本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及氮雜環(huán)類化合物及其應(yīng)用，尤其是具有NS3絲氨酸蛋白酶抑制活性的氮雜環(huán)類化合物及其制備預(yù)防和/或治療病毒感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球大約有1.3-1.7億人感染丙型肝炎病毒，大約是感染艾滋病毒人數(shù)的2倍。丙型肝炎病毒(HCV)感染可致嚴(yán)重的如肝硬化、肝癌等晚期肝病，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，丙型肝炎病毒感染率較高的地區(qū)為在非洲及中東地區(qū)。
HCV隸屬于黃病毒(Flaviviridea)科，為單股正鏈RNA病毒，在核衣殼外包繞含脂質(zhì)的囊膜，囊膜上有刺突。HCV的基因組長9500-10000bp，在5'非編碼區(qū)的下游緊接一開放的閱讀框(open reading frame，ORF)，其基因組排列順序?yàn)?'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能編碼約3010-3033個(gè)氨基酸的多聚蛋白前體，后者可經(jīng)宿主細(xì)胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10種病毒蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中，結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的組裝，而非結(jié)構(gòu)蛋白包括NS2，NS3,NS4A，NS5A和NS5B，非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)比病毒的生活周期非常重要，是病毒基因復(fù)制、表達(dá)的核心催化區(qū)域。NS3蛋白還具有螺旋酶活性，參與解旋HCV-RNA分子，以協(xié)助RNA復(fù)制；NS4的功能尚不清楚；NS5A是一種磷酸蛋白，可以與多種宿主細(xì)胞蛋白相互作用，對(duì)于病毒的復(fù)制起重要作用；而NS5B則具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，參與HCV基因組復(fù)制。NS2/NS3形成的連接由NS3的N末端180個(gè)氨基酸與NS2的含Zn2+的金屬蛋白酶催化裂解；NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5A和NS5A/NS5B形成的連接由位于NS3的N末端的絲氨酸蛋白酶催化裂解。
NS3絲氨酸蛋白酶是HCV復(fù)制周期中的重要蛋白。研究表明，抑制NS3絲氨酸蛋白酶活性可以有效地抑制病毒的增殖與復(fù)制，因此，NS3絲氨酸蛋白酶成為了抗丙型肝炎病毒藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。為了更好的滿足市場需求，本發(fā)明提供了一類新型的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供一種氮雜環(huán)類化合物，以開發(fā)成為一種新型的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑，應(yīng)用于因丙型肝炎病毒、登革熱病毒或西尼羅河病毒等病毒感染引起的相關(guān)疾病治療的領(lǐng)域中。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供了一種式(Ⅰ)所示的化合物：
或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、活性代謝物及代謝物的藥學(xué)上可接受的鹽及其混合物形式；
其中，為各自獨(dú)立的單鍵或雙鍵；
R1和R2獨(dú)立地選自芳基、取代芳基、雜芳基或取代雜芳基；
R3選自R5、-C(O)-R5、-S(O)-R5或-S(O)2-R5；
R4選自氫原子、鹵素、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、氧代、芳基、雜芳基、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基；
n為0或1；
R5為芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基。
優(yōu)選的，所述的化合物其具有如式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示結(jié)構(gòu)：
其中，R1和R2獨(dú)立地選自芳基、取代芳基、雜芳基或取代雜芳基；
R3選自R5、-C(O)-R5、-S(O)-R5或-S(O)2-R5；
R4選自氫原子、鹵素、硝基、氰基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、氧代、芳基、雜芳基、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基；
R5為芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、雜烷基或雜環(huán)烷基。
優(yōu)選的，所述芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、雜烷基、或雜環(huán)烷基中的一個(gè)或多個(gè)氫原子各自獨(dú)立被鹵素、硝基、氰基、氧代、氧代、烷基、雜烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、鏈炔基、鹵代烯基、鹵代炔基、鹵代烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烯基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、環(huán)烷基雜烷基、雜環(huán)烷基雜烷基、芳基雜烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧烷基、烷氧芳基、烯氧基、炔氧基、環(huán)烷氧基、雜環(huán)烷氧基、芳氧基、雜芳氧基、芳烷氧基、羧基、?；⒒酋；?、氨基、-C(O)OR6、-OC(O)R6、-COR6、-NHS(O)mR6、-NHC(O)R6、-NHC(O)OR6、-NR7R8、-OC(O)NR7R8、-OC(O)R7R8、-SH、-SR7所取代；
R6選自任選取代芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基；
R7和R8各自獨(dú)立地選自氫原子，任選取代芳基、雜芳基、烯基、炔基、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、雜烷基、雜環(huán)烷基；
m為0、1或2。
優(yōu)選的，R1為1-2個(gè)氫原子被包含羥基、鹵素中的一種或多種基團(tuán)所取代的芳基；
R2為0-1個(gè)氫原子被包含鹵素、烷基中的一種基團(tuán)所取代的芳基或雜芳基；
R3為R5、-C(O)-R5、-S(O)-R5和-S(O)2-R5中的一種；
R4為0-1個(gè)氫原子被包含鹵素、烷基中的一種基團(tuán)所取代的氨基、烷基或芳基；
R5為0-1個(gè)氫原子被包含羥基、硝基、鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基、芳基和-NR6R7中的一種基團(tuán)所取代的芳基或雜芳基；
R6、R7為氫原子或烷基；R6和R7為獨(dú)立取代或連接成環(huán)。
進(jìn)一步優(yōu)選的，R1選自
優(yōu)選的，R2選自
優(yōu)選的，R3選自
優(yōu)選的，R4為
或-NH2。
優(yōu)選的所述的化合物具有以下其中之一的結(jié)構(gòu)：
或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、活性代謝物及代謝物的藥學(xué)上可接受的鹽及其混合物。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含上述的化合物。
進(jìn)一步優(yōu)選的，所述藥物組合物還包括抑制病毒增殖與復(fù)制的藥物和/或藥學(xué)上可接受的輔料。
本發(fā)明還提供了所述化合物或所述的藥物組合物在制備預(yù)防和/或治療病毒感染疾病中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述病毒為黃病毒屬相關(guān)病毒。
進(jìn)一步，優(yōu)選的，所述病毒為丙型肝炎病毒、登革熱病毒和/或西尼羅河病毒。
上述氮雜環(huán)類化合物的各種異構(gòu)體包括但不限于內(nèi)消旋體、外消旋體、立體異構(gòu)體、順反異構(gòu)體和/或互變異構(gòu)體。
本發(fā)明提供的氮雜環(huán)類化合物是一類新型的具有NS3絲氨酸蛋白酶抑制活性的化合物，制備過程操作簡單安全；經(jīng)過抗病毒活性實(shí)驗(yàn)測定，表明該類化合物具有良好的NS3絲氨酸蛋白酶抑制活性，具有開發(fā)成為一種新型的NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑的潛力，可應(yīng)用于預(yù)防和治療因丙型肝炎病毒、登革熱病毒或西尼羅河病毒等黃病毒屬病毒感染引起的相關(guān)疾病。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例只是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護(hù)的范圍中。
本發(fā)明所使用的術(shù)語“任選取代的”與“取代或非取代的”這個(gè)術(shù)語可以交換使用。一般而言，術(shù)語“任選地”不論是否位于術(shù)語“取代的”之前，表示所給結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或多個(gè)氫原子被具體取代基所取代。除非其他方面表明，一個(gè)任選的取代基團(tuán)可以有一個(gè)取代基在基團(tuán)各個(gè)可取代的位置進(jìn)行取代。當(dāng)所給出的結(jié)構(gòu)式中不只一個(gè)位置能被選自具體基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各個(gè)位置取代。其中所述的取代基可以是，但并不限于，羥基，氨基，鹵素，氰基，芳基，雜芳基，烷氧基，烷基，烯基，炔基，雜環(huán)基，巰基，硝基，芳氧基等等。
本發(fā)明使用的術(shù)語“烷基”或“烷基基團(tuán)”，表示含1-20個(gè)碳原子的飽和直鏈或支鏈一價(jià)碳?xì)浠衔镌訄F(tuán)。其中所述烷基基團(tuán)可以獨(dú)立任選地被一個(gè)或多個(gè)取代基所取代。除非另外詳細(xì)說明，烷基基團(tuán)含有1-20個(gè)碳原子，其中一些實(shí)施例是，烷基基團(tuán)含有1-10個(gè)碳原子，另外一些實(shí)施例是，烷基基團(tuán)含有1-8個(gè)碳原子，另外一些實(shí)施例是，烷基基團(tuán)含有1-6個(gè)碳原子，另外一些實(shí)施例是，烷基基團(tuán)含有1-4個(gè)碳原子，另外一些實(shí)施例是，烷基基團(tuán)含有1-3個(gè)碳原子。
烷基基團(tuán)的實(shí)例包含，但并不限于，甲基(Me，-CH3)，乙基(Et，-CH2CH3)，正丙基(n-Pr，-CH2CH2CH3)，異丙基(i-Pr，-CH(CH3)2)，正丁基(n-Bu，-CH2CH2CH2CH3)，異丁基(i-Bu，-CH2CH(CH3)2)，仲丁基(s-Bu，-CH(CH3)CH2CH3)，叔丁基(t-Bu，-C(CH3)3)，正戊基(-CH2CH2CH2CH2CH3)，2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)，3-戊基(-CH(CH2CH3)2)，2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)，3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)，3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)，2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)，正己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)，2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)，3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))，2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)，3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)，4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)，3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)，2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)，2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)，3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3)，正庚基，正辛基，等等。
本發(fā)明所使用的術(shù)語“烷基”和其前綴“烷”，都包含直鏈和支鏈的飽和碳鏈。
本發(fā)明涉及的氮雜環(huán)類化合物，其藥學(xué)上可接受的鹽，及其藥物制劑，對(duì)NS3絲氨酸蛋白酶，尤其是NS3絲氨酸蛋白酶調(diào)節(jié)的疾病或病癥的治療有潛在的用途。特別是，本發(fā)明涉及一種如式(I)所示的化合物：
或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體、藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、活性代謝物及代謝物的藥學(xué)上可接受的鹽及其混合物形式。
在一些實(shí)施方案，R1選自
在一些實(shí)施方案，R2選自
在一些實(shí)施方案，R3選自
在一些實(shí)施方案，R4為
或-NH2。
在另外一些實(shí)施方案，本發(fā)明涉及到以下其中之一的化合物或其立體異構(gòu)體，幾何異構(gòu)體，互變異構(gòu)體，氮氧化物，水合物，溶劑化物，代謝產(chǎn)物，藥學(xué)上可接受的鹽或它的前藥，但絕不限于這些化合物：
本發(fā)明的藥物組合物的包括式((I)的化合物，優(yōu)選為實(shí)施例1-4的化合物，尤其是本發(fā)明所列出的化合物。
像本發(fā)明所描述的，本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的輔料。這些像本發(fā)明所應(yīng)用的，包括任何溶劑，稀釋劑，或其他液體賦形劑，分散劑或懸浮劑，表面活性劑，等滲劑，增稠劑，乳化劑，防腐劑，固體粘合劑或潤滑劑，等等。
本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含抑制病毒增殖與復(fù)制的藥物。所述抑制病毒增殖與復(fù)制的藥物可以與本發(fā)明的化合物分開給藥，作為多給藥方案的一部分?；蛘呤菃蝿┬偷囊徊糠?，與本發(fā)明的化合物混合在一起形成單個(gè)組合物。
本發(fā)明的組合物可以是口服給藥，注射給藥，噴霧吸入法，局部給藥，經(jīng)直腸給藥，經(jīng)鼻給藥，含服給藥，陰道給藥或通過植入性藥盒給藥。
其中口服給藥可以是以任何可接受的口服劑型進(jìn)行口服給藥，包括但并不限于，膠囊，片劑，水制懸浮液或溶液。
本發(fā)明的化合物將應(yīng)用于病毒感染疾病預(yù)防和/或治療，進(jìn)一步包括但并不限于，丙型肝炎病毒、登革熱病毒和/或西尼羅河病毒的病毒感染疾病。
在下列實(shí)施例中，除非另有指明外，所有溫度單位為攝氏度。使用的各種起始原料和試劑均來自市售，除非另有指明，市售原料和試劑均不經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用；玻璃器皿用烘箱干燥和/或加熱干燥。薄層層析用硅膠板規(guī)格為0.15-0.2mm，柱層析用硅膠的規(guī)格為200-300目；質(zhì)譜是用MS儀測定得到，離子化方式可為ESI或APCI。
一般地，本發(fā)明的化合物可以通過本發(fā)明所描述的方法制備得到，除非有進(jìn)一步的說明，其中取代基的定義如式(I)所示。下面的反應(yīng)方案和實(shí)施例用于進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明的內(nèi)容。下面的部分實(shí)施例僅僅是用來說明具體化合物的合成方法。但在合成方法上并沒有任何限制。在實(shí)施例中未列出的化合物，也可以用與下面同樣的合成路線與合成方法，選擇適當(dāng)?shù)钠鹗荚希谟斜匾牡胤缴约舆m當(dāng)?shù)某ＷR(shí)性的反應(yīng)條件調(diào)整即可制備。
實(shí)施例1
合成路線：
第一步：中間體1c的合成
往250mL的圓底燒瓶中加入化合物1a(6g，0.0441mol)、化合物1b(4.85g，0.0441mol)、30％(mg/vol)氫氧化鈉乙醇溶液100mL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h；反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液倒入冰水中，用鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2-3，過濾，收集固體；將固體溶于二氯甲烷中，依次用飽和碳酸鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，然后加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，過濾，濾液減壓濃縮，再用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到7.6g化合物1c。
1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ12.7(1H,s),8.02(1H,d),7.72(1H,d),7.34(1H,m),7.25(1H,m),7.13(1H,m),7.02(1H,dd),7.31(1H,t),6.92(1H,m),6.74(1H,t)。
第二步：中間體1d的合成
往250mL的圓底燒瓶中加入化合物1c(7.5g，0.035mol)、乙醇溶液50mL、水合肼(2.19g，0.035mol)，80℃攪拌反應(yīng)3h；反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液置于4℃冰箱過夜；過濾，加入200mL乙醇/正己烷(3:1)重結(jié)晶，得到5.9g化合物1d。
第三步：產(chǎn)物NI-H-00023的合成
往50mL的圓底燒瓶中加入化合物1d(200mg，0.877mol)、四氫呋喃5mL、化合物1f(182mg，0.877mol)和DIEA(169mg，1.31mmol)，室溫下反應(yīng)2h；反應(yīng)完畢后，于反應(yīng)液中加入30mL水和30mL乙酸乙酯，混勻，靜置分層，分離有機(jī)層，收集水層并加入乙酸乙酯萃取(2次，每次30mL)，合并有機(jī)層，濃縮蒸餾；再用制備薄層板進(jìn)行刮板，得到化合物1。1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm):δ9.85(s,1H),7.90(d,2H),7.72(d,2H),7.41–7.21(m,2H),7.05–6.86(m,3H),6.61-6.60(dd,1H),6.02-5.98(dd,1H),3.89-3.81(m,1H),3.56-3.50(m,1H),2.43(s,3H).
實(shí)施例2
按照實(shí)施例1所述方法合成下述吡唑類化合物，如表1所示。
表1合成的具有NS3蛋白酶抑制活性的吡唑類化合物
實(shí)施例3
合成路線：
第一步：中間體2c的合成
往250mL的圓底燒瓶中加入化合物2a(3g，0.0195mol)、化合物2b(2.42g，0.0195mol)、30％(mg/vol)氫氧化鈉乙醇溶液50mL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h；反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液倒入冰水中，用鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2-3，過濾，收集固體；將固體復(fù)溶于二氯甲烷中，依次用飽和碳酸鈉水溶液、飽和食鹽水洗滌，然后加入無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，過濾，濾液減壓濃縮，再用乙醇進(jìn)行重結(jié)晶，得到4.3g化合物2c。
第二步：產(chǎn)物NI-H-00207的合成
往100mL的圓底燒瓶中加入鹽酸苯甲脒(60mg，0.385mmol)、碳酸鉀(112mg，0.809mmol)和乙醇溶液30mL；于上述反應(yīng)液中緩慢滴加化合物2c(200mg，0.769mmol)的乙醇溶液15mL，90℃反應(yīng)過夜；待反應(yīng)液溫度降到室溫后，過濾，收集固體，再用水和乙醇洗滌，即得103mg化合物2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.56(s,1H),8.28-8.25(m,2H),8.05(s,1H),7.94(d,2H),7.75-7.71(m,2H),7.35(d,2H),7.51-7.48(m,1H),7.37(s,1H)7.08-7.06(m,1H),6.96(m,1H)。
實(shí)施例4
按照實(shí)施例3所述方法合成下述嘧啶類化合物，如表2所示。
表2合成的具有NS3蛋白酶抑制活性的嘧啶類化合物
實(shí)施例5 NS3絲氨酸蛋白酶抑制活性實(shí)驗(yàn)
1、配制反應(yīng)緩沖液，反應(yīng)緩沖液成分為：HEPES 50mM,NaCl 150mM,甘油15％,Triton X-100 0.15％,DTT 10mM,PEG8000 0.1％,pH 7.5。
2、用DMSO將受試化合物稀釋成10μM或100μM。
3、然后在96孔板中加入NS3絲氨酸蛋白酶、緩沖液和上述配置好的受試化合物，使反應(yīng)終體積為100uL?；靹?，室溫預(yù)孵30min；設(shè)2組反應(yīng)體系，每組設(shè)三次重復(fù)，并設(shè)空白對(duì)照。
4、在上述反應(yīng)體系中分別加入HCV NS3/NS4特異性熒光多肽底物或WNV(西尼羅河病毒)NS3/NS4特異性熒光多肽底物使其終濃度為100nM，混勻后在室溫下孵育1h，再加入100μL 500mM的嗎啉乙磺酸終止反應(yīng)。
5、采用酶標(biāo)儀檢測反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)，激發(fā)波長設(shè)為340nm，發(fā)射波長設(shè)為615nm，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表3部分受試化合物對(duì)NS3絲氨酸蛋白酶的抑制活性
注：受試化合物對(duì)NS3絲氨酸蛋白酶的抑制活性用抑制率表示
如表3結(jié)果顯示，當(dāng)受試化合物的濃度設(shè)為10μM時(shí)，除了編號(hào)為NI-H-00035的化合物，表格中所示化合物對(duì)HCV的NS3絲氨酸蛋白酶的抑制率為7％～29％，對(duì)WNV的NS3絲氨酸蛋白酶的抑制率為8％～19％；當(dāng)受試化合物的濃度設(shè)為100μM時(shí)，表格中所示化合物對(duì)HCV的NS3絲氨酸蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制活性，抑制率為58％～73％，對(duì)HCV的NS3絲氨酸蛋白酶的抑制率為28％～59％。
表1以及表2中其他化合物在濃度為100μM時(shí)，對(duì)HCV以及WNV NS3蛋白酶的抑制率均低于20％。
實(shí)施例6抗病毒活性實(shí)驗(yàn)
1、抗丙型肝炎病毒(HCV)活性實(shí)驗(yàn)
(1)將含有HCV genotype 2(JFH1)的亞基因組RNA復(fù)制子的細(xì)胞株Huh7.5.1接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為2×104個(gè)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入采用DMSO梯度稀釋后的受試化合物，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育48h后，測定化合物的EC50值。表4為部分化合物的EC50值。EC50為半最大效應(yīng)濃度。
(2)將含有HCV genotype 1的亞基因組RNA復(fù)制子BM4-5細(xì)胞系細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為2×104個(gè)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入采用DMSO梯度稀釋后的受試化合物，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育48h后，測定化合物的EC50值。表4為部分化合物的EC50值。
2、抗登革熱病毒(DENV)活性實(shí)驗(yàn)
將BHK-21細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為5×104個(gè)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入含有海腎熒光素酶(Rluc)報(bào)告基因的DENV基因轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，加入采用DMSO梯度稀釋后的受試化合物，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育48h后，測定化合物的EC50。表4為部分化合物的EC50。
3、抗西尼羅河病毒(WNV)活性實(shí)驗(yàn)
將Vero細(xì)胞系細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為8×104個(gè)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，加入含有海腎熒光素酶(Rluc)報(bào)告基因的復(fù)制子全長WNV基因轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，加入采用DMSO梯度稀釋后的受試化合物，置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后，測定化合物的EC50。表4為部分化合物的EC50。
4、受試化合物對(duì)病毒孵育細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)
將細(xì)胞株Huh 7.5.1、BM4-5細(xì)胞系細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和Vero細(xì)胞系細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量依次設(shè)為2×104個(gè)、2×104個(gè)、5×104個(gè)和8×104個(gè)，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后，將96孔板內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基吸去，加入用培養(yǎng)基梯度稀釋后的受試化合物，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行MTT細(xì)胞活性測試，測定化合物的CC50值。CC50為50％的細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)的藥物濃度，部分化合物的CC50值見表4。
表4受試化合物在不同細(xì)胞系中的活性數(shù)據(jù)
注：n/d為尚未檢測；
如表4結(jié)果顯示，受試化合物NI-H-00023、NI-H-00035、NI-H-00246對(duì)丙肝病毒具有一定的抑制活性；而化合物NI-H-00003、NI-H-00005、NI-H-00247對(duì)登革熱病毒和西尼羅河具有一定的抑制活性；NI-H-00001、NI-H-00002、NI-H-000018、NI-H-00246對(duì)丙肝病毒、登革熱病毒及西尼羅河病毒均具有一定的抑制活性。而且所有受試化合物對(duì)病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒活性較小，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。