本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與油菜遺傳學(xué)調(diào)控相關(guān)的低分子量富含半胱氨酸蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

油菜是重要的經(jīng)濟作物。來自油菜的菜籽油是人類最主要的食用油來源之一，是我國糧油安全保障的重要一環(huán)，為我國重要的戰(zhàn)略物質(zhì)之一。作為食用油，菜籽油含有人類所需的多種脂肪酸，如營養(yǎng)價值很高的油酸與亞油酸兩者含量高達90％以上，且菜籽油在人體中的消化率平均能達99％，為所有植物油中最高者。菜籽油中還含有多種脂溶性維生素，如維生素A、維生素D和維生素E，是人體脂溶性維生素的重要來源。除了作為食用油，菜籽油還是生物柴油的理想原料。

人們對油菜籽油脂合成與積累機制有一定的了解，并運用這些知識在油菜育種與油菜基因工程方面取得了很大的成績，比如在食用油方面選育出了低芥酸、低硫苷、低亞麻酸油菜品種，通過基因工程培育出了營養(yǎng)價值很高的高油酸品系；在工業(yè)用油方面培育出了高月桂酸與高芥酸油菜的培育；大規(guī)模生產(chǎn)的油菜籽含油量達到了42％左右。到目前為止盡管在油菜含油量與菜油品質(zhì)方面取得了很大的成績，但是油菜生產(chǎn)中還是會遇到一些新問題，比如相同的品種在不同的生態(tài)條件下栽培，種子含油量和產(chǎn)油量會發(fā)生改變，導(dǎo)致品種的適應(yīng)性受限；在相同地區(qū)栽培，不同的品種對氣候條件反應(yīng)不一致，有的產(chǎn)油量與品質(zhì)波動很大，有的影響較小；這些現(xiàn)象說明油菜種子中油脂的合成與積累過程中還有很多我們未知分子作用機制，對這些認(rèn)識上的缺陷，阻礙了人們進一步提高油菜油脂產(chǎn)量與品質(zhì)的努力。為了滿足社會發(fā)展對菜籽油的消費需求的不斷增加，必須對參與油菜油脂合成與積累的基因類型進行深入研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

低分子量富含半胱氨酸蛋白(low-molecular-weight cysteine-rich protein)基因在植物中是一個非常大的基因家族，在這個基因家族中，功能已知的基因是極少數(shù)，目前僅僅知道這個家族中的部分基因產(chǎn)物與抗病原菌相關(guān)，所以又命名為抗微生物肽；另一些已知的作用是參與植物花粉與柱頭識別。其他大部分基因功能未知。我們在對油菜油脂合成與積累的分子機制進行深入研究的過程中，從甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)一種編碼低分子量富含半胱氨酸蛋白的功能未知基因Bna78。本發(fā)明通過基因工程的方法，首次發(fā)現(xiàn)低分子量富含半胱氨酸蛋白Bna78及其編碼基因，該基因可用于提高甘藍(lán)型油菜種子中的含油量。本發(fā)明的目的是提供一種來源于甘藍(lán)型油菜的低分子量富含半胱氨酸蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白，所述蛋白來源于甘藍(lán)型油菜，其名稱為Bna78，所述蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)：

1)如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；

2)將SEQ ID No:1所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至五個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加而形成的且對植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。

序列表中的SEQ ID No:1由78個氨基酸殘基組成。

本發(fā)明還提供一種所述的甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白的編碼基因。

在一種具體的實施方式中，所述基因是下述核苷酸序列之一：

1)如SEQ ID No:2所示的核苷酸序列；

2)編碼SEQ ID No:1所示氨基酸序列的DNA序列；

3)與SEQ ID No:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且與SEQ ID No:2編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；

4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID No:2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。

上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下雜交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No:2由237個堿基組成，其編碼框為自5’端第1-237位堿基，編碼具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供一種如上所述甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的表達載體。

本發(fā)明還提供一種如上所述的甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

本發(fā)明還提供一種如上所述的甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的工程菌。

本發(fā)明還提供一種擴增如上所述的甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因中任一片段的引物對。

本發(fā)明還提供一種如上所述的甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因在植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。

在一種具體的實施方式中，所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物，且所述基因用于調(diào)控植物種子含油量；優(yōu)選所述植物為油菜。在一種具體的實施方式中，所述的植物為甘藍(lán)型油菜。

在一種具體的實施方式中，將所述甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的沉默表達載體轉(zhuǎn)化油菜，得到高含油量的油菜材料。

上述重組表達載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。

本發(fā)明的油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因的沉默表達轉(zhuǎn)基因植株種子含油量提高。本發(fā)明為油菜含油量的提高提供了一個目標(biāo)基因。本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其編碼基因具有較高的實際應(yīng)用價值，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明

圖1油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白Bna78基因全長CDS(蛋白質(zhì)編碼區(qū))的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果。

圖2 Bna78基因的過表達質(zhì)粒構(gòu)建的菌落PCR驗證，結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致。

圖3 Bna78基因的過表達質(zhì)粒構(gòu)建酶切驗證，結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致。

圖4 Bna78基因沉默質(zhì)粒構(gòu)建的片段PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果，結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致。

圖5 Bna78基因沉默質(zhì)粒構(gòu)建中干擾片段正向插入的PCR檢測，結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致。

圖6 Bna78基因沉默質(zhì)粒構(gòu)建中干擾片段反向插入的PCR檢測，結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致。

圖7正反向干擾片段插入后，Bna78基因沉默質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切驗證，結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致。

圖8轉(zhuǎn)pFGC5941-Napin-Bna78CDS質(zhì)粒的抗性苗PCR檢測結(jié)果。圖中M為100bp plus Ladder DNA；1-10為抗性苗，其中2-8為過表達轉(zhuǎn)基因植株；+為陽性對照；-為陰性對照；WT為空白對照。

圖9轉(zhuǎn)pFGC5941-Napin-Bna78RNAi質(zhì)粒的抗性苗PCR檢測結(jié)果。圖中M為100bp plus Ladder DNA；1-8為抗性苗，其中3為過表達轉(zhuǎn)基因植株；+為陽性對照；-為陰性對照；WT為空白對照。

圖10薄層層析分析檢測種子含油量變化。1為Bna78基因過表達轉(zhuǎn)基因植株種子；2為湘油15號對照；3為Bna78基因沉默轉(zhuǎn)基因植株種子。

圖11氣相色譜法分析種子含油量變化。1為Bna78基因沉默轉(zhuǎn)基因植株種子；2為湘油15號對照；3為Bna78基因過表達轉(zhuǎn)基因植株種子。

具體實施方式

下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。所用引物和測序工作由上海生工生物科技有限公司完成。

序列表中的SEQ ID No.1為Bna78基因?qū)?yīng)的氨基酸序列，SEQ ID No.2為Bna78基因的全長編碼序列，最后的TGA三個堿基為其終止密碼子，對應(yīng)SEQ ID No.1蛋白質(zhì)序列中的最后一點“.”。

實施例1

甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白基因Bna78全長CDS的獲得與過表達載體的構(gòu)建。

一、Bna78基因全長CDS的獲得

分別從甘藍(lán)型油菜“湘油15號”開花后生長20天(淀粉積累期)和35天(油脂積累期)的種子中分離mRNA，分別構(gòu)建cDNA文庫；以開花后35天的油菜種子cDNA文庫為檢測子(tester)、開花后20天的油菜種子cDNA文庫為驅(qū)動子(driver)，構(gòu)建種子中油脂合成期特異表達基因的抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)文庫。送上海生工生物公司測序后，在273條測序結(jié)果中，編號為T350078的EST，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blastx比對，確定其為低分子量富含半胱氨酸基因家族中的一員。將T350078的EST序列在Genoscope數(shù)據(jù)庫中進行Blast，查找到該基因全長與其cDNA全長序列，并將這一基因命名為Bna78。

根據(jù)Bna78基因的CDS全長序列，在其5’和3’末端序列設(shè)計一對引物，引物序列分別為：5’－ATGGCgAAgCTATCATGTTC－3’(SEQ ID No:3)，和5’－TCAACAATTCCAATTATAAGTACAAAG－3’(SEQ ID No:4)。以甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)開花后35天的種子為材料，用Trizol(Invitrogen)方法提取總RNA，以總RNA為模板，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)合成cDNA(依據(jù)RevertAid First strand cDNA Synthesis Kit的用戶手冊進行)。以cDNA為模板，高保真PCR擴增低分子量富含半胱氨酸蛋白基因Bna78的全長CDS序列。50μl PCR反應(yīng)體系包含：模板2μl，高保真酶Phusion High-fidelity DNA Polymerase(Invitrogen)1μl，10×緩沖液5μl，2.5uM dNTP 8μl，20μM的5'和3’引物各1μl，水32μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性30秒，57℃退火30秒，68℃延伸1分鐘，共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，回收并純化200bp左右的擴增片段，將其克隆到載體pEASY-Blunt Cloning(TaKaRa)中，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒pEASY-Bna78CDS，經(jīng)測序表明低分子量富含半胱氨酸蛋白基因Bna78全長CDS具有序列表中的SEQ ID No:2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID No:2由237個堿基組成，編碼具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，為78個氨基酸殘基，編碼的蛋白命名為Bna78。

二、Bna78基因過表達質(zhì)粒構(gòu)建

選擇測序正確的pEASY-Bna78cDNA重組質(zhì)粒，與pFGC5941-Napin質(zhì)粒分別同時用Fast Digest Enzyme NcoI和XbaI(Fermetans)對兩種質(zhì)粒進行雙酶切，酶切溫度37℃，酶切時間為30-40min，反應(yīng)體系40μL；酶切產(chǎn)物經(jīng)過1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的條帶，用膠回收試劑盒純化回收，將回收的兩個目標(biāo)DNA片段通過T4連接酶連接，連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Esherichia coli)DH5α，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm的條件下復(fù)蘇1h；將經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的細(xì)胞均勻涂于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)16h。挑取LB固體培養(yǎng)基上的單菌落，以NAPIN703F：5'-AACTCATCCGCTTCACTCTTTACTCAT-3'(SEQ ID No.5)和Bna78CDSR：5'-GCTCTAGAACAATTCCAATTATAAGTACAAAG-3'(SEQ ID No.6)引物對進行菌落PCR鑒定(圖2)，檢測結(jié)果與預(yù)期的一致。選擇PCR檢測正確的單菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以Fast Digest Enzyme NcoI和XbaI進行雙酶切驗證，結(jié)果如圖3所示，檢測結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致。PCR鑒定和雙酶切鑒定兩種結(jié)果都說明過表達質(zhì)粒pFGC5941-Napin-Bna78CDS構(gòu)建成功。質(zhì)粒轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌菌株LBA4404中用于油菜的轉(zhuǎn)化。

實施例2

用于Bna78基因沉默質(zhì)粒構(gòu)建干擾片段的克隆與RNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建。

一、用于Bna78基因沉默質(zhì)粒構(gòu)建干擾片段的克隆

以甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)開花后35天的種子為材料，提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，根據(jù)SEQ ID No.2的序列分別設(shè)計Bna78基因的干擾片段PCR擴增引物對(引物序列如下)，高保真PCR擴增目標(biāo)序列。

干擾片段序列擴增引物：

上游引物：5'-TTAATTAACCATGGACTGTGTGTATGTATGGGCT-3'(SEQ ID No.7)；下劃線為引入PacI和Nco1酶切位點。

下游引物：5'-TCTAGAGGCGCGCCCAGTTTTCATCATCTTCTCCTTC-3'(SEQ ID No.8)；下劃線為引入XbaI和Asc1酶切位點。

設(shè)計的PCR擴增片段大小為129bp。對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小與設(shè)計的大小一致(圖4)；切下目的條帶純化回收，將回收的DNA片段連接到pEASY-Blunt Cloning載體上，得到pEASY-Bna78RNAi中間質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗生素篩選獲得抗性菌落，對抗性菌落進行菌落PCR與質(zhì)粒酶切電泳分析后，再將正確的單克隆測序，干擾片段克隆的插入片段為129bp。通過序列比對，這兩個克隆片段與公布的甘藍(lán)型油菜基因組(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中對應(yīng)序列的一致性都為100％，目標(biāo)DNA片段克隆成功。

二、Bna78基因沉默質(zhì)粒的構(gòu)建

選擇測序正確的pEASY-Bna78RNAi重組質(zhì)粒，與pFGC5941-Napin質(zhì)粒分別同時用Fast Digest Enzyme NcoI和AscI對兩種質(zhì)粒酶切，酶切溫度37℃，酶切時間為30-40min，反應(yīng)體系40μL；酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的條帶，用膠回收試劑盒純化回收，將回收的兩個目標(biāo)DNA片段通過T4連接酶連接，連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm的條件下復(fù)蘇1h；將經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的細(xì)胞均勻涂于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)16h。挑取LB固體培養(yǎng)基上的單菌落，以NAPIN703F(SEQ ID No.5)與IntroR825：TGACTCCATCTTATTCCCTCCGTTTC(SEQ ID No.9)引物對進行菌落PCR鑒定，沒有片段插入式擴增產(chǎn)物約為820bp左右(載體，vector)，如果有129bp片段插入，PCR產(chǎn)物片段約為900bp左右，實際檢測結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致(圖5)，說明Bna78基因干擾質(zhì)粒構(gòu)建過程中，干擾片段正向插入到CHSA內(nèi)含子5’端的多克隆位點。

選擇帶有片段正向插入正確的單菌落，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以Fast Digest Enzyme BamHI和XbaI進行質(zhì)粒雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下目的條帶，用膠回收試劑盒純化回收，將回收的兩個目標(biāo)DNA片段通過T4連接酶連接，連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200rpm的條件下復(fù)蘇1h；將經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的細(xì)胞均勻涂于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固體培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)16h。挑取LB固體培養(yǎng)基上的單菌落，以Intron-B：5'-CACTCCAAAGAAAGAGAAACTGACA-3’(SEQ ID No.10)和PolyAR：5'-CTCAGGTTTTTTACAACGTGCACAA-3’(SEQ ID No.11)引物對進行菌落PCR鑒定，沒有片段插入式擴增產(chǎn)物約為400bp左右(載體，vector)，如果有129bp片段插入，PCR產(chǎn)物片段約為500bp左右，實際檢測結(jié)果與預(yù)期的片段大小一致(圖6)，說明Bna78基因干擾質(zhì)粒構(gòu)建過程中，干擾片段反向插入到CHSA內(nèi)含子3’端的多克隆位點。正反向干擾片段插入的干擾質(zhì)粒進一步進行BamHI與XbaI單酶切驗證，BamHI酶切后的目標(biāo)片段比XbaI單酶切的目標(biāo)片段相差250bp，電泳檢測結(jié)果說明兩個目標(biāo)片段與預(yù)期的片段大小一致(圖7)。根據(jù)PCR檢查和酶切檢測兩方面的結(jié)果，說明用于Bna78基因表達沉默的干擾質(zhì)粒pFGC5941-Napin-Bna78RNAi構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，用于甘藍(lán)型油菜的轉(zhuǎn)化。

實施例3

甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化及分子鑒定與轉(zhuǎn)基因油菜種子含油量分析

一、甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化及分子鑒定

一)外植體的準(zhǔn)備

選取甘藍(lán)型油菜品種“湘油15號”完整飽滿的種子約100顆，置于150mL三角瓶中。向裝有種子的三角瓶中加入20-30mL 75％乙醇。振蕩消毒30s，棄去酒精，再加入20mL 0.1％HgCl₂和1滴TWEEN-20的消毒液，劇烈搖晃至起泡，靜置20min。棄去消毒液，用無菌水反復(fù)沖洗3-5遍以洗凈泡沫。)加入50mL經(jīng)高溫滅菌的無菌水浸泡種子，浸泡時間為1h。倒掉無菌水，把種子均勻鋪在兩瓶種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，22℃暗培養(yǎng)4-5d。待油菜幼苗長到4-5cm后將其轉(zhuǎn)移到光照條件下生長6-8h，使幼苗子葉轉(zhuǎn)綠，子葉柄作為轉(zhuǎn)化的外植體。

二)農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

幼苗生長到1-2cm時，開始準(zhǔn)備菌液。將分別帶有pFGC5941-Napin-Bna78CDS和pFGC5941-Napin-Bna78RNAi質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌株在含卡那霉素(50mg/mL)、鏈霉素(50mg/mL)和利福平(100mg/mL)的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。挑取單菌落于10mL含有相同濃度的三種抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm擴大培養(yǎng)16-18h。吸取1mL菌液加入到50mL含有相同濃度抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀達到0.4-0.8。

三)子葉柄的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與抗性苗篩選

將油菜幼苗子葉柄從生長點以上的分支處切下，轉(zhuǎn)移到BM液中。將擴大后的農(nóng)桿菌菌液從三角瓶轉(zhuǎn)移至50mL離心管，6000rpm離心10min，倒掉上清。向離心管中加入25mL BM液，振蕩使農(nóng)桿菌重懸；再加入10μLβ-巰基乙醇和20μL乙酰丁香酮，搖勻后將工作液倒入已滅菌的平皿中。將切好的子葉柄轉(zhuǎn)到工作液中浸泡10min。浸泡后，將子葉柄轉(zhuǎn)移到已滅菌的吸水紙上。用鑷子翻動子葉柄使子葉柄表面殘留工作液被吸水紙吸干。最后將子葉柄均勻鋪放在共培培養(yǎng)基上，22℃，暗培養(yǎng)36h。共培完成后，將外植體轉(zhuǎn)移到MB篩選培養(yǎng)基中。22℃，長日照培養(yǎng)；每10-14d更換MB篩選培養(yǎng)基。

當(dāng)外植體分化出若干簇抗性不定芽后，將不定芽切開分離后放入生根篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。分化苗長出足夠的根系后，將其從生根培養(yǎng)基中取出，并用無菌水將根上殘留的培養(yǎng)基清洗干凈。然后將分化苗移入蛭石中，煉苗10天。煉苗之后轉(zhuǎn)入土壤中，Bna78基因過表達抗性苗獲得10株，Bna78基因沉默植株8株。抗性苗用于下一步PCR轉(zhuǎn)基因檢測鑒定。

四)抗性苗轉(zhuǎn)基因鑒定

用CTAB方法從抗性苗葉組織中提取總DNA，以總DNA作為模板，轉(zhuǎn)pFGC5941-Napin-Bna88CDS質(zhì)粒的抗性苗用NAPIN703F(SEQ ID No.5)和Bna78CDSR(SEQ ID No.6)引物對進行PCR檢測，檢測結(jié)果顯示與質(zhì)粒為陽性對照擴增片段大小一致的有7株，說明總共獲得了7株Bna78基因過表達轉(zhuǎn)基因植株(圖8中的2～8號)。轉(zhuǎn)pFGC5941-Napin-Bna88RNAi質(zhì)粒的抗性苗用NAPIN703F(SEQ ID No.5)和INTRON703R：5’-TGACTCCATCTTATTCCCTCCGTTTC-3’(SEQ ID No.12)引物對進行PCR檢測，檢測結(jié)果顯示與質(zhì)粒為陽性對照擴增片段大小一致的有1株，說明總共獲得了1株Bna78基因表達沉默的轉(zhuǎn)基因植株(圖9中的3號)。

二、轉(zhuǎn)基因油菜種子的含油量測定

一)種子油脂提取

收集Bna78基因過表達與沉默轉(zhuǎn)基因植株的種子，以及對照湘油15號的種子，各稱取樣品0.8g，放入研缽內(nèi)，液氮速凍并快速研磨，反復(fù)操作2-3次至樣品成粉末狀；將樣品粉末轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中再次稱重，保證各個樣品重量一致；將樣品放到波-伊勻漿器中，加入3.75mL甲醇:氯仿＝2:1的混合液，反復(fù)抽提研磨。將研磨后的勻漿轉(zhuǎn)移至10mL玻璃管中，并用1.25mL氯仿清洗勻漿器，并將洗液轉(zhuǎn)移至玻璃管中。向玻璃管中先后加入1mL 0.15M醋酸和1.25mL無菌水，漩渦振蕩30s使溶液充分混合，于3000rpm離心分離5min。將氯仿相(為綠色下層液，約2.5mL)轉(zhuǎn)移至新的玻璃管中，即為含種子油脂的樣品。

二)種子含油的薄層層析法(thin layer chromatography，TLC)檢測

向?qū)游龈字屑尤?00mL層析液：正己烷(Hexane):乙醚(diethyl ethyl ether,DEE):醋酸＝70:30:1。取5-10μL提取的種子油脂樣品用移液槍點在標(biāo)記好的硅膠層析板上。將層析版放入層析缸中，層析1-2h后將層析板取出，均勻噴灑20％磷鉬酸溶液，并放入120℃烘箱中10-15min進行顯色，冷卻后觀察斑點顏色深淺和斑點面積大小。結(jié)果顯示Bna78基因沉默的種子含油量高于對照湘油15號，而湘油15號的含油量高于Bna78基因過表達轉(zhuǎn)基因植株種子含油量(圖10)。

三)種子含油量的氣相色譜法(GC)檢測

向裝有1mL種子油脂樣品的玻璃管中加入1mL 0.4M氫氧化鉀-甲醇溶液，漩渦振蕩混勻。再加入2mL石油醚:乙醚＝1:1的混合液，混勻后室溫靜置4h以上，完成樣品油脂的甲酯化。甲酯化結(jié)束后，向玻璃管中加入10mL無菌水，1000rpm離心1min，使混合液分層。取1-2μL上層含有脂肪酸甲酯的液體進行氣相色譜測定。結(jié)果顯示Bna78基因沉默的種子含油量高于對照湘油15號，而湘油15號的含油量高于Bna78基因過表達轉(zhuǎn)基因植株種子含油量(圖11)。TLC與GC兩種方式測定結(jié)果都一致證實：Bna78基因具有改變種子含油量的功能。

在實際育種過程中，可通過轉(zhuǎn)基因的方法使得Bna78基因沉默或敲除，例如可以通過RNAi技術(shù)使得Bna78基因沉默，也可以通過定向敲除的方法去掉該Bna78基因?；蚴褂闷渌锢砘瘜W(xué)誘變方法(如射線或化學(xué)誘變)使得Bna78基因突變。以對照組基因的表達量為100％時，沉默的Bna78基因一般是指其表達量下降一倍或以上的情況，而過表達的Bna78基因一般是指其表達量為對照組的兩倍或以上。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110> 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種甘藍(lán)型油菜低分子量富含半胱氨酸蛋白及其編碼基因

<130> Q16F0930

<160> 12

<170> PatentIn version 3.2

<210> SEQ ID No:1

<211> 78

<212> 氨基酸

<400> 1

氨基酸序列：

MAKLSCSYFLILMFVFSVVLVAEGEDDENCIVFMDPKNPCNIVDCRQNCYEGYNGVGKCVKDVKAGGDTCLCT

YNWNC.

<210> SEQ ID No:2

<211> 237

<212> DNA

<400> 2

核苷酸序列：

ATGGCAAAACTATCATGTTCTTATTTCCTCATACTCATGTTTGTGTTCTCAGTGGTTCTAGTAGCTGAAGGAG

AAGATGATGAAAACTGTATTGTATTTATGGATCCAAAAAATCCATGTAATATTGTTGATTGTCGTCAAAACTG

CTATGAGGGATACAATGGAGTTGGAAAATGTGTTAAAGATGTTAAAGCTGGTGGAGATACTTGTCTTTGTACT

TATAATTGGAATTGTTGA；

<210> SEQ ID No.3

<211> 20

<212> DNA

<400> 3

5’－ATGGCgAAgCTATCATGTTC－3’；

<210> SEQ ID No.4

<211> 26

<212> DNA

<400> 4

5’－TCAACAATTCCAATTATAAGTACAAAG－3’；

<210> SEQ ID No.5

<211> 27

<212> DNA

<400> 5

NAPIN703F：5'-AACTCATCCGCTTCACTCTTTACTCAT-3'；

<210> SEQ ID No.6

<211> 32

<212> DNA

<400> 6

Bna78CDSR：5'-GCTCTAGAACAATTCCAATTATAAGTACAAAG-3'；

<210> SEQ ID No.7

<211> 34

<212> DNA

<400> 7

5'- TTAATTAACCATGGACTGTGTGTATGTATGGGCT-3'；

<210> SEQ ID No.8

<211> 36

<212> DNA

<400> 8

5'-TCTAGAGGCGCGCCCAGTTTTCATCATCTTCTCCTTC-3'；

<210> SEQ ID No.9

<211> 26

<212> DNA

<400> 9

IntroR825：TGACTCCATCTTATTCCCTCCGTTTC；

<210> SEQ ID No.10

<211> 25

<212> DNA

<400> 10

Intron-B：5'-CACTCCAAAGAAAGAGAAACTGACA-3’；

<210> SEQ ID No.11

<211> 25

<212> DNA

<400> 11

PolyAR：5'-CTCAGGTTTTTTACAACGTGCACAA-3’；

<210> SEQ ID No.12

<211> 26

<212> DNA

<400> 12

INTRON703R：5’-TGACTCCATCTTATTCCCTCCGTTTC-3’；