本發(fā)明涉及大麗輪枝菌(verticilliumdahliae)產(chǎn)微菌核相關基因vdgap的功能分析及其潛在應用的研究，屬于植物病理學研究領域。

背景技術：

大麗輪枝菌(verticilliumdahliaekleb.)是引起植物黃萎病的重要土傳病原真菌，寄主廣泛，可危害多種重要的經(jīng)濟作物和園藝作物。傳統(tǒng)的防治技術，如輪作、抗性品種選育、化學藥劑等對黃萎病的防治有一定的效果，但是由于大麗輪枝菌具有豐富的遺傳多樣性，致病力易發(fā)生分化，且主要以抗逆性強的微菌核結構在土壤中存活，因而在世界范圍內(nèi)黃萎病的危害依然嚴重。

黃萎病是系統(tǒng)性侵染的單循環(huán)病害，微菌核是大麗輪枝菌在土壤中的主要休眠結構，能夠在無寄主植物的土壤中長期存活達14年之久，成為植物黃萎病重要的初侵染來源，在病害循環(huán)中起重要作用，其形成的數(shù)量及存活情況直接影響著黃萎病的發(fā)生危害程度。因此明確微菌核形成和發(fā)育的機制對于深入研究該病害流行規(guī)律和制定防治措施具有重要意義。對于大麗輪枝菌微菌核的研究過去往往集中于微菌核的形態(tài)、大小、分布，微菌核的分離培養(yǎng)技術以及影響微菌核存活的土壤環(huán)境因素等。對于其發(fā)育的過程在形態(tài)學層次也已清晰，最初階段是由單根或數(shù)根菌絲膨大，并產(chǎn)生大量的隔膜。然后，其隔膜的細胞繼續(xù)增大，成為球狀并產(chǎn)生側芽。最后，在細胞壁內(nèi)和細胞間沉積黑色素顆粒，黑色素對于形成完整的休眠結構是必須的。而對于其發(fā)育的分子機理則研究的很少。

目前報道的與大麗輪枝菌微菌核發(fā)育相關的基因不多，并且大多與致病性相關，其中研究最深入的是基因vdh1。通過構建大麗輪枝菌微菌核形成發(fā)育的est文庫，在1000多個est文庫中發(fā)現(xiàn)有29個與大麗輪枝菌微菌核形成有關。再進一步研究發(fā)現(xiàn)其中的classiihydrophobin基因(vdh1)參與了大麗輪枝菌微菌核的形成，該基因敲除后的突變體形成微菌核的能力大大降低，但其致病性幾乎沒有改變。通過與gfp融合表達，發(fā)現(xiàn)該基因定位于菌絲和分生孢子細胞出現(xiàn)融合的部位，也就是在大麗輪枝菌微菌核初始形成的階段特異性表達，并且該基因表達受營養(yǎng)物質碳源的調控。另外，通過借鑒在其他病原真菌如核盤菌、立枯絲核菌菌核發(fā)育或致病性方面的研究成果，推測可能參與大麗輪枝菌微菌核發(fā)育的候選基因，通過基因敲除驗證，發(fā)現(xiàn)了基因vmk1、vdpkac1、vdsnf1和vgb。其中vmk1編碼促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，mapk)，該基因敲除后的突變體微菌核形成明顯減少，致病力也顯著下降。vdpkac1編碼camp依賴性蛋白激酶a的一個催化亞基，該基因敲除后的突變體微菌核形成顯著增加，而致病力則明顯降低。vdsnf1編碼sucrosenonfermenting1，該基因調控分解代謝阻遏，敲除后的突變體編碼細胞壁降解酶的基因表達下降，致病力顯著下降，微菌核形成的能力也顯著下降。與其他植物病原真菌相比，大麗輪枝菌微菌核發(fā)育的分子機理研究相對滯后。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的這些基因僅僅揭開了大麗輪枝菌微菌核發(fā)育機制的冰山一角，外界環(huán)境和內(nèi)在因子引發(fā)大麗輪枝菌微菌核發(fā)育的途徑、靶標位點以及作用方式都還需要進一步揭示。

另外大麗輪枝菌屬于半知菌，病菌在不同生態(tài)條件下形態(tài)和致病力變異很大，而且受溫度、營養(yǎng)、菌株特性等條件的影響大。在菌落形態(tài)上，根據(jù)在pda培養(yǎng)基上生長時形成微菌核的多少將大麗輪枝菌分為產(chǎn)生大量黑色微菌核的菌核型、產(chǎn)生少量黑色微菌核的中間型和不產(chǎn)微菌核的菌絲型這三種培養(yǎng)類型。從我們長期監(jiān)測江蘇省棉花黃萎病菌變異的結果來看，2002年調查時，菌絲型菌株在田間所占比例最高，而2008年再調查時，江蘇棉花黃萎病菌已從菌絲型為主演變?yōu)榫诵蜑橹?。這種大麗輪枝菌微菌核產(chǎn)生的群體遺傳變異規(guī)律也有待于揭示。

因此，我們希望通過分子生物學手段從大麗輪枝菌中直接挖掘更多參與微菌核發(fā)育相關的基因，探索其調控的信號網(wǎng)絡途徑，從分子層面來揭示大麗輪枝菌微菌核發(fā)育機理，為作物抗病育種、新型殺菌劑的研發(fā)提供新的思路和靶標。對于一部分細菌和真菌，在構建載體時，將其基因組上靶標基因兩側一定長度的同源序列進行克隆，并且將抗生素抗性基因盒連接到兩者當中。利用如原生質體轉化或農(nóng)桿菌介導的轉化方法，將這一帶有同源序列的質粒導入該微生物細胞內(nèi)后，細胞會在一定比例上啟動核酸修復機制，而原靶標基因的核酸序列將被載體上帶有抗性基因盒的序列替換，從而產(chǎn)生不含有靶基因的敲除突變體。而通過對敲除突變體和回補突變體表型的觀察和檢測，可以確定該基因的生物學功能及其在相關領域的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

從大麗輪枝菌v08df1菌株中克隆了vdgap基因，該基因全長為833個堿基，核苷酸序列為seqidno：1，該基因的cds序列具有seqidno：2所示的核苷酸序列。本發(fā)明同時提供了vdgap基因編碼的蛋白質序列，該蛋白質序列具有seqidno：3所示的氨基酸序列。根據(jù)該基因及其側翼的核酸序列，構建了針對該基因的敲除、回補載體。利用農(nóng)桿菌介導的轉化方法，獲得了該基因的敲除突變體和回補突變體。通過對這些轉基因材料的表型觀察和分析，發(fā)現(xiàn)vdgap基因表達的蛋白影響大麗輪枝菌產(chǎn)微菌核的能力。

相關技術路線如下：

1.利用網(wǎng)上共享的生物信息資源，設計核酸引物，構建vdgap基因的敲除載體，并將載體導入大腸桿菌和農(nóng)桿菌菌株中。

2.利用網(wǎng)上共享的生物信息資源，設計核酸引物，構建vdgap回補載體，并將載體導入大腸桿菌和農(nóng)桿菌菌株中。

3.將敲除載體利用農(nóng)桿菌轉化的方法導入到大麗輪枝菌v08df1中，獲得敲除突變體；將回補載體利用農(nóng)桿菌轉化的方法導入到δvdgap敲除突變體中，獲得回補突變體。

4.觀察野生型菌株以及敲除和回補突變體在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)微菌核的差異。

附圖說明

圖1.vdgap敲除突變體熒光定量圖(v08df1為野生菌株；1c2為t-dna篩選突變體；δvdgap敲除突變體3、δvdgap敲除突變體4、δvdgap敲除突變體5、δvdgap敲除突變體6、δvdgap敲除突變體7為5個敲除vdgap基因的突變體菌株)

圖2.vdgap回補突變體熒光定量圖(v08df1為野生菌株；1c2為t-dna篩選突變體；vdgap回補突變體8、vdgap回補突變體10-2為2個回補vdgap基因的突變體菌株)

圖3.野生型菌株v08df1和突變體1c2在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)微菌核能力差異的分析結果(v08df1為野生菌株；1c2為t-dna篩選突變體)

圖4.野生型菌株v08df1以及敲除和回補突變體在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)微菌核能力差異的分析結果(v08df1為野生菌株；1c2為t-dna篩選突變體；δvdgap敲除突變體7為敲除vdgap基因的突變體菌株；vdgap回補突變體8、vdgap回補突變體10-2為2個回補vdgap基因的突變體菌株)

具體實施方式

1.vdgap基因的敲除載體和回補載體的構建，并將構建好的載體用化學轉化法導入農(nóng)桿菌agl-1菌株中，分別獲得具有vdgap基因敲除功能以及回補功能的agl-1農(nóng)桿菌各一個，具體流程描述如下：

a.利用網(wǎng)上共享的生物信息資源(參見：http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/multihome.html)，分別設計兩對核酸引物，即5′側翼擴增引物上游：ggggacagctttcttgtacaaagtggaaggtgcagataccaccattc；5′側翼擴增引物下游：ggggactgcttttttgtacaaacttgtgttcacaaggctgtcaagag；3′側翼擴增引物上游：ggggacaactttgtatagaaaagttgtttcgtaaagagcgagatagaa；3′側翼擴增引物下游：ggggacaactttgtataataaagttgtgcacaggagtgggtaaaa。利用它們對大麗輪枝菌v08df1的基因組dna進行聚合酶鏈式反應(pcr)擴增，得到vdgap基因5′和3′兩側各約1kb的序列，然后將目的條帶進行純化。將純化好的核酸片段各20ng與各60ng的pa-hyg-oscar和poscar質粒(購于fungalgeneticsstockcenter)混合，并加入1μlbpiienzymemix(購于invitrogen)，混勻后，25℃反應16小時，獲得敲除質粒vdgap-del。將該質粒轉化大腸桿菌，經(jīng)核酸測序正確后，采用熱激法將敲除質粒導入農(nóng)桿菌agl-1中，由此即得到帶有vdgap基因敲除功能的agl-1農(nóng)桿菌菌株。

b.利用網(wǎng)上共享的生物信息資源(參見：http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticillium_dahliae/multihome.html)，分別設計兩條核酸引物，即上游：gacctgcaggcatgcaagctttcatgtacatgtacagggaccga；下游：acgacggccagtgccaagctttctttatcttgaatttgatgacgaact。利用該引物對大麗輪枝菌v08df1基因組dna進行pcr擴增，獲得包括vdgap基因啟動子，orf以及終止子在內(nèi)的約2300bp的核酸片段。將該序列純化，利用clonexpress^tmii重組反應體系(購于vazyme生物技術公司)將該片段連接至用hindiii線性化的1300-ble載體(經(jīng)本實驗室改造)上，獲得vdgap回補質粒。測序驗證正確后，將該質粒導入農(nóng)桿菌agl-1中，獲得具有回補功能的農(nóng)桿菌菌株。

2.vdgap基因的敲除突變體和回補突變體的獲得

利用上一步驟中獲得的具有vdgap基因敲除功能以及回補功能的agl-1農(nóng)桿菌菌株分別對野生型v08df1菌株和獲得的δvdgap敲除突變體進行轉化，具體的轉化步驟如下：大麗輪枝菌轉接至液體pda中，28℃，150rpm培養(yǎng)3天；含有t-dna雙元載體的農(nóng)桿菌agl-1挑取單克隆接至液體mm培養(yǎng)基當中(現(xiàn)配現(xiàn)用，1升超純水中溶解：2.05gk2hpo4，1.45gkh2po4，0.15gnacl，0.5gmgso4·7h2o，0.1gcacl2·6h2o，0.0025gfeso4·7h2o，0.5g(nh4)2so4和2.0gglucose)，28℃，150rpm培養(yǎng)2天。之后將農(nóng)桿菌用im培養(yǎng)基(在90mlmm培養(yǎng)基中加入0.5ml甘油和0.7808gmes，ph值調至5.3-5.5，并用mm定容至100ml)稀釋到od600＝0.15，預培養(yǎng)6小時，然后與等體積的、濃度為1.0×10⁵孢子/ml的大麗輪枝菌孢子液混合。將混合物取適量涂布于滅菌的、置于cm固體培養(yǎng)基(與im培養(yǎng)基相似，但葡萄糖濃度為im培養(yǎng)基的一半，另外還包含200μm乙酰丁香酮)上的硝酸纖維素膜(0.45μm孔徑)上，于28℃共培養(yǎng)48小時。之后，硝酸纖維素膜被轉移至pda固體培養(yǎng)基上【200μmcefotaxime和50μg/mlhygromycinb(篩選vdgap敲除突變體)或25μg/mlbleomycin(篩選vdgap回補突變體)】。相同條件培養(yǎng)5-7天后，可見小的轉化子菌落，用接種針分別挑取其孢子進行培養(yǎng)，經(jīng)過單孢分離后以終濃度25％甘油，-70℃保存。

3.大麗輪枝菌v08df1野生菌株以及vdgap敲除和回補突變體在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)微菌核的差異觀察

獲得敲除突變體和回補突變體后，將上述各菌株，挑取菌絲至1ml無菌水中，振蕩均勻后，吸取10μl滴加至固體pda、查氏、添加棉花碎根的查氏(稱取15g棉花幼苗的根須，研磨后，溶于70mlddw，25℃振蕩1h，濾紙過濾，固體殘渣分裝2mleppendorf管(管蓋已開孔)，高溫高壓滅菌，濾出液用0.22μm濾器過濾至10ml無菌管中，使用時，每100ml培養(yǎng)基加入2管殘渣和1管濾出液)三種培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)，觀察微菌核產(chǎn)生情況。