本發(fā)明屬于抗原表達(dá)檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及一種檢測腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原表達(dá)的方法。
背景技術(shù)：
：近年的研究發(fā)現(xiàn)各種腫瘤的微環(huán)境，尤其是實體腫瘤，對機體抗腫瘤免疫反應(yīng)有著極強的抑制作用。這些抑制機制主要有以下幾個方面：第一，腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的PD-L1/PD-L2傳遞抑制性信號到T淋巴細(xì)胞表面的PD-1。由于PD-1是一個抑制性受體，T淋巴細(xì)胞對瘤細(xì)胞的殺傷功能受到抑制。一年來，美國FDA連續(xù)批準(zhǔn)了抗PD-1抗體治療肺癌，腎癌，及抗PD-L1抗體治療晚期膀胱癌，表明阻斷腫瘤微環(huán)境對腫瘤免疫反應(yīng)的抑制是非常有效的治療手段。第二，腫瘤中侵潤的抑制性細(xì)胞亞群，調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)。Treg可以直接抑制抗腫瘤的效應(yīng)T細(xì)胞，而近年的研究發(fā)現(xiàn)低劑量的環(huán)磷酰胺可以有效的清除體內(nèi)的Treg，增強抗腫瘤特異免疫反應(yīng)。第三，腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的一些抑制性酶，包括環(huán)氧化酶cyclooxygenases(Cox1/Cox2/PGE2)，和吲哚胺2，3-雙加氧酶IDO-1/IDO-2/TDO-1。這些抑制性酶對機體的抗腫瘤反應(yīng)都有極強的抑制作用。針對這些抑制性酶，現(xiàn)有的藥物如阿司匹林可以很好的抑制環(huán)氧化酶1和2的活性，預(yù)防腸癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)。西樂葆抑制環(huán)氧化酶2的活性，在臨床中與其他藥物合用治療腫瘤。需要強調(diào)的是來自不同患者的腫瘤具有非常不同的腫瘤微環(huán)境和不同的免疫抑制機制。因此，要想取得有效的治療效果，必須對每一個患者的腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制機制進(jìn)行分析才能設(shè)計具有針對性的治療方案。腫瘤的免疫治療需要采用綜合手段，而現(xiàn)有技術(shù)中的免疫治療通常只檢測少數(shù)幾種腫瘤相關(guān)的抗原，無法對整個的腫瘤微環(huán)境進(jìn)行全面、透徹的分析，從這樣的檢測結(jié)果出發(fā)，也很難找到針對性的治療方案。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對相關(guān)技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種檢測腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原表達(dá)的方法，能夠針對腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)的多種抗原，檢測結(jié)果可以成為治療腫瘤可靠的參考，可供醫(yī)生結(jié)合自身的治療經(jīng)驗為患者找到更加個體化的治療方案來進(jìn)行免疫干預(yù)。為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：一種檢測腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原表達(dá)的方法，包括以下步驟：步驟一：從實體瘤組織樣品中提取樣品RNA；步驟二：檢驗樣品RNA；步驟三：以提取的檢驗合格的樣品RNA為模板，oligodT為引物進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄得到組織樣品cDNA；步驟四：設(shè)計qPCR檢測引物，通過qPCR擴增各組織樣品，采集熒光信號；其中，設(shè)計用于qPCR擴增檢測引物序列為以下9組：GAPDHF：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG；GAPDHR：GTGATGGCATGGACTGTGGT；COX1F：GGAGTTTGTCAATGCCACCT；COX1R：GCAACTGCTTCTTCCCTTTG；COX2F：ATGGAATTACCCAGTTTGTTGAATC；COX2R：TGGAAGCCTGTGATACTTTCTGTACT；PDL1F：GTGCATGATCAGCTATGGTGGTG；PDL1R：CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA；PDL2F：CTGGAATTGCAGCTTCACCAGA；PDL2R：GTTGCATTCCAGGGTCACATTG；IDO1F：AAAGGGGACCCGAGCAATG；IDO1R：CTTCCTGGTGATAGCGGTTCG；TDOF：GGGAACTACCTGCATTTGGA；TDOR：GTGCATCCGAGAAACAACCT；FOXP3F：TGACCAAGGCTTCATCTGTG；FOXP3R：AGGAACTCTGGGAATGTGCT；PGE2F：GTACTGGCTTCGTACGCGCG；PGE2R：TAGCGCTCCAGGGCCATGGC。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種用于步驟三的組織樣品cDNA獲得反應(yīng)體系，共20ul，包括10XRTBuffer，2.0ul；25XdNTPMix，0.8ul；10Xoligo(dT)，2.0ul；逆轉(zhuǎn)錄酶，1.0ul；RNA酶抑制劑，1.0ul；樣品RNA，1ug；其余部分為無核酸純水；組織樣品cDNA獲得反應(yīng)條件為25℃，10min；37℃，120min；85℃，5min；得到組織樣品cDNA后在4℃下保存。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種用于步驟四的qPCR檢測反應(yīng)體系，共15ul，包括組織樣品cDNA，2μl；正向引物，0.5ul；反向引物，0.5ul；2XTransStart@TopGreenqPCRSuperMix，7.5μl；雙蒸水，4.5ul；qPCR檢測反應(yīng)條件為94℃，30s；94℃，5s；58℃，15s；72℃，10s；共40個循環(huán)。本發(fā)明的有益效果：發(fā)明人選取了多種腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原，并相應(yīng)設(shè)計了對應(yīng)的多種抗原引物，通過當(dāng)前主流的基因表達(dá)分析方法，熒光定量PCR法特異性的檢測抗原在組織樣品的表達(dá)情況，通過本方法，得到腫瘤患者的微環(huán)境相關(guān)的多種抗原表達(dá)值，當(dāng)醫(yī)生為患者提供具有針對性的治療方案時，該表達(dá)值具很強的參考性。附圖說明圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例所述的一種檢測腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原表達(dá)的方法得出的BT048病人的微環(huán)境相關(guān)抗原表達(dá)值的柱形圖。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，該具體實施方式應(yīng)理解為是為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不用以限制本發(fā)明。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料如無特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。實施例一：從實體瘤組織樣品中提取樣品RNA1.1組織樣品的選取和制備：手術(shù)切下的腫瘤組織及用作陰性對照的良性腫瘤組織，切除邊緣，選取中間完好的組織塊在最短的時間內(nèi)放置于RNAlater中在-80℃下保存，防止RNA降解；其中，RNAlater是一種液態(tài)的，無毒的組織保存試劑。它能迅速穩(wěn)定組織，保護(hù)非冷凍細(xì)胞RNA于原位。獲得組織塊后，迅速浸泡在RNAlater中保存，而不會引起RNA的降解，這樣可以不必馬上處理樣品或?qū)悠防鋬鲈谝旱幸詡湟院筇幚?，屬于本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可從商業(yè)途徑獲得。1.2取30mgRNAlater保存樣品，加1mlTRIzol，充分研磨，使組織塊充分裂解，按200μl/mlTRIzol的比例加入氯仿，充分震蕩混勻，4℃，12000rpm離心15min；其中，TRIzol是一種總RNA抽提試劑，可以直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA，屬于本領(lǐng)域常規(guī)試劑，可從商業(yè)途徑獲得。1.3小心吸取上層水相于另一新的EP管中，加入等體積異丙醇，沉淀RNA，4℃，12000rpm離心10min，收集沉淀的RNA；1.4用75％乙醇洗滌沉淀得到的RNA，4℃，12000rpm離心10min；1.5重復(fù)1.4步驟；1.6棄掉乙醇，待乙醇揮發(fā)殆盡，適量DEPC水溶解組織樣品RNA；其中DEPC水是用DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓滅菌的純水，不含雜質(zhì)RNA、DNA和蛋白質(zhì)，通過本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段可得到。實施例二：檢驗樣品RNA用超微量分光光度計準(zhǔn)確測得組織樣品RNA濃度，其中，在本實施例中所用的超微量分光光度計型號為Nanodrop2000。用生物分析儀對RNA進(jìn)行質(zhì)量分析，其中，在本實施例中所使用的生物分析儀型號為安捷倫2100，OD值在1.8～2.0之間且RIN值＞6的RNA樣品符合抗原表達(dá)譜檢測標(biāo)準(zhǔn)，為質(zhì)量合格的RNA樣品，采用其進(jìn)行下一步實驗。實施例三：以提取的檢驗合格的樣品RNA為模板，oligodT為引物進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄得到組織樣品cDNA在冰上配置好如表1所示的cDNA獲得反應(yīng)體系，輕柔混勻反應(yīng)體系，離心機短暫離心，再進(jìn)行表2所示程序，獲得模板cDNA。表1.cDNA獲得反應(yīng)體系組分體積10XRTBuffer(緩沖液)2.0ul25XdNTPMix0.8ul10Xoligo(dT)2.0ulReverseTranscriptase(逆轉(zhuǎn)錄酶)1.0ulRNaseInhibitor(RNA酶抑制劑)1.0ul樣品RNA1ugNuclease-freeH2O(無核酸純水)至20ul表2.cDNA獲得反應(yīng)程序步驟1步驟2步驟3步驟4溫度25℃37℃85℃4℃時間10min120min5min∞實施例四：設(shè)計qPCR檢測引物，通過qPCR擴增各組織樣品cDNA，采集熒光信號4.1選用特異性膠質(zhì)瘤相關(guān)抗原基因，設(shè)計對應(yīng)引物，進(jìn)行qPCR擴增，用以檢測抗原表達(dá)水平，采用人內(nèi)參基因(GAPDH)進(jìn)行qPCR擴增各組織樣品作為對照，以確保RNA的提取質(zhì)量及獲得的cDNA質(zhì)量。根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)知識可知，GAPDH是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的縮寫，這個酶的基因是看家基因，也就是在機體各組織中的表達(dá)都趨于穩(wěn)定和接近，可以作為RT-PCR的內(nèi)參，也就是衡量模板取樣量的一個參照物。申請人利用Primer5、DNAMAN、DNAStar、NCBI等序列分析軟件設(shè)計了8種腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原引物，抗原包括COX1、COX2、PDL1、PDL2、IDO1、TDO、FOXP3、PGE2。表3qPCR檢測引物4.2按照SYBRselectmasterMix試劑盒說明書嚴(yán)格在冰上配置好qPCR體系，體系如表4；輕柔混勻以上反應(yīng)體系，并利用離心機短暫離心，按照表5程序進(jìn)行qPCR擴增，采集熒光信號。其中，SYBRselectmasterMix試劑盒是用于實時熒光定量PCR的試劑盒，可從商業(yè)途徑獲得；TransStart@TopGreenqPCRSuperMix是用于實時熒光定量PCR的試劑，可從商業(yè)途徑獲得。表4.qPCR反應(yīng)體系表5.qPCR反應(yīng)程序?qū)嵤├澹簲?shù)據(jù)分析本申請使用目前主流的RNA提取法-TRIzol法對組織樣品的RNA進(jìn)行提取，用通過對RNA進(jìn)行質(zhì)量分析，利用檢驗合格的RNA樣品以當(dāng)前主流的基因表達(dá)分析方法-熒光定量PCR法檢測了8個常見的腫微環(huán)境瘤抗原相對癌旁正常組織的相當(dāng)表達(dá)水平。腫瘤抗原表達(dá)分析使用2-ΔΔCT法.表達(dá)倍數(shù)差異＝2-ΔΔCT。ΔΔCT＝[(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)腫瘤樣品-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)癌旁樣品].每個樣品投入的起始模板量使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)進(jìn)行均一化。對于沒有檢測到的腫瘤抗原，以CT為40來計算表達(dá)差異。申請人通過上述具體實施例一至四所描述的具體步驟檢測了在一例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(臨床編號BT048)腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原的擴增Ct值及對于正常腦組織(N)的表達(dá)值，即Cq值，并用實施例五中所述的數(shù)據(jù)分析方法對檢測結(jié)果進(jìn)行了分析，得出的結(jié)果分別用表6及圖1進(jìn)行表示。其中，表達(dá)倍數(shù)差異最高的抗原為COXl，為環(huán)氧化酶，是腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的一種抑制性酶，對機體的抗腫瘤反應(yīng)都有極強的抑制作用?，F(xiàn)有的藥物如阿司匹林可以很好的抑制COX1的活性，預(yù)防腸癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)。由于來自不同患者的腫瘤具有非常不同的腫瘤微環(huán)境和不同的免疫抑制機制。因此，要想取得有效的治療效果，必須對每一個患者的腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制機制進(jìn)行分析才能設(shè)計具有針對性的治療方案。醫(yī)生可以通過本發(fā)明所述的方法，以病人腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原表達(dá)情況的匯總為基礎(chǔ)進(jìn)行分析，從而找出最適合病人的用藥方式和治療方法。表6.BT048病人腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原表達(dá)情況匯總序列表<110>暨南大學(xué)<120>一種檢測腫瘤微環(huán)境相關(guān)抗原表達(dá)的方法<160>18<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>GAPDH正向引物<400>AGGTCGGAGTCAACGGATTTG21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>GAPDH反向引物<400>GTGATGGCATGGACTGTGGT20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>COX1正向引物<400>GGAGTTTGTCAATGCCACCT20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>COX1反向引物<400>GCAACTGCTTCTTCCCTTTG20<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>COX2正向引物<400>ATGGAATTACCCAGTTTGTTGAATC25<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<223>COX2反向引物<400>TGGAAGCCTGTGATACTTTCTGTACT26<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>PDL1正向引物<400>GTGCATGATCAGCTATGGTGGTG23<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>PDL1反向引物<400>CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA25<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>PDL2正向引物<400>CTGGAATTGCAGCTTCACCAGA22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>PDL2反向引物<400>GTTGCATTCCAGGGTCACATTG22<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>IDO1正向引物<400>AAAGGGGACCCGAGCAATG19<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>IDO1反向引物<400>CTTCCTGGTGATAGCGGTTCG21<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>TDO正向引物<400>GGGAACTACCTGCATTTGGA<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>TDO反向引物<400>GTGCATCCGAGAAACAACCT20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>FOXP3正向引物<400>TGACCAAGGCTTCATCTGTG20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>FOXP3反向引物<400>AGGAACTCTGGGAATGTGCT<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>PGE2正向引物<400>GTACTGGCTTCGTACGCGCG20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>PGE2反向引物<400>TAGCGCTCCAGGGCCATGGC20當(dāng)前第1頁1 2 3