本發(fā)明屬于鈷配合物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種鈷配合物與制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

DNA的有效識(shí)別在疾病治療、新藥研發(fā)及診斷方式的發(fā)展等方面起關(guān)鍵作用，因此研究者對(duì)于設(shè)計(jì)合成生理?xiàng)l件下識(shí)別DNA的小分子化合物產(chǎn)生了的極大興趣。過(guò)渡金屬化合物被廣泛用作研究一些生物大分子的探針，因此化學(xué)工作者致力于設(shè)計(jì)合成具有生物活性的過(guò)渡金屬配合物。開發(fā)低毒，水溶性好的新型藥物顯得尤為迫切。

以人體本身存在的微量元素作為金屬中心的配合物，可能對(duì)身體正常細(xì)胞具有較低的毒性，而且其水溶性也較好。鈷是人體必須的微量元素，作為生物體內(nèi)一些結(jié)構(gòu)和催化中心的輔助因子參與體內(nèi)多個(gè)生物反應(yīng)過(guò)程。近年來(lái)，許多鈷的化合物被設(shè)計(jì)合成，而且表現(xiàn)出了較好的DNA識(shí)別能力和抗腫瘤活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種鈷配合物與制備方法及其應(yīng)用，該鈷配合物具有較好的DNA鍵合能力和BSA鍵合能力，從而為產(chǎn)物作為藥物較好的在體內(nèi)運(yùn)輸提供了一定依據(jù)，制備方法簡(jiǎn)單、可靠。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種鈷配合物，化學(xué)式為[Co(bpma)(N₃)₃]，其中bpma為N-甲基-N,N-二吡啶甲基胺。

進(jìn)一步的，該鈷配合物的結(jié)構(gòu)式為：

進(jìn)一步的，該鈷配合物屬于單斜晶系，P2₁/n空間點(diǎn)群。晶胞參數(shù)為α＝γ＝90°，β＝105°，單胞體積為

進(jìn)一步的，該鈷配合物的中心離子Co^III的配位數(shù)是六，配位原子分別是bpma中的N1，N2，N3和三個(gè)疊氮陰離子的氮原子N4，N7，N10，形成一個(gè)八面體構(gòu)型，其中N1，N3，N7，N10組成八面體的赤道面，N2和N4占據(jù)八面體的頂點(diǎn)位置，與中心離子的距離分別是Co-N的平均鍵長(zhǎng)是金屬Co離子到赤道面的距離為

本發(fā)明還提供了制備所述鈷配合物的方法，包括如下步驟：

將Co(NO₃)₂·6H₂O溶于乙腈和水的混合溶液中，然后加入含有bpma的乙腈溶液，常溫下攪拌20～30min，接著加入NaN₃，待攪拌2.5～3小時(shí)后過(guò)濾，濾液置于室溫，揮發(fā)后得黑紅色針狀晶體即為產(chǎn)物，所述Co(NO₃)₂·6H₂O、bpma、NaN₃的投料范圍為(0.1～1.0mmol)：(0.1～1.0mmol)：(0.1～1.0mmol)。

進(jìn)一步的，所述Co(NO₃)₂·6H₂O、bpma、NaN₃的投料范圍為(0.1～0.5mmol)：(0.1～0.5mmol)：(0.3～1.0mmol)。

進(jìn)一步的，所述Co(NO₃)₂·6H₂O、bpma、NaN₃的摩爾比為1：1：3。

進(jìn)一步的，所述乙腈和水的體積比為(0.5～1)：(1～2)。

進(jìn)一步的，所述乙腈和水的體積比為1：2。

本發(fā)明同時(shí)提供了如上所述的鈷配合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。

電子吸收光譜實(shí)驗(yàn)和熒光淬滅實(shí)驗(yàn)證實(shí)所述配合物與CT-DNA之間有中等鍵合的插入作用。

電子吸收光譜實(shí)驗(yàn)證實(shí)配合物能夠有效地與BSA白蛋白結(jié)合。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的鈷配合物與制備方法及其應(yīng)用具有以下優(yōu)勢(shì)：

本發(fā)明所述的鈷配合物與制備方法及其應(yīng)用，步驟簡(jiǎn)短，常溫?cái)嚢?、自然揮發(fā)條件下即可得到目標(biāo)產(chǎn)物，不需過(guò)多外界輔助如加熱回流、水熱合成等，目標(biāo)產(chǎn)物具有良好的水溶性，從而為進(jìn)一步性質(zhì)測(cè)試及臨床試驗(yàn)提供一個(gè)良好的開端，產(chǎn)物與CT-DNA存在較強(qiáng)的鍵合作用；此外，化合物還能夠有效地與BSA鍵合，為化合物作為潛在藥物在體內(nèi)有效運(yùn)輸提供了有價(jià)值的信息，具體地將講，運(yùn)用多種光譜方法證實(shí)配合物與CT-DNA存在較強(qiáng)的鍵合作用，而且作用方式為部分插入作用；此外，運(yùn)用電子吸收光譜實(shí)驗(yàn)探討了配合物與BSA的相互作用，結(jié)果顯示配合物能夠有效地與BSA白蛋白結(jié)合。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所述的鈷配合物的單元結(jié)構(gòu)圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所述的鈷配合物的一維鏈?zhǔn)疽鈭D；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所述的鈷配合物的紫外-可見光譜示意圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1所述的鈷配合物在加入不同量的CT-DNA后的電子吸收光譜變化示意圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1所述的鈷配合物與EB競(jìng)爭(zhēng)的熒光淬滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1所述的鈷配合物在0℃和25℃下對(duì)EB-DNA復(fù)合物熒光的影響；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1所述的鈷配合物加入不同量BSA后的電子吸收光譜變化示意圖。

具體實(shí)施方式

除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖1～7來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1

將0.3mmol Co(NO₃)₂·6H₂O溶于15mL乙腈和水的體積比為1：2的混合溶液中，然后加入0.5mL含有bpma的乙腈溶液，其中bpma為0.3mmol，常溫下攪拌30min，接著加入0.6mmol NaN₃，待攪拌3小時(shí)后過(guò)濾，濾液置于室溫，揮發(fā)后得黑紅色針狀晶體即為產(chǎn)物。

1)元素分析結(jié)果(％)，實(shí)驗(yàn)值：C 39.14，H 3.75，N 42.16；理論值：C 39.16，H 3.77，N 42.18。

用KBr壓片的IR光譜值為：3414cm^-1(s)(ν_H2O)，2922cm^-1(w)(ν_C-H)，2027cm^-1(s)(ν_N≡N)，1634cm^-1(m)(ν_C-N)，769cm^-1(w),619cm^-1(w)。實(shí)驗(yàn)值與理論值基本一致。

X射線單晶衍射測(cè)定配合物晶體結(jié)構(gòu)：

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

在173(2)K下,選取大小合適的晶體，用經(jīng)石墨單色器單色化的Mo-Kα射線作為入射光源，以ω-2θ掃描方式收集衍射數(shù)據(jù)。晶體結(jié)構(gòu)用直接法解出，先用差值函數(shù)法和最小二乘法確定全部非原子氫坐標(biāo)，再用理論加氫的方法得到氫原子位置，最后用最小二乘法對(duì)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行精修。所有的計(jì)算使用SHELXS-97和SHELXL-97程序包進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

從元素分析、紅外光譜及X射線單晶衍射數(shù)據(jù)可知，配合物屬于單斜晶系，P2₁/n空間點(diǎn)群。如圖1所示，配合物的中心離子Co^III的配位數(shù)是六，配位原子分別是bpma中的N1，N2，N3和三個(gè)疊氮陰離子的氮原子N4，N7，N10，形成一個(gè)八面體構(gòu)型。其中N1，N3，N7，N10組成八面體的赤道面，N2和N4占據(jù)八面體的頂點(diǎn)位置。與中心離子的距離分別是Co-N的平均鍵長(zhǎng)是金屬Co離子到赤道面的距離為

配合物中存在多種弱作用力，如圖2所示，配合物通過(guò)C6-H6A…N12鍵，連成的一維鏈狀結(jié)構(gòu)。

2)實(shí)施配合物的紫外-可見光譜試驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

在室溫下，向樣品池和參比池中各加2.0mL三蒸水，然后向樣品池加入一定量體積濃的配合物水溶液并向參比池中補(bǔ)加相應(yīng)等體積的水。配合物的濃度為2.0×10^-4mol/L，在200-1200nm測(cè)定配合物的紫外可見光譜。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖3所示，配合物在200～1200nm的范圍內(nèi)有三個(gè)吸收帶。203nm處的吸收，為π-π躍遷；312nm處的吸收，為配體到金屬離子的荷移躍遷；570nm處的吸收，為金屬離子的d-d躍遷。

3)實(shí)施加入不同量的CT-DNA，觀察配合物的電子吸收光譜變化試驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

在室溫下，向樣品池和參比池中各加2.0mL緩沖溶液，然后向樣品池加入一定量體積的配合物溶液并向參比池中補(bǔ)加相應(yīng)等體積的緩沖溶液。用微量進(jìn)樣器向樣品池和參比池中加入一定量相同體積的CT-DNA儲(chǔ)備液，使CT-DNA與配合物的濃度比值不斷增加，觀察配合物吸收峰的變化并將數(shù)據(jù)保存，所述緩沖溶液中含有NaCl和Tris，其中NaCl的濃度為50mM，Tris的濃度為5mM，用三蒸水配制，用鹽酸調(diào)至pH＝7.4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

配合物在205nm處有強(qiáng)的紫外吸收，如圖4所示，隨著CT-DNA的逐漸等量加入，配合物的最大紫外吸收強(qiáng)度出現(xiàn)明顯的下降，即出現(xiàn)了明顯的“減色效應(yīng)”，同時(shí)伴隨了紅移現(xiàn)象，紅移距離△λ為11nm。配合物荷移躍遷峰也發(fā)生了減色效應(yīng)，但不如π-π躍遷峰減色明顯。說(shuō)明配合物在本實(shí)驗(yàn)條件下，可能是以部分插入的鍵合方式和DNA發(fā)生相互作用。

4)實(shí)施加入不同量的配合物，觀察EB-DNA的熒光淬滅試驗(yàn)：

銅配合物本身不產(chǎn)生熒光，所以不能采用直接熒光光譜法研究配合物與DNA的相互作用。故我們采用配合物淬滅EB-DNA結(jié)合物的熒光，通過(guò)研究EB-DNA結(jié)合物熒光強(qiáng)度的變化來(lái)間接測(cè)定配合物與DNA的結(jié)合程度。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

配制CT-DNA和EB的混合溶液，其含量分別為2.4×10^-6M EB和4.8×10^-5M CT-DNA，儲(chǔ)備于4℃冰箱中。配合物配制成10^-3M儲(chǔ)備液。淬滅滴定實(shí)驗(yàn)時(shí)，向樣品池中加入2.0mL儲(chǔ)備的EB-DNA混合液，觀察其熒光強(qiáng)度，然后用微量進(jìn)樣器每次向樣品池中加入等體積的配合物儲(chǔ)備液，觀察發(fā)射光譜的變化并將數(shù)據(jù)保存以便擬合處理。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

配合物淬滅EB-DNA的熒光光譜如圖5所示，在加入配合物后，EB-DNA的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)明顯的降低，并且隨著配合物濃度的增加，其熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明配合物與CT-DNA的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合取代了EB。根據(jù)經(jīng)典的熒光淬滅理論Stern–Volmer方程式，I₀/I＝1+K[Q]，以加入配合物前后EB-DNA的熒光強(qiáng)度比值(I₀/I)為縱坐標(biāo)，配合物的濃度為橫坐標(biāo)，做出了Stern–Volmer圖即圖5，對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到較好的線性關(guān)系。根據(jù)方程K_EB[EB]＝K_app[complex]，K_EB＝1.0×10⁷M^-1，其中[EB]＝2.38μM，計(jì)算出配合物的表觀鍵合常數(shù)Kapp為9.16×10⁴M^-1，小于經(jīng)典鍵合常數(shù)10⁷M^-1。說(shuō)明配合物與DNA之間為中等鍵合作用。

5)更進(jìn)一步分析了在0℃和25℃下，配合物對(duì)EB-DNA復(fù)合物熒光的影響。如圖6所示，配合物隨著溫度升高，斜率K減小，說(shuō)明該配合物與EB-DNA形成的復(fù)合物隨著溫度的升高越來(lái)越不穩(wěn)定，其熒光淬滅為靜態(tài)淬滅機(jī)理。

6)實(shí)施加入不同量的BSA，觀察配合物的電子吸收光譜變化試驗(yàn)：

血清白蛋白中含有色氨酸、苯丙氨酸、絡(luò)氨酸等具有光學(xué)活性的氨基酸殘基，當(dāng)血清白蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或者是氨基酸殘基所處的微環(huán)境受到干擾時(shí)，光學(xué)活性會(huì)發(fā)生變化。小分子配合物在和血清白蛋白作用時(shí)，能生成復(fù)合物或者是影響甚至是改變血清白蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響血清白蛋白的光譜變化。

紫外-可見吸收光譜法主要是利用血清白蛋白中色氨酸、苯丙氨酸、絡(luò)氨酸等氨基酸殘基吸收峰的變化來(lái)進(jìn)行分析的，如果吸收峰在小分子配合物和血清白蛋白作用的前后發(fā)生了變化，則說(shuō)明小分子配合物和血清白蛋白發(fā)生了作用。由此，我們通過(guò)電子吸收光譜研究了銅配合物與BSA的相互作用。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

在室溫下，向樣品池和參比池中各加2.0mL緩沖溶液，緩沖溶液用三蒸水配制的濃度為10mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH＝7.0，然后向樣品池加入一定量體積的配合物溶液并向參比池中補(bǔ)加相應(yīng)等體積的緩沖溶液。用微量進(jìn)樣器向樣品池和參比池中加入一定量相同體積的BSA儲(chǔ)備液，使BSA與配合物的濃度比值不斷增加，觀察配合物吸收峰的變化并將數(shù)據(jù)保存。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖7可以清晰地看出，隨著BSA的不斷加入，配合物在205nm處的π-π躍遷峰發(fā)生明顯的減色現(xiàn)象并伴有紅移，紅移的距離為6nm；255nm處的荷移躍遷峰幾乎未受BSA濃度增加的影響。說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下，表明配合物與BSA之間發(fā)生了相互作用。

表1配合物的晶體結(jié)構(gòu)的主要數(shù)據(jù)

表2配合物晶體的主要鍵長(zhǎng)、鍵角

實(shí)施例2

將0.1mmol Co(NO₃)₂·6H₂O溶于15mL乙腈和水1:2的混合溶液中，然后加入0.2mL含有bpma的乙腈溶液，其中bpma為0.1mmol，常溫下攪拌30min，接著加入0.3mmol NaN₃，待攪拌3小時(shí)后過(guò)濾，濾液置于室溫，揮發(fā)一個(gè)月。

結(jié)論:得到棕黑色粉末。

實(shí)施例3

將0.5mmol Co(NO₃)₂·6H₂O溶于20mL乙腈和水1:1的混合溶液中，然后加入1mL含有bpma的乙腈溶液，其中bpma為0.6mmol，常溫下攪拌30min，接著加入1mmol NaN₃，待攪拌3小時(shí)后過(guò)濾，濾液置于室溫，揮發(fā)兩個(gè)月。

結(jié)論:得到棕黑色微晶，不適合單晶解析。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。