本發(fā)明屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與南瓜皮色基因連鎖的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

果皮顏色是果實外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是影響商品價值的重要因素。中國南瓜是南瓜屬的三個栽培種之一，國外的中國南瓜多為純色的黃皮品種或者墨綠皮品種，而我國主要栽培的是淺黃花斑皮品種，而不帶花斑的品種較少。近年來，純色的黃皮或墨綠皮品種較受歡迎，但由于目前我國的資源大多是帶花斑的淺黃或橙色品種，尚不能解決市場的純色皮的需求，為了滿足消費市場的需求，我國引進(jìn)了部分墨綠色品種。開展品質(zhì)優(yōu)良的純色品種選育是未來南瓜品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一。傳統(tǒng)育種方式選育純色品種雖然可行，但是耗時費力，大大影響我國的南瓜育種事業(yè)。隨著高通量測序技術(shù)的成熟，特別是大量的SNP(單堿基擴(kuò)增多態(tài)性)標(biāo)記的開發(fā)，應(yīng)用高密度遺傳圖譜的方法開展植物性狀基因定位成為挖掘植物基因的熱點之一。特別是南瓜的全基因組測序尚未完成，利用高通量測序技術(shù)開發(fā)大量的SNP標(biāo)記，開發(fā)性狀連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行品種的初期篩選，達(dá)到分子輔助育種的目的，可大大縮短育種的周期提高育種效率。因此，進(jìn)行南瓜果皮顏色的基因定位，篩選緊密連鎖的分子標(biāo)記，建立早期輔助選擇技術(shù)體系，對果皮顏色的遺傳改良具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供與南瓜皮色基因連鎖的SNP標(biāo)記位點，dCAPS標(biāo)記開發(fā)及其應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

與南瓜皮色基因緊密連鎖的SNP分子標(biāo)記，其為分子標(biāo)記63809或分子標(biāo)記30774，定位于中國南瓜8號連鎖群上，分別位于皮色基因兩側(cè)。

所述分子標(biāo)記63809包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第195位堿基是SNP位點，其堿基為C或T；當(dāng)SNP所在位點全為C時，與分子標(biāo)記63809緊密連鎖的南瓜皮色基因在果實中的表型為墨綠色，當(dāng)SNP所在位點全為T或者為C/T時，則果實表型為淺綠色。

所述分子標(biāo)記30774包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.2所示序列自5’端起第32位堿基是SNP位點，其堿基為A或T；當(dāng)SNP所在位點全為A時，與分子標(biāo)記30774緊密連鎖的南瓜皮色基因在果實中的表型為墨綠色，當(dāng)SNP位點的基因型全為T或者為A/T時，則果實表型為淺綠色。。

用于擴(kuò)增以上所述的SNP分子標(biāo)記的引物對。

作為優(yōu)選的，所述引物對為dCAPS引物對。

進(jìn)一步優(yōu)選的，用于檢測分子標(biāo)記63809的dCAPS引物對的核苷酸序列如下所示：

F1：5’-TTCCAACAATTTCCCTCTACTGCGG-3’(SEQ ID NO.3),

R1：5’-TTGCTATTTTCTTGCATTCGATATCCAT-3’(SEQ ID NO.4)，

其對應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶為NlaIII。

用于檢測分子標(biāo)記30774的dCAPS引物對的核苷酸序列如下所示：

F2：5’-CTTGATGAAATTTCCAGAGCCAAAAAGTCAG-3’(SEQ ID NO.5)，

R2：5’-TGCAAAAGATGGAGCGGCGTGTC-3’(SEQ ID NO.6)，

其對應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶為Hpy188I。

以上所述的SNP分子標(biāo)記、引物對在南瓜果皮顏色輔助育種中的應(yīng)用。

一種用于南瓜果皮顏色輔助育種的試劑盒，其包括用于檢測分子標(biāo)記63809和/或分子標(biāo)記30774SN的試劑。

一種南瓜果皮顏色輔助育種的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測南瓜基因組DNA；

(2)利用特異性引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，確定SNP位點的基因型，從而判斷果皮顏色；或者使用對應(yīng)

的限制性核酸內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切結(jié)果判斷果皮顏色。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明所篩選得到的分子標(biāo)記63809和分子標(biāo)記30774與南瓜果皮皮色基因緊密連鎖，兩標(biāo)記間的遺傳距離為1.04cM，可直接用于果皮皮色基因分子標(biāo)記輔助育種體系的建立。根據(jù)兩分子標(biāo)記設(shè)計的dCAPS擴(kuò)增引物可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于南瓜品種改良分子輔助育種，為南瓜外觀品質(zhì)分子育種提供技術(shù)支持，同時大大縮短了傳統(tǒng)基因定位的時間。

附圖說明

圖1為墨綠果皮的母本(P1)和淺綠果皮的父本(P2)；

圖2為南瓜墨綠皮基因在高密度遺傳連鎖圖譜的初步定位結(jié)果圖：橫坐標(biāo)表示連鎖群的位置，縱坐標(biāo)表示LOD值；紅線表示所有的LOD值擬合后的結(jié)果；虛線標(biāo)記的閾值是代表p<0.001的關(guān)聯(lián)閾值，表示關(guān)聯(lián)性極可靠；

圖3為南瓜墨綠皮基因所在的8號連鎖群的緊密連鎖區(qū)間，左邊為連鎖群的遺傳距離(cM),右邊為標(biāo)記的編號，Gr為皮色基因所在位點；

圖4為分子標(biāo)記63809的PCR擴(kuò)增后酶切結(jié)果：P1、P2分別為墨綠母本和淺綠有斑父本的酶切帶型，其中P1酶切完全，僅有一條195bp片段，P2不能被酶切，片段長度為228bp；F1部分酶切，存在195bp和228bp的片段，F(xiàn)2群體的隨機(jī)單株中存在P1，P2和F1的三種類型；

圖5為分子標(biāo)記30774的PCR擴(kuò)增后酶切結(jié)果：P1、P2分別為墨綠母本和淺綠有斑父本的酶切帶型；其中P1酶切完全，僅有一條277bp片段，P2不能被酶切，片段長度為308bp；F1部分酶切，存在308bp和277bp的片段，F(xiàn)2群體的隨機(jī)單株中存在P1，P2和F1的三種類型。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

以下實施例中所采用的分子生物學(xué)實驗技術(shù)包括DNA提取、PCR擴(kuò)增、PAGE凝膠電泳、酶切、轉(zhuǎn)化等實驗，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黃培堂等譯，2002，北京：科學(xué)出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1

一、遺傳群體的構(gòu)建及遺傳分析

1、供試材料植物材料：墨綠果皮材料是從泰國引進(jìn)分離獲得的高代自交系，命名為CMO-E(P1)，而淺綠果皮材料是廣東本地獲得的高代自交系，命名為CMO-X(P1)。CMO-E和CMO-X雜交獲得F1，F(xiàn)1自交得F2，用作遺傳分析和定位群體。

2、供試材料果實皮色的確定和遺傳規(guī)律分析

對200株F2群體單株，待果實長出，且分別在果實開花后2-10天的幼果和30-40天的成熟果進(jìn)行顏色調(diào)查，200個單株中同時調(diào)查了幼果顏色和成熟果色的148株中，107株為淺綠花斑，而41株為深綠無斑，淺綠對深綠比符合3：1(X²_3：1＝0.57，P＝0.45)，分析結(jié)果表明淺綠花斑果皮性狀可能由一個顯性單基因控制。

二、南瓜遺傳圖譜構(gòu)建和果皮顏色的初步定位

1、南瓜基因組DNA的提取

使用CTAB法提取南瓜親本及200株F2群體基因組DNA，提取的單株DNA用于文庫構(gòu)建；

2、遺傳圖譜構(gòu)建

本研究前期委托深圳恒創(chuàng)生物科技有限公司利用ddRAD技術(shù)進(jìn)行高通量測序，一共202個樣本，采用EcroI和AlnⅢ進(jìn)行酶切，末端修復(fù)、添加測序接頭、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個文庫制備。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至1ng/μl，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進(jìn)行檢測，以保證文庫質(zhì)量。將合格的文庫，根據(jù)數(shù)據(jù)量預(yù)算，進(jìn)行IlluminaHiSeq測序。插入片段長度為500bp；測序類型為PE150；去掉用于區(qū)分樣品的標(biāo)簽序列(4～8bp)，實際Read長度為142～146bp。通過聚類比較檢測出RAD-tags上的SNPs集(采用軟件為自主研發(fā)，聚類不受親本限制)。

對初始SNP集進(jìn)行過濾，可得到較為可靠的基因型數(shù)據(jù)。共開發(fā)18314個SNP標(biāo)記，缺失率小于10％，選取2441個高質(zhì)量SNP，利用Joinmap軟件將LOD值設(shè)為6.0構(gòu)建高密度分子標(biāo)記遺傳圖譜，圖譜共分為20個連鎖群，總圖距2879.55cM，平均標(biāo)記間圖距1.29cM，最短連鎖群94.42cM，最長226.30cM。

3、皮色基因Gr的精細(xì)定位

利用MapQTL5軟件采用復(fù)合區(qū)間作圖法(MQM)對群體的表型數(shù)據(jù)和遺傳圖譜信息進(jìn)行分析計算以獲得性狀相關(guān)的QTL，置換檢驗次數(shù)設(shè)為1000，QTL判斷標(biāo)準(zhǔn)為：p值小于0.01時對應(yīng)的LOD值作為篩選的閾值，圖中以虛線表示。超過閾值表示為一個基因的連鎖定位區(qū)間，虛線的LOD值為25.1，一個group代表一個連鎖群，將皮色基因Gr精細(xì)定位在8號連鎖群(圖2)，定位在兩個SNP標(biāo)記63809和37704之間，區(qū)間從82.897cM到83.941cM,兩個標(biāo)記的遺傳距離為1.04cM(圖3)，其中SNP標(biāo)記63809發(fā)生的C→T的變化，37704發(fā)生的A→T的變化。

三、dCAPS分子標(biāo)記開發(fā)、擴(kuò)增、酶切驗證

根據(jù)分子標(biāo)記63809和分子標(biāo)記37704的SNPs標(biāo)記信息，使用dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.htm)和Genetool分別設(shè)計衍生的酶切多態(tài)性擴(kuò)增序列(dCAPS)引物的錯配引物和另一側(cè)的引物，完成從SNPs向dCAPS標(biāo)記的轉(zhuǎn)化。63809的錯配堿基數(shù)為1個，37704的錯配堿基數(shù)量為2個。

用于擴(kuò)增分子標(biāo)記63809的引物序列如下所示：

F1：5’-TTCCAACAATTTCCCTCTACTGCGG-3’(SEQ ID NO.3)；

R1：5’-TTGCTATTTTCTTGCATTCGATATCCAT-3’(SEQ ID NO.4)；

若SNP位點堿基為C時，PCR產(chǎn)物可被限制性核酸內(nèi)切酶NlaIII識別并切割，產(chǎn)生195bp的片段，可以判斷與分子標(biāo)記63809緊密連鎖的南瓜皮色基因在果實中的表型為墨綠色；當(dāng)SNP位點全為T時，PCR產(chǎn)物不能被限制性核酸內(nèi)切酶NlaIII識別并切割，只有228bp的片段，可以判斷南瓜果實表型為淺綠色有斑；當(dāng)SNP位點為C/T時，則存在192bp和228bp的片段，南瓜果實表型為淺綠色有斑。

用于擴(kuò)增分子標(biāo)記30774的引物序列如下所示：

F2：5’-CTTGATGAAATTTCCAGAGCCAAAAAGTCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

R2：5’-TGCAAAAGATGGAGCGGCGTGTC-3’(SEQ ID NO.6)。

若SNP位點堿基為A時，PCR產(chǎn)物可被限制性核酸內(nèi)切酶Hpy188I識別并切割，產(chǎn)生277bp的片段，可以判斷與分子標(biāo)記30774緊密連鎖的南瓜皮色基因在果實中的表型為墨綠色；當(dāng)SNP位點堿基為T時，其不能被限制性核酸內(nèi)切酶Hpy188I識別并切割，只有308bp的片段，南瓜果實表型為淺綠有斑；當(dāng)SNP位點的堿基為A/T時，則存在308bp和277bp的片段，南瓜果實表型為淺綠有斑。

PCR擴(kuò)增體系使用20μL的擴(kuò)增體系，包含1U Taq酶，1μL模板DNA，1μL的dNTP，1.5μL引物，2μL的10×PCR buffer，加ddH₂O至20μL。PCR擴(kuò)增程序為：94℃3min，循環(huán)過程為94℃30s、退火30s、72℃1min、30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。63809引物的退火溫度為60℃，37704引物的退火溫度為63℃。

在兩親本間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別經(jīng)過限制性內(nèi)切酶NlaIII和Hpy188I進(jìn)行酶切后使用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，親本間表現(xiàn)特異，鑒定F2群體單株40個，兩個標(biāo)記的結(jié)果一致，且果實皮色與雙酶切結(jié)果一致，上述兩個SNP標(biāo)記可以將果皮深綠與果皮淺綠有斑區(qū)分開。

以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所

<120> 與南瓜皮色基因連鎖的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 228

<212> DNA

<213> Cucurbita moschata (Duch. ex Lam.) Duch. ex Poiret

<400> 1

ttccaacaat ttccctctac tgcggtagaa ctcctcaaca ggttgactct aatgccatac 60

acaaataagc aaaagaaaga gaaaacaaga aaccatcaat ttctttaata ccatcaaaag 120

atgaacacca cagcacgtaa aaagaaaagt tctaagtatt actggaagcc tactgaaaac 180

cttttatttt cttccatgga tatcgaatgc aatgcaagaa aatagcaa 228

<210> 2

<211> 308

<212> DNA

<213> Cucurbita moschata (Duch. ex Lam.) Duch. ex Poiret

<400> 2

cttgatgaaa tttccagagc caaaaagcca aatagtgtga catattgagg aaggagattg 60

gagggaagaa tgtataaatc ggtggtttac caaggggatg agctactggg ggaggtagag 120

atttacccag aagaaaagaa tggctacaag aacatcgaag tgaaggaaat cagaataagt 180

cacttctcgc aaccgagtga gaggtgccca ccacttgcgg tgcttcatac cattgcagcc 240

tctggaattt gcttcaaaat ggagtcaaag acctcgcagt cacaggacac gccgctccat 300

cttttgca 308

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttccaacaat ttccctctac tgcgg 25

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgctatttt cttgcattcg atatccat 28

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cttgatgaaa tttccagagc caaaaagtca g 31

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgcaaaagat ggagcggcgt gtc 23