本發(fā)明涉及一種噻唑類化合物，尤其涉及一種新型噻唑類化合物XQH-3-7及其在抗變形鏈球菌及抑制其生物膜形成中的應(yīng)用。該化合物可以抑制口腔中牙周細(xì)菌的生長，可用于防治齲齒，屬于口腔疾病防治藥物制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

相比于浮游(planktonic)的生長方式，絕大多數(shù)的細(xì)菌在自然環(huán)境中更傾向于采取生物膜(biofilm)的方式進(jìn)行生長。所謂的生物膜(也被稱之為生物被膜)是指細(xì)菌利用自身分泌的大分子胞外基質(zhì)將自身細(xì)胞包裹起來并附著于有生命或無生命物體表面的一類高度組織化的細(xì)胞群體。生物膜中存在大分子物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物質(zhì)。人體口腔中也存在著大量的微生物，他們利用口腔中殘留的碳水化合物和唾液以生物膜的形式寄居在人體牙齒的表面。正常情況下，口腔中的微生物在牙齒表面處于一種相對穩(wěn)定的生理平衡狀態(tài)，一旦這種平衡被打破就會引發(fā)齲齒(Selwitz et al.,2007)。

齲齒俗稱蟲牙、蛀牙，是一種細(xì)菌誘發(fā)的可導(dǎo)致牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)脫礦分解的慢性疾病。該病發(fā)病率高、涉獵范圍廣，尤其是在青少年和兒童中比較常見。齲齒患者對冷熱酸甜等刺激變得異常敏感并伴隨著疼痛(Fejerskov and Kidd,2009)。嚴(yán)重者會引發(fā)牙髓病、根尖病等一系列并發(fā)癥，甚至失去整個牙齒進(jìn)而影響身體健康和生活質(zhì)量。齲齒現(xiàn)已成為嚴(yán)重危害人類身體健康的主要口腔疾病之一(Pitts,2004)。在齲齒的形成過程中，變形鏈球菌(Streptococcus mutans)起著至關(guān)重要的作用。

變形鏈球菌是一類兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，是人體口腔中主要的致齲齒菌之一。變形鏈球菌不僅可以通過代謝產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)腐蝕牙釉質(zhì)，而且能夠通過產(chǎn)生葡聚糖轉(zhuǎn)移酶將口腔內(nèi)殘留的蔗糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠暇厶?。葡聚糖粘附到牙齒后很難被清除，并且能夠選擇性地吸附口腔中其他細(xì)菌，形成菌斑。菌斑中的細(xì)菌代謝產(chǎn)生酸性產(chǎn)物長期作用于牙齒會使牙齒脫礦產(chǎn)生齒洞，久而久之便會形成齲齒(Lemos et al.,2013)。

因此，尋找能夠抑制變形鏈球菌浮游細(xì)胞和生物膜形成的新型化合物將有助于人們開發(fā)新的預(yù)防齲病的治療措施及相關(guān)藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的需求，本發(fā)明的目的是提供一種新型噻唑類化合物XQH-3-7及其在抗變形鏈球菌及抑制其生物膜形成中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述噻唑類化合物XQH-3-7，其特征在于：該化合物化學(xué)分子式為C₁₆H₁₇N₅O₄S₂，中文名稱為N-(5-硝基噻唑-2-基)-1-(苯基甲硫酰胺)哌啶-4-甲酰胺，英文名稱為N-(3-bromophenyl)-4-(2-((5-nitrothiazol-2-yl)amino)-2-oxoethyl)piperazine-1-carboxamide，分子量為391.47，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(1)所示：

上述化合物易溶于二甲基亞砜(DMSO)，難溶于水。

上述化合物XQH-3-7的合成路線見如下反應(yīng)式：

其中：(a)HOBT，EDCI，三乙胺，室溫；(b)乙酸乙酯氯化氫飽和溶液，室溫；(d)三光氣，無水乙酸乙酯，0℃到回流；(e)三乙胺，無水四氫呋喃，0℃到室溫。根據(jù)常用的標(biāo)準(zhǔn)干燥方法干燥所用到的各種溶劑。

本發(fā)明所述噻唑類化合物XQH-3-7在制備抑制和殺傷變形鏈球菌(Streptococcus mutans)模式菌株和臨床菌株的浮游細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述噻唑類化合物XQH-3-7在制備抑制變形鏈球菌(Streptococcus mutans)模式菌株和臨床菌株生物膜的形成藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述噻唑類化合物XQH-3-7在制備口腔變形鏈球菌(Streptococcus mutans)生物膜抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述噻唑類化合物XQH-3-7在制備防治齲齒的靶向藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述噻唑類化合物XQH-3-7作為抑菌添加成分在制備牙膏、漱口水或消毒液中的應(yīng)用。

測試時用DMSO將化合物XQH-3-7溶解，配成終濃度為1024mg/L的母液貯存。

本發(fā)明測定了化合物XQH-3-7對變形鏈球菌模式菌株和臨床菌株的抑制效果。

結(jié)果顯示，化合物XQH-3-7對浮游狀態(tài)下的變形鏈球菌具有很好的抑菌活性和殺菌活性，其對變形鏈球菌UA159菌株的最小抑菌濃度為4mg/L，最小殺菌濃度為32mg/L，半數(shù)最大抑制濃度(IC₅₀)為0.918mg/L。當(dāng)培養(yǎng)基中化合物XQH-3-7終濃度達(dá)到4mg/L時對變形鏈球菌UA159菌株生物膜的抑制率為96.62％?；衔颴QH-3-7對變形鏈球菌6715-13菌株的最小抑菌濃度為4mg/L，最小殺菌濃度為32mg/L，半數(shù)最大抑制濃度(IC₅₀)為0.546mg/L。當(dāng)培養(yǎng)基中化合物XQH-3-7終濃度達(dá)到4mg/L時對變形鏈球菌6715-13菌株生物膜的抑制率為96.18％。

其中，所使用的變形鏈球菌UA159菌株為模式菌株，在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的參考基因組編號為NC_004350。本發(fā)明所使用的變形鏈球菌6715-13菌株為臨床菌株，分離自患有齲齒病人的口腔當(dāng)中。其最適的培養(yǎng)基優(yōu)選腦心浸液(Brain Heart Infusion)培養(yǎng)基(Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heart infusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodium chloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate 2.5g/L，pH 7.4±0.2)，最適的培養(yǎng)條件優(yōu)選厭氧，37℃靜置培養(yǎng)。

本發(fā)明公開的噻唑類化合物XQH-3-7分子量小、結(jié)構(gòu)相對簡單，抑菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抑制性強(qiáng)、殺傷效果好等特點(diǎn)，能夠顯著抑制變形鏈球菌浮游細(xì)胞和生物膜的形成，具有預(yù)防齲病的潛力，有望作為預(yù)防齲齒的新型靶向候選藥物。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合本發(fā)明提供的一種新型噻唑類化合物XQH-3-7進(jìn)一步描述其在殺傷、抑制變形鏈球菌浮游細(xì)胞及其生物膜形成過程中的應(yīng)用。所述內(nèi)容是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

實(shí)施例1：化合物XQH-3-7的制備

化合物XQH-3-7的合成路線見如下反應(yīng)式：

其中：(a)HOBT，EDCI，三乙胺，室溫；(b)乙酸乙酯氯化氫飽和溶液，室溫；(d)三光氣，無水乙酸乙酯，0℃到回流；(e)三乙胺，無水四氫呋喃，0℃到室溫。根據(jù)常用的標(biāo)準(zhǔn)干燥方法干燥所用到的各種溶劑。

具體反應(yīng)過程描述如下：

(1)中間體4-叔丁基-((5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰-1-羧酸(1)的制備。

將1-Boc-4-哌啶甲酸(1eq)溶解于N,N二甲基甲酰胺，再分別加入HOBt(1.2eq)和EDCI(1.2eq)，滴加三乙胺(1.2eq)。滴加完畢，再加入5-硝基2-氨基噻唑(1.2eq)，在常溫下反應(yīng)過夜，向反應(yīng)液中加200ml的蒸餾水，水相用乙酸乙酯萃取三次(3×200ml)，合并有機(jī)相用飽和NaCl洗兩次(2×100ml)，無水硫酸鎂干燥，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮得粗品。粗品經(jīng)硅膠色譜柱柱純化分離(二氯甲烷:甲醇＝v:v，200:1)得到黃色固體，產(chǎn)率75％。

(2)中間體2-(4-氨基-1-基)-N-(5-硝基噻唑-2-基)哌啶-4-甲酰胺(2)的制備

將乙酰氯慢慢滴入無水乙醇中(v:v,4:5)，生成HCl和乙酸乙酯，再將上一步中間體溶于其中,在常溫下攪拌15分鐘，用TLC檢測反應(yīng)完全，蒸干溶劑，得黃色固體，粗產(chǎn)品產(chǎn)率100％，未經(jīng)處理直接進(jìn)行下一步。

(3)N-(5-硝基噻唑-2-基-)-1-(苯基甲酰巰基)哌啶-4-酰(XQH-3-7)的制備

在0℃將中間體3(1eq)和三乙胺(1.2eq)溶解于無水四氫呋喃中，再逐滴滴加苯基異硫氰酸酯(1.2eq)，攪拌3h，用TLC檢測反應(yīng)，蒸出四氫呋喃，向反應(yīng)液中加50ml的蒸餾水，水相用乙酸乙酯萃取三次(3×50ml)，合并有機(jī)相用飽和氯化鈉溶液洗兩次(2×50ml)，無水硫酸鎂干燥30分鐘，然后經(jīng)真空蒸發(fā)濃縮得粗品。粗品經(jīng)硅膠色譜柱(200-300目)純化分離，(二氯甲烷:甲醇＝v:v,50:1)作為洗脫劑，得到類白色固體，產(chǎn)率61％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ13.19(s,1H),9.31(s,1H),8.64(s,1H),7.29(d,J＝6.0Hz,4H),7.10(d,J＝2.6Hz,1H),4.72(d,J＝13.3Hz,2H),3.20(t,J＝11.7Hz,2H),2.92(t,J＝12.9Hz,1H),1.94(d,J＝11.2Hz,2H),1.74-1.60(m,2H).ppm；ESI-MS:390.1[M-H].

實(shí)施例2：變形鏈球菌的準(zhǔn)備

(1)培養(yǎng)變形鏈球菌的培養(yǎng)基為腦心浸液(Brain Heart Infusion)培養(yǎng)基(品牌OXOID，貨號CM1135)，培養(yǎng)基主要成分為Brain infusion solids 12.5g/L，Beef heart infusion solids 5.0g/L，Proteose peptone 10.0g/L，Glucose 2.0g/L，Sodium chloride 5.0g/L，Di-sodium phosphate 2.5g/L，pH 7.4±0.2。如需配置成固體，需要添加瓊脂粉15g/L。115℃滅菌30min，冷卻后待用。

(2)培養(yǎng)變形鏈球菌生物膜的培養(yǎng)基為腦心浸液-蔗糖培養(yǎng)基，即在腦心浸液培養(yǎng)基中添加終濃度為1％的蔗糖。蔗糖需事先配成20％貯存液并用0.22μm的無菌濾器過濾除菌。

(3)用無菌接種環(huán)將變形鏈球菌模式菌株UA159和分離自齲齒病人口腔中的變形鏈球菌菌株6715-13在含有腦心浸液瓊脂固體培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行劃線，倒置于37℃的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至出現(xiàn)明顯的單菌落。

(4)用無菌的接種鏟刮取變形鏈球菌UA159和6715-13菌株，分別轉(zhuǎn)接到裝有腦心浸液液體培養(yǎng)基的試管中，在37℃的厭氧培養(yǎng)箱中靜置，培養(yǎng)至液體渾濁。

(5)用紫外可見分光光度計(jì)檢測變形鏈球菌在600nm下的吸光度值(OD_600nm)。

(6)用分析天平精確稱量化合物XQH-3-7，加入DMSO將其溶解，然后用孔徑為0.22μm的無菌濾器過濾除菌，配成終濃度為1024mg/L的貯存液，存放于-20℃待用。

實(shí)施例3：化合物XQH-3-7對變形鏈球菌浮游細(xì)胞的活性檢測

(1)按照實(shí)施例2中描述的方法準(zhǔn)備變形鏈球菌菌液和化合物XQH-3-7，將培養(yǎng)制對數(shù)期的變形鏈球菌UA159和6715-13菌液(OD_600nm＝0.8～1.0)用腦心浸液培養(yǎng)基稀釋至終濃度為5×10⁵cfu/ml待用。

(2)采用微量肉湯稀釋法檢測化合物XQH-3-7對變形鏈球菌UA159和6715-13浮游細(xì)胞的最小抑菌濃度。即將倍比稀釋后不同濃度的化合物XQH-3-7溶液分別加到無菌的96孔板中，第1至第11孔為加藥液的實(shí)驗(yàn)組，第12孔為不加藥作為生長對照組，每個孔中變形鏈球菌菌液終濃度為5×10⁵cfu/ml，此時，第1孔至第12孔藥物濃度分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0μg/ml。以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低濃度定位最小抑菌濃度(MIC)。

(3)將小孔內(nèi)的菌液均勻涂布到腦心浸液瓊脂固體培養(yǎng)基上后，在37℃厭氧培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24小時，以沒有細(xì)菌生產(chǎn)的最低濃度定位最小殺菌濃度(MBC)。

(4)用酶標(biāo)儀檢測每個小孔內(nèi)在600nm下的吸光度值，計(jì)算每個藥物濃度條件下細(xì)胞的抑制率，計(jì)算公式為抑制率＝(1-實(shí)驗(yàn)組/生長對照組)×100％，所得數(shù)據(jù)使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算半數(shù)最大抑制濃度(IC₅₀)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1.化合物XQH-3-7對變形鏈球菌UA159和6715-13浮游細(xì)胞的活性檢測

MIC：最小抑菌濃度；MBC：最小殺菌濃度；IC₅₀：半數(shù)最大抑制濃度

從表1我們可以看出，化合物XQH-3-7對變形鏈球菌UA159和6715-13浮游細(xì)胞具有很好的抑菌活性和殺傷活性?；衔颴QH-3-7對變形鏈球菌UA159浮游細(xì)胞的活性要明顯好于變形鏈球菌6715-13。

實(shí)施例4：化合物XQH-3-7對變形鏈球菌生物膜的抑制活性

(1)按照實(shí)施例2和3中描述的方法準(zhǔn)備變形鏈球菌菌液和化合物XQH-3-7，用腦心浸液-蔗糖培養(yǎng)基將處于對數(shù)期的變形鏈球菌稀釋至終濃度為5×10⁵cfu/ml待用。

(2)向無菌的96孔板中加入(1)中的菌液150μl，并以加入化合物XQH-3-7的孔(終濃度4mg/L)作為實(shí)驗(yàn)組，以不加化合物XQH-3-7的孔作為對照組。放于37℃厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)40小時。

(3)將每個孔中的浮游細(xì)胞移走，并用大量的水沖洗未吸附的細(xì)胞。

(4)向每個孔中加入0.1％的結(jié)晶紫溶液200μl，在室溫的條件下靜置5min進(jìn)行染色，然后移除結(jié)晶紫溶液，并用大量水沖洗掉除去未吸附的結(jié)晶紫。

(5)向每個孔中加入33％的乙酸溶液200μl溶解吸附的結(jié)晶紫，然后使用酶標(biāo)儀檢測590nm下的吸光度值，計(jì)算生物膜的抑制率，計(jì)算公式同實(shí)施例1。

結(jié)果顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中化合物XQH-3-7終濃度達(dá)到4mg/L時對變形鏈球菌UA159菌株生物膜的抑制率為96.62％，對變形鏈球菌6715-13菌株生物膜的抑制率為96.18％。