本發(fā)明涉及基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種篩選腎癌血清/血漿外泌體miRNA標(biāo)志物的方法及miRNA標(biāo)志物。

背景技術(shù)：

腎癌是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，全稱為腎細(xì)胞癌，又稱腎腺癌，簡(jiǎn)稱為腎癌。包括起源于泌尿小管不同部位的各種腎細(xì)胞癌亞型，但不包括來(lái)源于腎間質(zhì)的腫瘤和腎盂腫瘤。腎癌約占成人惡性腫瘤的2％～3％，占成人腎臟惡性腫瘤的80％～90％。世界范圍內(nèi)各國(guó)或各地區(qū)的發(fā)病率各不相同，總體上發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率高于發(fā)展中國(guó)家，城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)，男性多于女性，男女患者比例約為2∶1，發(fā)病年齡可見于各年齡段，高發(fā)年齡50～70歲。據(jù)全國(guó)腫瘤防治研究辦公室和衛(wèi)生部衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)信息中心統(tǒng)計(jì)我國(guó)試點(diǎn)市、縣腫瘤發(fā)病及死亡資料顯示我國(guó)腎癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，至2008年已經(jīng)成為我國(guó)男性惡性腫瘤發(fā)病率第10位。

外泌體是由細(xì)胞膜內(nèi)陷后通過一系列復(fù)雜的機(jī)制形成多囊泡小體(MVB)，然后MVB與細(xì)胞膜融合，釋放外泌體至細(xì)胞外。這些外泌體的大小為30-100nm，內(nèi)含蛋白質(zhì)、核酸以及脂類物質(zhì)，外泌體可以作為這些物質(zhì)的運(yùn)輸及存儲(chǔ)工具，存在于很多體液中，包括血液、尿液、唾液及腹水等，被靶細(xì)胞內(nèi)呑后其內(nèi)容物通過多種機(jī)制發(fā)揮功能。外泌體在腫瘤中具有強(qiáng)大的作用。外泌體是由脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)包裹而成的微囊泡，相對(duì)于游離的RNA而言，血液循環(huán)中存在于外泌體中的等功能性的RNA由于有了外泌體外衣的保護(hù)，可避免迅速被降解從而保持穩(wěn)定性，進(jìn)而更為有效地發(fā)揮遠(yuǎn)距離信號(hào)傳遞功能，為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供條件。

MicroRNA(miRNA)是最新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)約18-25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在進(jìn)化上高度保守，數(shù)量約占基因組的1％，現(xiàn)已普遍認(rèn)為miRNA與人類疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系，其發(fā)現(xiàn)為人們?cè)诨蛩秸J(rèn)識(shí)癌癥提供了新思路。MiRNA在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)：通過與其靶基因mRNA非完全互補(bǔ)或近似完全互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或抑制其翻譯。人類基因組約30％的基因受miRNA調(diào)控，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等多方面發(fā)揮著重要的生物調(diào)節(jié)作用。研究已證實(shí)miRNA的異常調(diào)控與腫瘤形成及進(jìn)展關(guān)系密切。MiRNA的靶基因多數(shù)是參與轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生等生物學(xué)效應(yīng)的基因。隨著miRNA與癌癥關(guān)系的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNA并不只是參與了癌癥形成的初期階段，還涉及到疾病病情變化、對(duì)藥物的敏感性、患者預(yù)后等等多方面。隨后基于miRNA的癌癥基因治療順勢(shì)登上舞臺(tái)，凸顯出很大的研究?jī)r(jià)值。

目前已有研究證實(shí)外泌體中存在多種的miRNAs，這些小分子RNAs性質(zhì)穩(wěn)定、含量豐富、易于定量檢測(cè)，且存在顯著的疾病特異性，有可能會(huì)成為一種潛在的早期診斷和監(jiān)測(cè)預(yù)后的新標(biāo)志。但是，由于外泌體miRNA的表達(dá)量較低，尋找一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便且成本低廉的檢測(cè)方法是目前外泌體miRNA在腫瘤臨床檢測(cè)中亟待解決的問題。然而，目前還沒有用于腎癌診斷的較為穩(wěn)定的生物標(biāo)志物的報(bào)道，若能篩選出腎癌異常表達(dá)的外泌體miRNAs作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對(duì)我國(guó)腎癌的診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動(dòng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于腎癌的診斷仍然需要組織學(xué)檢查，給患者造成痛苦并且不能及早診斷的缺陷，本發(fā)明提供了一種篩選腎癌外泌體miRNA標(biāo)志物的方法。基于這種方法，本發(fā)明提供了一種腎癌外泌體miRNA標(biāo)志物及其檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明提供的篩選腎癌外泌體miRNA標(biāo)志物的方法，包括以下步驟：

S1血漿外泌體分離后，外泌體的miRNA測(cè)序分析，具體分析包括序列比對(duì)、全基因組Reads分布圖譜，miRNA分類與注釋、miRNA表達(dá)量分析、新miRNA預(yù)測(cè)、樣品(組)間miRNA表達(dá)差異分析和聚類分析、差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)、差異miRNA靶基因的KEGG通路富集分析和GO功能富集分析，最后對(duì)樣品間相關(guān)性分析；篩選出綜合分析結(jié)果最優(yōu)的1種或多種miRNAs作為候選miRNAs；

S2高質(zhì)量提取不同級(jí)別腎癌血漿的外泌體總RNA，利用吉瑪公的Hairpin-itTM MicroRNA定量分析試劑盒定量檢測(cè)差異表達(dá)miRNA在血漿的表達(dá)量。篩選miR-424-5p跟腎癌病理分型密切相關(guān)。

S3根據(jù)miR-424-5p在腎癌患者血中的表達(dá)情況，采用卡方檢驗(yàn)方法分析miR-424-5p表達(dá)水平與腎癌患者各臨床指標(biāo)的相關(guān)性，包括年齡、腫瘤浸潤(rùn)深度、腫瘤大小、腫瘤分化、TNM分期、Fuhrman分級(jí)及患者生存率。采用單因素、多因素COX回歸分析法和Kaplan-Meier生存曲線檢驗(yàn)miRNA表達(dá)水平與患者生存率之間的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)分析由SPSS軟件完成。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P值小于0.05設(shè)為有顯著性差異。

本發(fā)明提供的一種腎癌血漿外泌體miRNA標(biāo)志物，其為miR-424-5p。

本發(fā)明的創(chuàng)新在于確定了血漿外泌體miRNA可作為診斷標(biāo)志物，而且是無(wú)創(chuàng)的，可以用于未來(lái)的臨床診斷。

本發(fā)明還提供了上述腎癌血漿外泌體miRNA標(biāo)志物在制備腎癌診斷試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種腎癌診斷試劑盒，其包括miR-424-5p檢測(cè)引物探針、PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑和PCR熒光定量試劑。探針序列的5’端需標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端需標(biāo)記淬滅基團(tuán)，以適合進(jìn)行TaqMan probe-based qRT-PCR方法檢測(cè)。

本發(fā)明提供的試劑盒，使腎癌的臨床診斷簡(jiǎn)便快捷、診斷結(jié)果可靠。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。實(shí)施例中未注明的條件和方法等均按照常規(guī)或者制造廠商所建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例1

篩選腎癌外泌體miRNA標(biāo)志物

(1)血漿的分離

EDTA管收集血液樣本：a)將全血靜置30min(全血離體后的總時(shí)間不得超過4h，且要4℃保存)；b)于4℃離心機(jī)中1600*g離心10min；c)離心后，取上層血漿于新的EP管中(不可取到中間層)，16000*g離心10min；d)離心后，取上層血漿于新的EP管中(不可取到下層白細(xì)胞)。

(2)血漿外泌體分離

分離到的血漿超高速離心法分離外泌體，透射電子顯微鏡觀察所獲外泌體的形態(tài)；主要方法：100,000g離心2h，棄上清，1×PBS重懸，4℃，100,000g離心2h，棄上清，100μl 1×PBS重懸，取適量用于透射電鏡檢測(cè)外泌體形態(tài)，剩余用于RNA提取。

(3)外泌體的miRNA測(cè)序分析

a)取上述離心得到的外泌體，各加1ml TRizol，反復(fù)吹打數(shù)次移至新的EP管，做好標(biāo)記，24小時(shí)內(nèi)干冰條件下運(yùn)輸至測(cè)序公司；b)樣品RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)由測(cè)序公司進(jìn)行；c)樣品質(zhì)檢合格后，利用測(cè)序建庫(kù)用的試劑盒構(gòu)建外泌體小RNA測(cè)序文庫(kù)，基于illumina技術(shù)測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行單端測(cè)序，獲得滿測(cè)序數(shù)據(jù)。d)測(cè)序完成，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，具體分析包括序列比對(duì)、全基因組Reads分布圖譜，miRNA分類與注釋、miRNA表達(dá)量分析、新miRNA預(yù)測(cè)、樣品(組)間miRNA表達(dá)差異分析和聚類分析、差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)、差異miRNA靶基因的KEGG通路富集分析和GO功能富集分析，最后對(duì)樣品間相關(guān)性分析。

(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR

高質(zhì)量提取不同級(jí)別腎癌血漿的外泌體總RNA，利用吉瑪公的Hairpin-itTM MicroRNA定量分析試劑盒定量檢測(cè)差異表達(dá)miRNA在血漿的表達(dá)量。按照試劑盒說(shuō)明書來(lái)操作，以管家基因小RNA U6為內(nèi)參，用ΔΔCT法來(lái)計(jì)算和分析。在46例腎癌患者中發(fā)現(xiàn)，miR-424-5p在腎癌患者血漿中的表達(dá)miR-424-5p表達(dá)越高，腫瘤惡性程度越高。

實(shí)施例2

人腎癌診斷用試劑盒

上述實(shí)施例表明，miR-424-5p對(duì)腎癌檢測(cè)具有非常高的靈敏度和特異性，因此，可基于miR-424-5p制作用于人腎癌診斷用的試劑盒。該試劑盒包括miR-424-5p引物、探針；引物具體包括反轉(zhuǎn)錄引物、定量PCR前引物和定量PCR后引物。當(dāng)然，該試劑盒中還應(yīng)該包括逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs、MgCl2、DEPC水、Taq酶以及標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰７磻?yīng)體系包括：0.25uL 20*miRNA檢測(cè)探針、2.5uL 2*Master Mix、1.25uL雙蒸水、1uL稀釋后的cDNA,共5uL,每個(gè)miRNA檢測(cè)實(shí)施3平行。使用ABI Prism 7500熒光定量PCR儀檢測(cè)，其反應(yīng)條件：95°C10分鐘、95°C15秒、60°C1分鐘，以上階段進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

進(jìn)一步地，miR-424-5p的序列為cagcagcaauucauguuuugaa。

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。