本發(fā)明涉及一種土霉素降解菌株的篩選方法，屬于微生物降解抗生素殘留技術領域。

背景技術：

土霉素(Oxytetracycline)，又稱地霉素，氧四環(huán)素，屬于四環(huán)素類抗生素。化學名稱為：(4s,4аR，5S，5аR，6S，12аS)-N-4-二甲胺基-1，4，4а，5，5а，6，11，12а-八氫，5,6，10，12，12а-六羥基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，分子式：C22H24N2O9，相對分子質(zhì)量：460.58，化學結構式為：

土霉素為廣譜抗生素，許多立克次體屬、支原體屬、衣原體屬、螺旋體、阿米巴原蟲和某些瘧原蟲對其敏感。其他如放線菌屬、炭疽桿菌、單核細胞增多性李斯特菌、梭狀芽孢桿菌、奴卡菌屬、弧菌、布魯菌屬、彎曲桿菌、耶爾森菌等也對其敏感。

目前，土霉素環(huán)境殘留問題已經(jīng)成為國內(nèi)外普遍關注的熱點環(huán)境問題之一。至今，國內(nèi)外有關土霉素生物降解與降解菌株篩選方面的研究報道也不是很多。

顯然，研究并提出一種快速、高效、并能同時獲得降解不同濃度土霉素菌株的篩選方法，特別是降解低濃度或貧營養(yǎng)級土霉素的高效菌株，以獲得最大程度地降解效果，在抗生素生物降解理論與方法的研究上具有重要的科學意義與應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速、高效、并能同時獲得降解不同濃度土霉素菌株的篩選方法。

一種土霉素降解菌株的篩選方法，包括以下過程：

1)土霉素降解菌株的分離

采集土霉素菌肥，然后將菌肥加入到蒸餾水中，混合均勻，提取菌肥浸出液；菌肥和蒸餾水的添加比例為1g：10ml；

分別吸取100ul菌肥浸出液，涂布于土霉素含量不同的無機鹽固體培養(yǎng)基上，置于30℃條件下遮光培養(yǎng)2天，得到菌落；培養(yǎng)基中土霉素含量為25mg/l-100mg/l；

2)菌株純化

將步驟1)分離得到的菌落，在含有土霉素的無機鹽固體培養(yǎng)基平板劃線，進一步分離和純化；此步驟可重復2-3次，直至得到單一菌落；然后將單菌落接入含有土霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中，置于30℃，150r/min震蕩條件下，遮光培養(yǎng)2天，得到單一菌落培養(yǎng)液；

3)菌株降解功能驗證

將步驟2)得到的培養(yǎng)液，在土霉素為唯一碳源且土霉素濃度不同的無機鹽固體培養(yǎng)基平板上劃線，30℃遮光培養(yǎng)2天；能夠生長的菌株即為能夠以土霉素為唯一碳源的降解菌株；通過觀察可以得到菌株能夠利用和降解土霉素的濃度范圍；

4)菌株降解活性驗證

將步驟3)得到的能夠以土霉素為唯一碳源生長的菌株，接到活化培養(yǎng)基上進行活化；然后將活化的菌液按1％的接種量，轉(zhuǎn)接到以土霉素為唯一碳源且濃度適宜的無機鹽液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min震蕩暗培養(yǎng)培養(yǎng)2天，最后用高效液相色譜法測定菌株對土霉素的降解率；試管斜面保存不同濃度降解率高的菌株，4℃儲存。

以上各個步驟所用到的培養(yǎng)基為：

步驟1)中無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌；在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度依次為25、50、100mg/l，搖勻。

步驟2)中無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌；在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度依次為25mg/l，搖勻。

步驟2)中無機鹽液體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌；在冷卻到室溫后，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度為25mg/l，搖勻。

步驟3)中無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌；在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度依次為50mg/l、100mg/l，搖勻。

步驟4)中細菌活化培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其配方為：牛肉膏3g，蛋白胨5g。氯化鈉5g，瓊脂18g，蒸餾水定容至1000ml，用1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2后滅菌。

其中，步驟1)和步驟2)包括以下過程：

a)菌種富集

采集菌肥，稱取菌肥10g，加至裝有100ml滅菌蒸餾水的三角瓶中(250ml，內(nèi)含玻璃珠)，在恒溫搖床上以30℃，200r/min震蕩30min，取出后靜置；吸取1ml菌肥浸出液，

裝入100ml富集培養(yǎng)基的500ml的三角瓶中，30℃,150r/min震蕩條件下，暗培養(yǎng)2天；然后取10ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新的相同的培養(yǎng)基中，在相同的條件下繼續(xù)富集培養(yǎng)一次；

無機鹽液體富集培養(yǎng)基組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，分裝到250ml三角瓶中，高壓滅菌，在超凈工作臺中添加土霉素，添加濃度依次為25、50、100mg/l，搖勻；

b)菌株分離

吸取100ul上述富集培養(yǎng)液，分別一一對應涂布于上面所述3種不同土霉素濃度的無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，置于30℃條件下遮光培養(yǎng)2天；

無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌；在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度與無機鹽液體富集培養(yǎng)基相同。

該土霉素降解菌即假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCC No13051，保藏日期為2016年9月28。附件提供保藏證明文件。

本發(fā)明采用一種土霉素降解菌株的篩選方法，篩選方法快速易行，經(jīng)濟廉價，所得到的菌株可用于制備土霉素菌劑菌劑；本發(fā)明利用土霉素菌肥為篩選的最初原料，所得到的菌株及制成的菌劑可直接應用于土霉素企業(yè)廢棄物的處理，也有可能應用于周邊被土霉素污染的土壤與水體環(huán)境的修復；本發(fā)明采用高效液相色譜法測定菌株降解活性，所得結果的準確度和精度較高。

附圖說明

圖1為土霉素標準溶液高效液相色譜圖；

圖2為土霉素高效液相色譜標準曲線圖；

圖3為土霉素降解菌株降解效率測定圖。

具體實施方式

結合實施例說明本發(fā)明的具體實施方式。

實施例1

菌樣品采集與處理

采集菌肥生產(chǎn)企業(yè)的菌肥，并稱取菌肥10g，加至裝有100ml滅菌蒸餾水的三角瓶中(250ml，內(nèi)含玻璃珠)，在恒溫搖床上以30℃，200r/min震蕩30min，取出后靜置；

菌株分離

吸取100ul菌肥浸出液，涂布于無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，置于30℃條件下遮光培養(yǎng)2天。無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌。在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度依次為25、50、100mg/l，搖勻。

菌株純化

取平板上分離得到的單菌落，在含有土霉素的無機鹽固體培養(yǎng)基平板劃線，進一步分離和純化；此步驟可重復2-3次，直至得到單一菌落；然后將單菌落接入含有土霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中，置于30℃，150r/min震蕩條件下，遮光培養(yǎng)2天；

無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌。在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度依次為25mg/l，搖勻。

無機鹽液體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌。在冷卻到室溫后，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度為25mg/l，搖勻。

菌株降解功能驗證

首先，對純化得到的菌株進行活化培養(yǎng)，用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基活化培養(yǎng)2天，得到菌株培養(yǎng)液。然后取培養(yǎng)液，在以土霉素為唯一碳源且土霉素濃度不同的無機鹽固體培養(yǎng)基平板上劃線，在30℃條件下，遮光培養(yǎng)2天。能夠生長的菌株即為能夠以土霉素為唯一碳源的降解菌株。觀察菌株在不同濃度土霉素平板上生長狀況，可以得到菌株適宜的降解土霉素的濃度與范圍。部分菌株實驗結果見表1。

無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌。在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度依次為50mg/l/100mg/l，搖勻。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，其配方為：牛肉膏3g，蛋白胨5g。氯化鈉5g，瓊脂18g，蒸餾水定容至1000ml，用1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2后滅菌。

表1不同土霉素濃度下菌株生長狀況

注：+代表生長；++代表大量生長；—代表未生長。

由表1可知，土霉素的濃度范圍在低濃度(≤25mg/l)、中低濃度(25-50mg/l)、中高濃度(50-100mg/l)、高濃度(≥100mg/l)時，都可得到降解菌株；

5)菌株降解活性鑒定

將具有降解土霉素的菌株轉(zhuǎn)接到無機鹽液體培養(yǎng)基上進行活化，并將活化的菌液按1％的接種量轉(zhuǎn)接到以土霉素為唯一碳源且濃度適宜的無機鹽液體培養(yǎng)基中，30℃，150r/min震蕩暗培養(yǎng)培養(yǎng)2天，最后用高效液相色譜法測定菌株對土霉素的降解率；試管斜面保存不同濃度降解率高的菌株，4℃儲存。

土霉素溶液全波段掃描實驗

取土霉素標準液2ml，加入比色管中。在紫外-可見分光光度計上進行全光譜掃描，發(fā)現(xiàn)355nm附近有吸收峰。因此，土霉素測定波長采用355nm。其高效液相色譜圖見圖1。

標準曲線的繪制

準確稱取土霉素標準品0.050g，加入少量甲醇溶解，然后轉(zhuǎn)移到10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成5mg·mL^-1的標準儲備液。標準溶液(3.125、6.25、12.5、25、50、100和200mg·L^-1)均由儲存標樣加甲醇稀釋配制而成。以上標準儲備液和標準溶液均保存在4℃冰箱中。用高效液相色譜儀進行測定，得到土霉素濃度x與峰面積y的線性回歸方程為y＝351612.1066x+877658.5417，R²＝0.99995，見圖2。

色譜條件：采用Sunfire C18色譜柱(150mm×4.6mm，3.5um，Waters，USA)；流動相為0.05％磷酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速為1.0mL·min^-1；柱溫35℃；進樣體積20ul；檢測波長為355nm。洗脫程序：0-17min，93.2％A，6.8％B。

樣品上機檢測，得到精確的降解率

取待測液1ml，加入5ml甲醇，搖勻，10000r/mim離心15min，取上清液，用0.22um針筒式微孔濾膜過濾得到濾液，然后用高效液相色譜儀進行測定，根據(jù)線性回歸方程計算出土霉素的含量與降解率。

實施例2

土霉素降解菌株的富集、分離與純化

菌種富集

采集菌肥，稱取菌肥10g，加至裝有100ml滅菌蒸餾水的三角瓶中(250ml，內(nèi)含玻璃珠)，在恒溫搖床上以30℃，200r/min震蕩30min，取出后靜置；吸取1ml菌肥浸出液，裝入100ml富集培養(yǎng)基的500ml的三角瓶中，30℃,150r/min震蕩條件下，暗培養(yǎng)2天；然后取10ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新的相同的培養(yǎng)基中，在相同的條件下繼續(xù)富集培養(yǎng)一次；

無機鹽液體富集培養(yǎng)基組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，分裝到250ml三角瓶中，高壓滅菌，在超凈工作臺中添加土霉素，添加濃度依次為25、50、100mg/l，搖勻。

菌株分離

吸取100ul上述富集培養(yǎng)液，分別一一對應涂布于上面所述3種不同土霉素濃度的無機鹽固體培養(yǎng)基平板上，置于30℃條件下遮光培養(yǎng)2天；

無機鹽固體培養(yǎng)基的組成為：氯化銨1g，磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鉀1.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈉1g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.0，高壓滅菌。在倒平板前，在培養(yǎng)基中添加土霉素，添加濃度與無機鹽液體富集培養(yǎng)基相同。之后的操作步驟同實施例1。

實施例3

土霉素降解菌株降解效率測定

在無機鹽液體培養(yǎng)基中添加100mg/l土霉素，搖勻，接入單菌落，置于30℃，150r/min條件下，遮光培養(yǎng)。色譜條件：采用Sunfire C18色譜柱(150mm×4.6mm，3.5um，Waters，USA)；流動相為0.05％磷酸水溶液(A)和乙腈(B)；流速為1.0mL·min^-1；柱溫35℃；進樣體積20ul；檢測波長為355nm。洗脫程序：0-17min，93.2％A，6.8％B。取待測液1ml，加入5ml甲醇，搖勻，10000r/mim離心15min，取上清液，用0.22um針筒式微孔濾膜過濾得到濾液，然后用高效液相色譜儀進行測定，如圖3，根據(jù)線性回歸方程計算出土霉素降解率。