本發(fā)明涉及病毒培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種采用兩次細(xì)胞培養(yǎng)工藝提高病毒液病毒含量的方法。
背景技術(shù)：
病毒(Virus)由一種核酸分子(DNA或RNA)與蛋白質(zhì)(Protein)構(gòu)成或僅由蛋白質(zhì)構(gòu)成(如朊病毒)。病毒個體微小，結(jié)構(gòu)簡單。病毒沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由于沒有實現(xiàn)新陳代謝所必需的基本系統(tǒng)，所以病毒自身不能復(fù)制。但是當(dāng)它接觸到宿主細(xì)胞時，便脫去蛋白質(zhì)外套，它的核酸(基因)侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，借助后者的復(fù)制系統(tǒng)，按照病毒基因的指令復(fù)制新的病毒。
豬偽狂犬病(Porcine Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Porcinepseudorabies virus,PRV)引起的以發(fā)熱和腦脊髓炎為主要特征的急性、發(fā)熱性傳染病。該病可引起豬、牛、羊、犬、貓、家兔、小白鼠、水貂、狐等多種家畜和野生動物發(fā)病，具有高致死率。而豬是該病毒增殖感染唯一可存活的宿主，是該病毒的自然儲存庫。所以，從豬群中切斷偽狂犬病毒的傳播是控制偽狂犬病的有效途徑。成年豬一般呈隱性感染，引起生長停滯，增重緩慢等；懷孕母豬可導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、木乃伊等綜合癥；7日齡以內(nèi)的仔豬發(fā)病死亡率可達(dá)100％，斷奶仔豬發(fā)病率可達(dá)20％～40％。
目前，該病分布于全世界50多個國家和地區(qū)，我國已有23個省(市)報道了該病的發(fā)生，給畜牧業(yè)造成了巨大的損失。因此必須對該病進(jìn)行有效的預(yù)防和控制，最根本的措施是疫苗接種，而疫苗效果好壞主要取決于抗原的制備，抗原的制備又大多采用細(xì)胞增殖病毒的方法，但由于該病毒在不同的細(xì)胞上增 殖效果不盡相同，出現(xiàn)病變的時間、病變特征、病變觀察的難易程度、病毒含量均有所差別，如不能掌握其規(guī)律選擇最佳的細(xì)胞系進(jìn)行病毒的培養(yǎng)，將難以生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的疫苗的。
轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞是較傳統(tǒng)的一種生產(chǎn)工藝，該工藝按照常規(guī)的生產(chǎn)方法制備的半成品抗原效價較低，批間差會比較大，生產(chǎn)效率低下，難以達(dá)到配苗要求。常規(guī)方法的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)，常在接毒時間、接毒量以及收獲時間上進(jìn)行工藝摸索，找到病毒增殖的一個峰值；但是現(xiàn)有工藝基礎(chǔ)上對抗原病毒含量有進(jìn)一步提升難度是非常大的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種采用兩次細(xì)胞培養(yǎng)工藝提高病毒液病毒含量的方法。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明的一個實施例中提供了一種采用兩次細(xì)胞培養(yǎng)工藝提高病毒液病毒含量的方法，包括以下步驟：
(1)、細(xì)胞培養(yǎng)：取生長良好的傳代細(xì)胞，棄掉原培養(yǎng)液，使用PBS溶液沖洗；沖洗完畢后加入處理液進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，傳代時細(xì)胞的接種密度為20萬～40萬個/ml，獲得接種細(xì)胞；
(2)、制備種毒：取生長良好的傳代細(xì)胞加入生長液使傳代細(xì)胞長成單層后棄掉生長液，接種基礎(chǔ)種毒，加入維持液并使基礎(chǔ)種毒均勻而充分的接觸單層細(xì)胞，待細(xì)胞病變達(dá)到70％～80％時將細(xì)胞在低溫下凍融，凍融后收獲得到生產(chǎn)用種毒；
(3)、制備細(xì)胞懸液：在接種細(xì)胞中加入處理液分散成單個細(xì)胞，然后加入含有血清的維持液振蕩待用，得到細(xì)胞懸液；
(4)、制備病毒液：取生長成單層的接種細(xì)胞加入生產(chǎn)用種毒，然后再加 入細(xì)胞懸液后培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到70％～80％時停止培養(yǎng)進(jìn)行凍融處理，收獲病毒液。
優(yōu)選的，述傳代細(xì)胞為ST細(xì)胞或者VERO細(xì)胞。
優(yōu)選的，處理液為0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液。
優(yōu)選的，步驟(1)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，接種體積為接種瓶體積的10％。
優(yōu)選的，步驟(2)中基礎(chǔ)種毒為豬傳染性胃腸炎病毒TGEV或偽狂犬病毒；所述凍融的低溫溫度為-15℃。
優(yōu)選的，步驟(3)中加入接種瓶體積30％的維持液，所述維持液中含有2％～8％的血清。
優(yōu)選的，步驟(4)中細(xì)胞懸液的加入量為培養(yǎng)瓶體積的10％。
優(yōu)選的，步驟(4)中生產(chǎn)用種毒的接毒量為0.001MOI～0.1MOI。
優(yōu)選的，步驟(4)中培養(yǎng)溫度為37℃。
優(yōu)選的，步驟(4)中取生長成單層的接種細(xì)胞的具體過程為：接種細(xì)胞按照1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)40小時～60小時后細(xì)胞生長層致密單層。
優(yōu)選的，所示維持液為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％赤蘚酮糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％丁基羥基茴香醚、體積分?jǐn)?shù)為2％～5％牛血清的MEM培養(yǎng)基。
綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
本發(fā)明在現(xiàn)有常規(guī)的生產(chǎn)工藝上進(jìn)行了優(yōu)化，在單層細(xì)胞接種后再加入細(xì)胞懸液進(jìn)行兩次細(xì)胞培養(yǎng)工藝，能夠打破現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的瓶頸，有效提高病毒液中病毒的含量和滴度，有效縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本；同時本發(fā)明的方法還具有操作簡單和重復(fù)性好的特點。
具體實施方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例，對 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。
實施例一：偽狂犬病毒的增殖
1、實驗材料準(zhǔn)備
實驗細(xì)胞：ST細(xì)胞；
基礎(chǔ)種毒：偽狂犬病毒Bartha-K61株；
處理液：0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液；
培養(yǎng)瓶；
生長液：含體積濃度10％的新生牛血清(內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
維持液：含體積濃度2％的新生牛血清(內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
2、實驗步驟：
(1)、細(xì)胞培養(yǎng)：取生長良好的ST細(xì)胞，棄掉原培養(yǎng)液，使用PBS溶液沖洗1到2次；沖洗完畢后加入處理液進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，傳代時細(xì)胞的接種密度為30萬個/ml，獲得接種細(xì)胞；培養(yǎng)溫度37±0.5℃，轉(zhuǎn)速：10轉(zhuǎn)/小時；接種體積為接種瓶體積的10％；
(2)、制備種毒：取生長良好的ST細(xì)胞加入生長液在37℃下培養(yǎng)使傳代細(xì)胞長成單層后棄掉生長液，接種2％的基礎(chǔ)種毒，加入培養(yǎng)瓶體積10％的維持液轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶使基礎(chǔ)種毒均勻而充分的接觸單層細(xì)胞，最后把細(xì)胞瓶放入37℃培育箱內(nèi)培養(yǎng)，按時觀察。待細(xì)胞病變達(dá)到70％～80％時將細(xì)胞在置于-15℃下凍融，凍融后收獲得到生產(chǎn)用種毒；
(3)、制備細(xì)胞懸液：在接種細(xì)胞中加入處理液分散成單個細(xì)胞，然后加 入含有血清的維持液振蕩待用；維持液的加入體積為接種瓶體積的30％，維持液中含有2％的血清，得到細(xì)胞懸液；
(4)、制備病毒液：接種細(xì)胞按照1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)40小時～60小時后細(xì)胞生長層致密單層；取生長成單層的接種細(xì)胞加入生產(chǎn)用種毒，生產(chǎn)用種毒的接毒量為0.001MOI～0.1MOI。然后再加入細(xì)胞懸液后于37℃下培養(yǎng)，細(xì)胞懸液的加入量為培養(yǎng)瓶體積的10％；當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80％時停止培養(yǎng)于-15℃下進(jìn)行凍融處理，測定病毒含量為9.12logTCID50/ml，將收獲的病毒液置于2～8℃保存。
3、對比實驗：
采用現(xiàn)有的單層細(xì)胞接毒后培養(yǎng)制備病毒液，制備方法參考CN103756974專利中公開的方法。為了減少誤差，對比實驗設(shè)置三組，雙層細(xì)胞接毒為本發(fā)明的方法制備得到。對比實驗結(jié)果如表1所示。
表1：對比實驗數(shù)據(jù)結(jié)果(單位：TCID50/ml)
實施例二：
1、實驗材料準(zhǔn)備
實驗細(xì)胞：ST細(xì)胞；
基礎(chǔ)種毒：豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)SCJY株；
處理液：0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液；
培養(yǎng)瓶；
生長液：含體積濃度10％的新生牛血清(內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
維持液：含體積濃度4％的新生牛血清(內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
2、實驗步驟：
(1)、細(xì)胞培養(yǎng)：取生長良好的ST細(xì)胞，棄掉原培養(yǎng)液，使用PBS溶液沖洗1到2次；沖洗完畢后加入處理液進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，傳代時細(xì)胞的接種密度為35萬個/ml，獲得接種細(xì)胞；培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速：10轉(zhuǎn)/小時；接種體積為接種瓶體積的10％；
(2)、制備種毒：取生長良好的ST細(xì)胞加入生長液在37℃下培養(yǎng)使傳代細(xì)胞長成單層后棄掉生長液，接種3％的基礎(chǔ)種毒，加入培養(yǎng)瓶體積10％的維持液轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶使基礎(chǔ)種毒均勻而充分的接觸單層細(xì)胞，最后把細(xì)胞瓶放入37℃培育箱內(nèi)培養(yǎng)，按時觀察。待細(xì)胞病變達(dá)到75％時將細(xì)胞在置于-15℃下凍融，凍融后收獲得到生產(chǎn)用種毒；
(3)、制備細(xì)胞懸液：在接種細(xì)胞中加入處理液分散成單個細(xì)胞，然后加入含有血清的維持液振蕩待用；維持液的加入體積為接種瓶體積的30％，維持液中含有2％的血清，得到細(xì)胞懸液；
(4)、制備病毒液：接種細(xì)胞按照1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)40小時～60小時后細(xì)胞生長層致密單層；取生長成單層的接種細(xì)胞加入生產(chǎn)用種毒，生產(chǎn)用種毒的接毒量為0.001MOI～0.1MOI。然后再加入細(xì)胞懸液后于37℃下培養(yǎng)，細(xì)胞懸液的加入量為培養(yǎng)瓶體積的10％；當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80％時停止培養(yǎng)于-15℃下進(jìn)行凍融處理，測定病毒含量為9.12logTCID50/ml，將收獲的病毒液置于2～8℃保存。
3、對比實驗：
采用現(xiàn)有的單層細(xì)胞接毒后培養(yǎng)制備病毒液，制備方法參考CN103756974專利中公開的方法。為了減少誤差，對比實驗設(shè)置三組，雙層細(xì)胞接毒為本發(fā)明的方法制備得到。對比實驗結(jié)果如表2所示。
表2：對比實驗數(shù)據(jù)結(jié)果(單位：TCID50/ml)
實施例三：
1、實驗材料準(zhǔn)備
實驗細(xì)胞：VERO細(xì)胞；
基礎(chǔ)種毒：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)SCJY株；
處理液：0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液；
培養(yǎng)瓶；
生長液：含體積濃度10％的新生牛血清(內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
維持液：含體積濃度4％的新生牛血清(內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
2、實驗步驟：
(1)、細(xì)胞培養(yǎng)：取生長良好的ST細(xì)胞，棄掉原培養(yǎng)液，使用PBS溶液沖洗1到2次；沖洗完畢后加入處理液進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，傳代時細(xì)胞的接種密度為35萬個/ml，獲得接種細(xì)胞；培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速：10轉(zhuǎn)/小時；接種體 積為接種瓶體積的10％；
(2)、制備種毒：取生長良好的ST細(xì)胞加入生長液在37℃下培養(yǎng)使傳代細(xì)胞長成單層后棄掉生長液，接種3％的基礎(chǔ)種毒，加入培養(yǎng)瓶體積10％的維持液轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶使基礎(chǔ)種毒均勻而充分的接觸單層細(xì)胞，最后把細(xì)胞瓶放入37℃培育箱內(nèi)培養(yǎng)，按時觀察。待細(xì)胞病變達(dá)到75％時將細(xì)胞在置于-15℃下凍融，凍融后收獲得到生產(chǎn)用種毒；
(3)、制備細(xì)胞懸液：在接種細(xì)胞中加入處理液分散成單個細(xì)胞，然后加入含有血清的維持液振蕩待用；維持液的加入體積為接種瓶體積的30％，維持液中含有2％的血清，得到細(xì)胞懸液；
(4)、制備病毒液：接種細(xì)胞按照1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)40小時～60小時后細(xì)胞生長層致密單層；取生長成單層的接種細(xì)胞加入生產(chǎn)用種毒，生產(chǎn)用種毒的接毒量為0.001MOI～0.1MOI。然后再加入細(xì)胞懸液后于37℃下培養(yǎng)，細(xì)胞懸液的加入量為培養(yǎng)瓶體積的10％；當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80％時停止培養(yǎng)于-15℃下進(jìn)行凍融處理，測定病毒含量為9.12logTCID50/ml，將收獲的病毒液置于2～8℃保存。
3、對比實驗：
采用現(xiàn)有的單層細(xì)胞接毒后培養(yǎng)制備病毒液，制備方法參考CN103756974專利中公開的方法。為了減少誤差，對比實驗設(shè)置三組，雙層細(xì)胞接毒為本發(fā)明的方法制備得到。對比實驗結(jié)果如表3所示。
表3：對比實驗數(shù)據(jù)結(jié)果(單位：TCID50/ml)
從上述三組對比實驗可以得知，本發(fā)明采用雙層細(xì)胞培養(yǎng)方法相對于單層細(xì)胞接毒培養(yǎng)的方法能夠顯著提高病毒液中病毒含量。