本發(fā)明涉及一種提高胞內氧化型輔酶I含量的方法，屬于輔因子工程技術領域。

背景技術：

輔酶I，又稱煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide)，是一種傳遞電子(氫離子)的輔酶，KEGG數(shù)據庫顯示NADH/NAD⁺作為重要的輔因子全程參與微生物細胞內的740多個代謝反應，包括氧化還原反應、能量代謝過程、調控基因表達、維持Ca⁺穩(wěn)態(tài)以及調節(jié)細胞衰老等，尤其在糖酵解、糖異生、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈中發(fā)揮著不可替代的作用。NAD⁺能為代謝網絡中各種反應提供能量和氧化還原力，其濃度可以調控代謝網絡途徑，增大代謝流通量，提高氧化還原反應中生物催化效率和目標產物的產率等。

NAD⁺生物合成主要有兩條途徑：從頭合成途徑和補救合成途徑(圖1)。從頭合成途徑以天冬氨酸或色氨酸為前體，通過一系列步驟生成喹啉酸(QA)，接著經基因nadC編碼的喹啉酸磷酸核糖轉移酶催化生成煙酸單核苷酸(NaMN)，再由基因nadD編碼的腺苷轉移酶催化腺苷化生成煙酸腺嘌呤二核苷酸(NaAD)，最后在基因nadE編碼的NAD⁺合成酶催化下氨基化成NAD⁺。補救途徑是基因pncA編碼的煙酰胺酶水解煙酰胺生成煙酸，再經基因pncB編碼的煙酸磷酸核糖轉移酶催化煙酸生成煙酸單核苷酸(NaMN)，最后生成NAD⁺。當細胞內大量存在NAD⁺前體煙酰胺(NAM)、煙酸(NA)時，補救途徑對胞內NAD⁺的含量起到重要的作用。

目前，提高細胞內NAD⁺含量主要從代謝工程和生化工程兩個方向上考慮，其中包括：過量表達NADH代謝相關酶、缺失NADH競爭途徑、引入NADH外源代謝途徑、添加外源電子受體、不同氧化還原態(tài)底物及NAD合成前體物、調節(jié)培養(yǎng)環(huán)境和氧化還原電勢等。

大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調控、培養(yǎng)基要求簡單且生長周期短等優(yōu)點，被廣泛應用于科研工作中。然而，其細胞內的輔酶含量較低，無法起到增強相關催化反應效率的作用。因此，通過基因工程的手段增強細胞內NAD⁺含量對于提高胞內氧化型輔酶I的含量具有重要作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種共表達pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中至少兩個基因的重組大腸桿菌。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌以E.coli BL21為宿主。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌是共表達pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中的任意三種基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌共表達pncA、nadD、nadE基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌共表達pncB、nadE、nadD基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌共表達nadC、nadD、nadE基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌共表達pncB、nadE、pncA基因。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述重組大腸桿菌的構建方法，是以pET-21a為載體，在大腸桿菌E.coli BL21中表達pncA、pncB、nadC、nadD、nadE中的至少2個基因。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種提高重組大腸桿菌胞內氧化型輔酶I含量的方法，所述方法是將所述重組大腸桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30～37℃培養(yǎng)8～72h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述接種是按體積比1％的接種量進行接種。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有終濃度1～100mg/L的色氨酸、天冬氨酸、喹啉酸、煙酸、煙酰胺中的至少一種。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是在接種后菌體OD₆₀₀達到0.6-2.0時，加入終濃度為0.1-10mM的IPTG，16-37℃誘導8-48h。

本發(fā)明還提供所述重組大腸桿菌在食品、醫(yī)藥領域生產氧化型輔酶I方面的應用。

本發(fā)明還提供所述方法在生產含氧化型輔酶I的產品中的應用。

有益效果：本發(fā)明通過采用共表達多基因的組合，并且在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同的前體物質，將多基因與多種類的前體物質結合，擴大代謝網絡通量，大腸桿菌胞內的輔酶含量在經過代謝工程和生化工程兩個手段的調控后可達到20-30μmol/g DCW。相比出發(fā)菌株BL21/pET-21a提高了近10倍，NAD⁺生成的效率明顯提高，大腸桿菌胞內NAD⁺的含量也進一步增加。

附圖說明

圖1為輔酶NAD⁺合成途徑示意圖，其中NAD⁺化學結構及其相關中間體(R：核糖體、P：磷酸、Ad：腺嘌呤)化合物的縮寫為：L-Trp：L-色氨酸；Asp：天冬氨酸；QA：喹啉酸；NA：煙酸；NaMN：煙酸單核苷酸；NaAD：煙酸腺嘌呤二核苷酸；NAD⁺：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAM：煙酰胺；NR：煙酰胺核苷；NMN：煙酰胺單核苷酸。

具體實施方式

發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 10g/L蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2，以去離子水配制，使用前加入氨芐青霉素100μg/mL。

發(fā)酵條件：初始溫度為37℃，搖床轉速為200r/min，菌體OD₆₀₀達到0.6-2.0時，加入終濃度為0.1-10mM的IPTG，16-37℃誘導8-48h，添加前體物質的濃度為1-100mg/L。

實施例1

(1)構建過量表達基因pncA、pncB、nadC、nadD、nadE的表達質粒：

根據NCBI上報道的大腸桿菌中基因pncA的序列(Gene ID:946276)，基因pncB的序列(Gene ID:8182321)，基因nadC的序列(Gene ID:948869)，基因nadD的序列(Gene ID:8180157)，基因nadE的序列(Gene ID:8179982)設計上下游引物，并合成帶有BamH I和Xho I酶切位點的引物：

pncA-F:GGATCCATGCCCCCTCGCGCCCTGTT

pncA-R：CCGCTCGAGTTACCCCTGTGTCTCTTCCCAGTCTG

pncB-F:CGCGGATCCATGACACAATTCGCTTCT

pncB-R:CCGCTCGAGTTAACTGGCTTTTTTAATATGCGG

nadC-F:GGATCCATGCCGCCTCGCCGCTATAACC

nadC-R:CTCGAGTTAGCGAAAACGCATTGAAAGGTCGAGTG

nadD-F:CGCGGATCCATGAAATCTTTACAGGCTC

nadD-R:CCGCTCGAGTCAGCGATACAAGCCTTGTT

nadE-F:CGCGGATCCATGACATTGCAACAACAAAT

nadE-R:CCGCTCGAGTTACTTTTTCCAGAAATCATCG

提取E.coli BL21(DE3)的基因組，以其為模板，PCR克隆擴增得到目的基因pncA、pncB、nadC、nadD和nadE片段，反應條件為：98℃預變性30s；98℃變性10s；55℃退火30s；72℃分別延伸42s、80s、58s、42s、55s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

將目的基因產物純化后，連接到pMD-19T載體，轉化篩選陽性克隆并測序。再將載體pET-21a和T載上的目的基因用限制性核酸內切酶BamH I和Xho I酶切90min，經瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的基因片段和質粒骨架，在T4連接酶作用下16℃連接過夜。然后將連接產物轉化JM109克隆宿主感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性克隆轉化子。

(2)將質粒pET-21a-pncA、pET-21a-pncB、pET-21a-nadC、pET-21a-nadD、pET-21a-nadE導入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，得到重組菌株。

(3)對重組菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為按體積的1％，IPTG誘導濃度為0.1-10mM，測定其胞內的NAD⁺含量(表1)。其中效果比較明顯的有：E.coli BL21/pET-21a-pncB和E.coli BL21/pET-21a-nadE。其胞內的輔酶含量分別達到12.475μmol/g DCW和13.398μmol/g DCW，與對照相比提高了3倍和3.3倍。

表1過表達單個基因重組菌株生長情況及NAD⁺含量

實施例2

(1)構建共表達多基因的大腸桿菌重組菌株：

根據已經構建成功的質粒pET-21a-pncA、pET-21a-pncB、pET-21a-nadC、pET-21a-nadD、pET-21a-nadE設計上下游引物，并且在兩個多個基因之間加上SD-AS序列(AGAAGGAGATATACA)，采用重疊延伸PCR技術，實現(xiàn)多個基因在同一個質粒上的串聯(lián)表達。

合成帶有BamH I和Xho I酶切位點的引物，以質粒pET-21a-pncA、pET-21a-pncB、pET-21a-nadC、pET-21a-nadD、pET-21a-nadE為模板，重疊延伸PCR克隆擴增得到目的基因pncA-pncB、pncA-nadD、pncA-nadE、pncB-nadD、pncB-nadE、nadD-nadE、nadC-nadD、nadC-nadE以及pncA-pncB-nadD、pncA-nadD-nadE、pncB-nadD-nadE、nadC-nadD-nadE、pncA-pncB-nadE片段，反應條件為：98℃預變性30s；98℃變性10s；60℃退火15s；72℃分別延伸112s、80s、90s、112s、125s、90s、95s、105s，以及155s、130s、165s、145s、165s，15個循環(huán)；72℃延伸10min，再加入上下游引物各1μL，繼續(xù)上述條件，15個循環(huán)，72℃延伸10min，12℃30min。

將目的基因產物純化后，連接到pMD-19T載體，轉化篩選陽性克隆并測序。再將載體pET-21a和T載上的目的基因用限制性核酸內切酶BamH I和Xho I酶切90min，經瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的基因片段和質粒骨架，在T4連接酶作用下16℃連接過夜。然后將連接產物轉化JM109克隆宿主感受態(tài)細胞，在氨芐青霉素抗性平板上篩選陽性克隆轉化子。

(2)將以上所得到的質粒導入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，得到多基因共表達的重組菌株

(3)對多基因共表達重組菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，先用LB氨芐青霉素平板活化重組菌株，挑取單菌落接入5mL含有終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB試管中，培養(yǎng)12h后再按1％的接種量轉接于50mL的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-2.0時添加終濃度為0.1-10mmol/L的IPTG，16-37℃，200r/min誘導，蛋白表達正常后進行胞內NAD⁺含量的測定(表2)。

表2多基因共表達重組菌株胞內NAD⁺含量

多基因共表達重組菌株中，E.coli BL21/pET-21a-nadE-pncB、E.coli BL21/pET-21a-pncB-nadE-nadD和E.coli BL21/pET-21a-pncB-nadE-pncA胞內NAD⁺含量能達到18μmol/g DCW。相比出發(fā)菌株E.coli BL21/pET-21a提高了近5倍。

實施例3

(1)配制功能因子促進劑：將色氨酸、天冬氨酸、喹啉酸、煙酸、煙酰胺分別用滅菌后的超純水溶解，配制為終濃度100mg/L的溶液。

(2)對初始菌株E.coli BL21/pET-21a進行發(fā)酵培養(yǎng)，采用50ml搖瓶有氧發(fā)酵。按1％接種量從凍存管里接入5mL的LB試管中，同時接入終濃度為100μg/mL的氨芐青霉素，培養(yǎng)12h后再按1％的接種量轉接于50mL的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加終濃度為40mg/L的功能因子促進劑，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-2.0時添加終濃度為0.1-10mmol/L的IPTG，16-37℃，200r/min誘導。

3、測定添加不同前體物質培養(yǎng)后的初始菌株E.coli BL21/pET-21a胞內NAD⁺含量。結果如表3所示，其中添加了喹啉酸、煙酸及煙酰胺后對胞內輔酶的生成量促進作用較大，相比空白對照組，分別提高了近64％、105％和67％。

表3添加不同前體物質后E.coli BL21/pET-21a胞內NAD⁺的含量

實施例4

(1)根據實施例3的方法配制功能因子促進劑。

(2)對多基因共表達重組菌株(實施例2制備的重組菌)進行發(fā)酵培養(yǎng)，先用LB氨芐青霉素平板活化重組菌株，挑取單菌落接入5mL含有終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB試管中，培養(yǎng)12h后再按1％的接種量轉接于50mL的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加終濃度為1-100mg/L的前體物質，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6-2.0時添加終濃度為0.1-10mmol/L的IPTG，16-37℃，200r/min誘導。

(3)收集發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體進行SDS-PAGE分析，組合共表達的關鍵限速酶酶正常表達后進行胞內NAD⁺含量的測定，結果如表4所示，添加了前體物質的共表達重組菌株胞內的輔酶含量均有所提高。其中效果最為明顯的是E.coli BL21/pET-21a-nadE-pncB和E.coliBL21/pET-21a-pncB-nadE-pncA在添加煙酸后，NAD⁺含量可達到近32μmol/g DCW。

表4多基因共表達的重組菌株組合不同的前體物質對胞內NAD⁺含量的影響

本發(fā)明配制0～100mg/L的功能因子促進劑，并將其用于重組大腸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)，結果顯示，均能有效促進胞內NAD⁺的含量，雙基因共表達組合中，喹啉酸對E.coli BL21/pET-21a-nadC-nadD和E.coli BL21/pET-21a-nadC-nadE的促進作用最大，使其胞內氧化型輔酶含量分別達到15.7μmol/g DCW和19.9μmol/g DCW。煙酸對E.coli BL21/pET-21a-pncB-nadE和E.coli BL21/pET-21a-nadE-pncB胞內輔酶含量提高幅度明顯，分別可達到30.6μmol/g DCW和32.5μmol/g DCW。煙酰胺對E.coli BL21/pET-21a-pncA-nadE促進作用較大，胞內輔酶含量達24.8μmol/g DCW。

三個基因共表達組合中，煙酰胺對E.coli BL21/pET-21a-nadC-nadD-nadE的提高幅度較大，其他菌株均是煙酸起到了更明顯的提高輔酶含量的作用。

所有效果明顯的重組菌株與未添加前體物質相比，均提高了56％以上。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。