本發(fā)明涉及一種鼠李糖乳桿菌凍干粉及其制備方法，屬于生物菌制品的生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鼠李糖乳桿菌是目前最受全球關(guān)注的益生菌之一。該菌能夠耐受動(dòng)物消化道環(huán)境,具有能夠在人和動(dòng)物腸道內(nèi)定植,起到調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉、排除毒素、預(yù)防齲齒和提高機(jī)體免疫力等功能特性。
菌粉便于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，并有利于后期產(chǎn)品的加工，乳酸菌的生產(chǎn)多以菌粉的形式呈現(xiàn)。目前真空冷凍干燥是生產(chǎn)菌粉最有效的干燥技術(shù)，其可以很好的保持菌體的生理生化特性和生物活性。乳酸菌預(yù)凍成固體后，水分不經(jīng)過液相，在真空和低溫條件下直接升華。但是不加任何保護(hù)的菌體直接凍干，必然引起機(jī)械損傷，細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性變化，動(dòng)態(tài)平衡的破壞，細(xì)胞會(huì)被殺死。因此，凍干乳酸菌時(shí)會(huì)添加凍干保護(hù)劑提高菌體的存活率。但是不同的蛋白因其性質(zhì)不同，保護(hù)效果亦不同，篩選保護(hù)效果好的蛋白質(zhì)是提高凍干存活率的先決條件。糖類被認(rèn)為具有通過氫鍵替代穩(wěn)定脂質(zhì)膜和蛋白的效果，同時(shí)也可以通過玻璃化過程形成無定形的非晶結(jié)構(gòu)。脫脂乳、蔗糖和海藻糖因其較好的保護(hù)效果，是經(jīng)常被使用的凍干保護(hù)劑。
雖然目前廣泛使用的保護(hù)劑在凍干乳酸菌時(shí)已具有較好效果，但是目前文獻(xiàn)報(bào)道的鼠李糖乳桿菌凍干粉的菌株存活率均較低。大量研究也表明不同的菌株需要的保護(hù)劑不同，保護(hù)劑的使用量也不同。這與菌株的特異性和菌體的大小有關(guān)系。因此一種更有效的保護(hù)鼠李糖乳桿菌的保護(hù)劑配方及制備策略是提高鼠李糖乳桿菌生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種凍干保護(hù)劑，成分包括乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑的組成為：乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種鼠李糖乳桿菌凍干粉，是由所述凍干保護(hù)劑和鼠李糖乳桿菌活性成分制成。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述凍干粉含有鼠李糖乳桿菌CGMCC1.549。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法，包括收集菌體、配制保護(hù)劑、凍干和保藏。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，收集濕菌體是收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期的鼠李糖乳桿菌，離心獲得菌泥。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述配制保護(hù)劑是配乳清蛋白，海藻糖，菊粉，谷胱甘肽，和咖啡酸溶液，分別滅菌并按終濃度乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L進(jìn)行混勻，制備成凍干保護(hù)劑。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述凍干是將收集的濕菌體與凍干保護(hù)劑溶液以0.5～2g:10mL的比例充分混勻，預(yù)凍，一次干燥，二次干燥。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述鼠李糖乳桿菌凍干粉的制備方法為：
(1)收集菌體：收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期的鼠李糖乳桿菌，在4000～6000rpm，4℃離心，用無菌生理鹽水洗滌菌體，然后在相同的條件下離心，得到菌泥。
(2)配制保護(hù)劑：配制乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻。
(3)凍干：將收集的鼠李糖乳桿菌菌泥與凍干保護(hù)劑溶液以0.5～2g:10mL的比例充分混勻，菌懸液倒入凍干容器中，液面厚度0.5～1.0cm，在真空冷凍干燥機(jī)凍干箱進(jìn)行真空冷凍干燥，具體步驟為：
(a)預(yù)凍：將產(chǎn)品溫度降至4℃，保持30～60分鐘，再降溫至-40℃，保持4～6小時(shí)。
(b)一次干燥：預(yù)凍完成后，將溫度降至-40℃以下，以0.5℃/min的升溫速率將產(chǎn)品溫度升至-20℃，保持-20℃20～30h。
(c)二次干燥：將產(chǎn)品溫度升至20℃，保持10～20小時(shí)，產(chǎn)品無水分揮發(fā)后結(jié)束凍干過程。
(4)菌粉的收集和保藏：凍干結(jié)束后，收集菌粉并進(jìn)行真空封裝。
本發(fā)明還要求保護(hù)所述凍干保護(hù)劑在發(fā)酵食品、化工生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
有益效果：本發(fā)明的凍干保護(hù)劑較常規(guī)保護(hù)劑能夠顯著提高鼠李糖乳桿菌的凍干存活率，制備的鼠李糖乳桿菌凍干粉中，鼠李糖乳桿菌活菌含量達(dá)到2.8～6.0×1011cfu/g，凍干存活率達(dá)到98％以上，且不會(huì)產(chǎn)生發(fā)酵性能減弱的現(xiàn)象。
具體實(shí)施方式
菌體發(fā)酵性能檢測(cè)：將菌體在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，挑取單菌落，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧活化培養(yǎng)至OD＝0.8，按體積比以5％的接種量轉(zhuǎn)接至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧發(fā)酵48h，測(cè)定乳酸產(chǎn)量Y0；將凍干粉中的菌體按上述相同方法活化、培養(yǎng)、發(fā)酵，測(cè)定乳酸產(chǎn)量Y1；發(fā)酵性能＝100％×Y1/Y0。
實(shí)施例1
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白80～120g/L，海藻糖40～60g/L，菊粉40～60g/L，谷胱甘肽3～6g/L，咖啡酸0.5～2g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護(hù)劑。
實(shí)施例2
以鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.549為例，評(píng)價(jià)凍干菌粉的效果。
(1)收集菌體：收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期的鼠李糖乳桿菌，在4000～6000rpm，4℃離心，用無菌生理鹽水洗滌菌體，然后在相同的條件下離心，得到菌泥。
(2)配制保護(hù)劑：配制乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻。
(3)凍干：將收集的鼠李糖乳桿菌菌泥與凍干保護(hù)劑溶液以0.5～2g:10mL的比例充分混勻，菌懸液倒入凍干容器中，液面厚度0.5～1.0cm，在真空冷凍干燥機(jī)凍干箱進(jìn)行真空冷凍干燥，具體步驟為：將產(chǎn)品溫度降至4℃，保持30～60分鐘，再降溫至-40℃，保持4～6小時(shí)；預(yù)凍完成后，將溫度降至-40℃以下，以0.5℃/min的升溫速率將產(chǎn)品溫度升至-20℃，保持-20℃20～30h；將產(chǎn)品溫度升至20℃，保持10～20小時(shí)，產(chǎn)品無水分揮發(fā)后結(jié)束凍干過程。
(4)菌粉的收集和保藏：凍干結(jié)束后，收集菌粉并進(jìn)行真空封裝。
(5)凍干完成后，凍干菌粉用無菌蒸餾水復(fù)溶至凍干前體積，測(cè)定活菌濃度、菌體發(fā)酵性能，計(jì)算凍干存活率，結(jié)果如表1所示。
表1 鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.549在兩種保護(hù)劑中的凍干存活率
凍干完成后，常規(guī)保護(hù)劑的保護(hù)效果顯著低于本發(fā)明保護(hù)劑，鼠李糖乳桿菌CGMCC1.549在常規(guī)保護(hù)劑的中凍干存活率均低于75％，發(fā)酵性能下降10～26％，而本發(fā)明保護(hù)劑顯著提高凍干存活率，活菌含量達(dá)到2.8～6.0×1011cfu/g，菌泥添加量低于1.0g/10mL保護(hù)劑時(shí)，凍干存活率達(dá)到100％，菌泥含量為2g/10mL時(shí)，存活率仍接近100％。
實(shí)施例3
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白90g/L，海藻糖60g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護(hù)劑。
實(shí)施例4
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉60g/L，谷胱甘肽5g/L，咖啡酸1.5g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護(hù)劑。
實(shí)施例5
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白90g/L，海藻糖40g/L，菊粉40g/L，谷胱甘肽4g/L，咖啡酸1.0g/L。將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護(hù)劑。
實(shí)施例6
稱取乳清蛋白、海藻糖、菊粉、谷胱甘肽、咖啡酸分別配制成溶液，將乳清蛋白、海藻糖、菊粉溶液115℃滅菌15min，谷胱甘肽、咖啡酸溶液過濾除菌；以終濃度乳清蛋白120g/L，海藻糖60g/L，菊粉60g/L，谷胱甘肽6g/L，咖啡酸2g/L將上述溶液在無菌環(huán)境下混勻，制備獲得凍干保護(hù)劑。
按實(shí)施例2的方法制備凍干粉，其區(qū)別在于，將菌體和實(shí)施例3～6制備的凍干保護(hù)劑以1g:10mL的比例充分混勻，結(jié)果如表2所示。
表2 鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.549在不同保護(hù)劑中的凍干存活率
結(jié)果顯示，本發(fā)明的方法制備的凍干保護(hù)劑具有理想的效果，可以使鼠李糖乳桿菌CGMCC 1.549凍干存活率接近100％，且保證凍干后的菌體發(fā)酵性能不降低。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。