了鉛中毒的過(guò)程中。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，鉛引發(fā)的職業(yè)健康問(wèn)題也引起了相關(guān)政府部門(mén)的密切關(guān)注。國(guó)家職業(yè)安全與健康研究所(niosh)的一份報(bào)告估計(jì)，美國(guó)有大約300多萬(wàn)工人在工作時(shí)可能接觸鉛。2014年，中國(guó)疾病控制中心報(bào)告了224起慢性鉛中毒職業(yè)病例，血鉛濃度超過(guò)600μg/dl(blls)。工業(yè)鉛中毒的主要暴露源包括電池循環(huán)，鉛汽油工業(yè)，軸承臂工作，管道制造，造船，顏料和印刷。此外，靠近鉛相關(guān)工業(yè)廠房的農(nóng)田也容易受到污水污染，特別是在下游地區(qū)。

有毒金屬通常與人體中表觀遺傳學(xué)的修飾密切相關(guān)，包括dna甲基化，組蛋白乙?；蚼irna失調(diào)。這些表觀遺傳變化也可能通過(guò)其特殊機(jī)制影響基因的表達(dá)。作為表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要組成部分。微小rna(microrna，mirna)是一類長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸的非編碼rna，它參與細(xì)胞的靶mrna的3’端非翻譯區(qū)序列完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mrna降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)，血清/血漿mirna非常穩(wěn)定，反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境、煮沸、長(zhǎng)期保存等均不會(huì)造成血清/血漿mirna的損失，而且mirna在外周血中的表達(dá)同樣具有組織的相關(guān)性和特異性。循環(huán)mirna檢測(cè)損傷性小、靈敏度高、可重復(fù)性好、費(fèi)用低，已有很多關(guān)于血清/血漿mirna用于腫瘤早期檢測(cè)和預(yù)后生物標(biāo)志物的(avila-morenoetal.2011；quetal.2011；cortezetal.2012)，但其作為鉛暴露工人入職篩選還是首創(chuàng)。在這項(xiàng)研究中，我們通過(guò)調(diào)查鉛耐受型工人血清/血漿及年齡性別匹配的鉛易感型工人血清/血漿中篩選出差異表達(dá)的mirnas，然后找出血清/血漿中共同上調(diào)或下調(diào)的mirnas，作為鉛暴露工人崗前篩查血清/血漿mirna標(biāo)志物，為鉛暴露工人崗前入職篩選提供依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的，首次將鉛耐受型工人血清/血漿與年齡性別等匹配的鉛易感型工人血清/血漿篩選出差異表達(dá)的mirnas，然后找出血清/血漿中相對(duì)上調(diào)(明顯增加)或下調(diào)(明顯降低)的mirnas，再通過(guò)與入職前鉛耐受型工人和鉛易感型工人血清/血漿中mirnas做對(duì)比，找出入職前相同差異改變的mirna，作為篩選出鉛暴露工人崗前篩查血清/血漿mirna標(biāo)志物，為鉛暴露工人崗前入職篩選提供依據(jù)。

本發(fā)明技術(shù)方案：鉛暴露工人崗前入職篩選微小rna標(biāo)志物，即檢測(cè)鉛暴露工人的血清/血漿微小rna標(biāo)志物，所述生物標(biāo)志物為：mir-520c-3p、mir-211、mir-148a、mir-572。

其中mir-211序列uucccuuugucauccuucgccu。

所述鉛暴露工人崗前入職篩選微小rna標(biāo)志物在制備檢測(cè)的試劑盒中應(yīng)用。

試劑盒通過(guò)檢測(cè)鉛耐受者的mir-211含量，并與鉛易感者水平相比較來(lái)進(jìn)行鉛暴露工人崗前篩查。mir-211pcr擴(kuò)增法rt引物及擴(kuò)增引物或seqidno:3所示的mir-211探針?lè)z測(cè)引物；其中在于所述試劑盒中mir-211rt引物：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgataggcgaac

mir-211f端擴(kuò)增引物：acactccagctgggttccctttgtcatcct

mir-211r端擴(kuò)增引物：tggtgtcgtggagtc。

其中鉛耐受者血清/血漿中mir-520c-3p、mir-211、mir-148a含量明顯增高，是鉛易感型工人血清/血漿中的含量的2-3倍、鉛耐受者血清/血漿中mir-572明顯降低，是鉛易感型工人血清/血漿中的含量的0.3-0.5倍。

所述的應(yīng)用通過(guò)檢測(cè)鉛耐受組的mir-211含量，并與鉛易感組水平相比較進(jìn)行篩選。

有益效果：本發(fā)明首次將鉛耐受型工人血清/血漿與年齡性別等匹配的鉛易感型工人血清/血漿篩選出差異表達(dá)的mirnas，然后找出血清/血漿中相對(duì)上調(diào)或下調(diào)的mirnas，再通過(guò)與入職前鉛耐受型工人和鉛易感型工人血清/血漿中mirnas做對(duì)比，找出入職前相同差異改變的mirna，作為篩選出鉛暴露工人崗前篩查血清/血漿mirna標(biāo)志物，為鉛暴露工人崗前入職篩選提供依據(jù)。作為篩選出鉛暴露工人崗前篩查血清/血漿mirna標(biāo)志物，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，適用于大規(guī)模易感人群篩查。

附圖說(shuō)明

圖1中a、b、c、d分別對(duì)應(yīng)hsa-mir-520c-3p、hsa-mir-211、hsa-mir-148a和hsa-mir-572四個(gè)mirnas在226例鉛暴露工人血清/血漿中的表達(dá)水平；

圖2入職前鉛耐受型(圖2中左)和鉛易感型(圖2中右)工人血清/血漿中mir-211的表達(dá)水平。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的包含范圍不限于下述的實(shí)施例。下面的實(shí)施例中未注明的條件和方法等均按照常規(guī)或者制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例1：

樣本的篩選

血清/血漿樣本的收集：每位鉛暴露工人提供5ml新鮮血液，離心后收集上層血清/血漿，充分搖勻后置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。采用pe900t型原子吸收光譜儀及配套試劑測(cè)定血鉛值，206d型zpp測(cè)定儀測(cè)定鋅原卟啉值。

不同鉛酸蓄電池企業(yè)，相同工種中隨機(jī)整群抽取1130名職工，匹配性別、年齡及環(huán)境鉛暴露水平后篩選出血鉛濃度最高的10％人群共113例為鉛耐受組，血鉛≥400μg/l，篩選出血鉛濃度最低的10％人群共113例為鉛易感組，血鉛≤400μg/l。

所有工人都經(jīng)過(guò)資深醫(yī)生的診斷，使用統(tǒng)一的健康狀況調(diào)查表，以面對(duì)面的方式鉛暴露工人進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括一般人口學(xué)特征、學(xué)歷、暴露時(shí)間、工齡等相關(guān)信息。所有調(diào)查人員均經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)。

表1.總體鉛暴露工人基本信息

表2.篩選樣本基本信息

鉛暴露人群血清/血漿特異mirna表達(dá)譜初篩

(1)選取10例在性別、年齡、工齡、暴露時(shí)間匹配的鉛耐受型工人血清/血漿，同時(shí)選取10例性別、年齡、工齡、暴露時(shí)間匹配均匹配的鉛易感工人血清/血漿，鉛耐受型和鉛易感型的基本信息見(jiàn)表3a和表3b。

表3a.五例提供血清/血漿鉛耐受型工人的基本信息

表3b.五例提供血清/血漿鉛易感型工人的基本信息

(2)采用qiangen試劑盒從鉛暴露工人血清/血漿中提取總rna。

(3)通過(guò)taqman低密度芯片(taqmanlowdensityarray，tlda)篩選候選mirnas。

mirna表達(dá)譜分析及驗(yàn)證

對(duì)比分析鉛耐受組和鉛易感組的血清/血漿芯片mirna表達(dá)譜結(jié)果，以血清/血漿△△ct大于2為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出血清/血漿芯片結(jié)果mirnas共4個(gè)，分別為mir-520c-3p,mir-211,mir-148a和mir-572，其中在血鉛濃度高的耐受組mir-520c-3p,mir-211,mir-148a表達(dá)均下調(diào)。然而，mir-572的表達(dá)上調(diào)。在此基礎(chǔ)上，采用113例鉛耐受組與113例鉛易感組血清/血漿樣本對(duì)該4個(gè)mirnas進(jìn)行驗(yàn)證。

血清/血漿mirna表達(dá)量的檢測(cè)方法

本方法采用taqmanprobe-basedqrt-pcr檢測(cè)血清/血漿中mirna的表達(dá)量。

(1)rna的提取

血清/血漿rna采用lsreagent試劑提取，提取方法參照lsreagent說(shuō)明書(shū)流程進(jìn)行。

(2)逆轉(zhuǎn)錄

采用taqmanmirna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和mirna特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop)逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行mirna逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體操作參照abi公司推薦的程序，其中部分進(jìn)行調(diào)整，反應(yīng)體系包括3μl5×的逆轉(zhuǎn)錄引物(同時(shí)加入5個(gè)逆轉(zhuǎn)錄引物，每次包含內(nèi)參的逆轉(zhuǎn)錄引物)、1.5μl10×的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.15μl100mmol/l的dntp和dttp混合物、1μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50u/μl)、0.19μl的rna抑制劑，共5.84μl，每個(gè)反應(yīng)體系中加入9.16μlrna，總反應(yīng)體系為15μl。該方法的反應(yīng)條件為：16℃反應(yīng)30min，42℃反應(yīng)30min分鐘，最后85℃孵育5min。

(3)實(shí)時(shí)熒光定量pcr

采用taqman探針?lè)ㄟM(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，具體操作參照abi公司推薦的程序，其中部分進(jìn)行調(diào)整，反應(yīng)體系包括：0.25μl20×mirna檢測(cè)探針、2.5μl2×mastermix、1.25μl雙蒸水、1μl稀釋后的cdna，共5μl，每個(gè)mirna檢測(cè)實(shí)施4平行，以cel-mir-238為內(nèi)參。使用abiprism7900熒光定量pcr儀檢測(cè)，其反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)10min、95℃反應(yīng)15sec、60℃反應(yīng)1min，40個(gè)循環(huán)。逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量pcr過(guò)程所需探針由abi公司合成，相應(yīng)mirna的id號(hào)見(jiàn)后文提供。

分析鉛耐受組和鉛易感組血清/血漿中的mirna表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)是在pcr反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr進(jìn)程，ct值系指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。目的mirna起始拷貝數(shù)越多，則ct值越小，反之則越大。在目的mirna與內(nèi)參擴(kuò)增效率相同的情況下可以直接得到目的mirna相對(duì)于內(nèi)參的定量△ct＝ct目的-ct內(nèi)參，倍數(shù)＝△ct耐受/△ct易感。使用sds2.4軟件分析tlda芯片數(shù)據(jù)，采用sas10.0軟件做進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析。

表4四種mirnas在鉛暴露工人血清/血漿中的表達(dá)

篩選鉛暴露工人崗前入職的生物標(biāo)志物

通過(guò)入職前檢查的血液樣本，這些工人血鉛濃度低于50μg/dl，且沒(méi)有接觸任何鉛暴露的工作史。mir-211表達(dá)量在鉛易感組和鉛耐受組工人間差異存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＝0.009)，見(jiàn)圖2。這些結(jié)果表明，mir-211可能是一個(gè)鉛暴露敏感指標(biāo)，且始終貫穿不同時(shí)期的慢性鉛暴露生物標(biāo)志物。

所述試劑盒中含有seqidno:2所示的mir-211的rt引物、seqidno:3所示的mir-211的f端引物。

seqidno:1：mir-211：uucccuuugucauccuucgccu

seqidno:2：pcr擴(kuò)增法：

mir-211rt引物：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgataggcgaac

mir-211f端擴(kuò)增引物：acactccagctgggttccctttgtcatcct

mir-211r端擴(kuò)增引物：tggtgtcgtggagtc

內(nèi)參u6引物：u6-f：ctcgcttcggcagcac

u6-r：aacgcttcacgaatttgc

seqidno:3：探針?lè)z測(cè)：

內(nèi)參cel-39:000200

mir-211:000514

每個(gè)id的產(chǎn)品同時(shí)包括逆轉(zhuǎn)探針和pcr探針。

上述實(shí)例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

seqidno:1：mir-211：uucccuuugucauccuucgccu

seqidno:2：pcr擴(kuò)增法：

mir-211rt引物：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgataggcgaac

mir-211f端擴(kuò)增引物：acactccagctgggttccctttgtcatcct

mir-211r端擴(kuò)增引物：tggtgtcgtggagtc

內(nèi)參u6引物：u6-f：ctcgcttcggcagcac

u6-r：aacgcttcacgaatttgc

seqidno:3：探針?lè)z測(cè)：

內(nèi)參cel-39:000200

mir-211:000514