本發(fā)明涉及一種對羥基苯甲酸丙酯的合成方法，屬于生物催化合成技術(shù)領域。

背景技術(shù)：

對羥基苯甲酸丙酯是國際公認的安全、高效、廣譜性防腐劑。它毒性極低，無刺激性以及在較寬pH范圍比較穩(wěn)定等特點，對霉菌、酵母、細菌均有廣泛的抗菌作用，一直是化妝品和藥品中應用較廣的防腐劑。對羥基苯甲酸丙酯在生命科學研究領域?qū)嶒炛芯哂幸欢ǖ挠绊?，可用于生化研究和組織培養(yǎng)等。目前，常用的對羥基苯甲酸丙酯生產(chǎn)方法主要是基于化學催化劑的酯化反應。傳統(tǒng)的化學催化法在高溫高壓和強腐蝕性的條件下進行，能耗大、設備易腐蝕、副產(chǎn)物多、環(huán)保成本高。應用生物催化劑可在溫和、常壓的條件下反應，固定化的生物催化劑易回收重復利用，反應能耗低，產(chǎn)物分離成本低，設備要求低。本合成方法符合綠色環(huán)保的要求，是未來化學品綠色合成的發(fā)展趨勢。此外，單寧酶的天然底物為單寧酸、沒食子酸及其酯類物質(zhì)，應用單寧酸催化合成對羥基苯甲酸丙酯的相關研究未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種對羥基苯甲酸丙酯的合成方法，該方法是一種高效便捷的生產(chǎn)方式，為實現(xiàn)對羥基苯甲酸丙酯綠色高效的生產(chǎn)提供了一種新的途徑。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種對羥基苯甲酸丙酯的合成方法，所述合成方法包括固定化生物印跡酶。

在上述方案中優(yōu)選地，所述生物印跡酶的印跡體系為質(zhì)量比為0.1-1:1-3:10的單寧酶-對羥基苯甲酸-硅藻土。優(yōu)選地，所述生物印跡酶的印跡體系為質(zhì)量比為1:1:10的單寧酶-對羥基苯甲酸-硅藻土。

在上述任一方案中優(yōu)選地，固定所述化生物印跡酶的緩沖溶液為pH為6.0、濃度為100mM的乙酸緩沖溶液。

在上述任一方案中優(yōu)選地，所述合成方法的反應體系包括正己烷、正戊烷、正丙醇、苯或石油醚(30～60℃)。

在上述任一方案中優(yōu)選地，所述合成方法的反應體系包括正丙醇。

在上述任一方案中優(yōu)選地，所述合成方法的反應體系為正丙醇-乙酸緩沖液復合溶劑體系。

在上述任一方案中優(yōu)選地，所述正丙醇-乙酸緩沖液復合溶劑體系中所述正丙醇含量為25-98.5％(v/v)。

在上述任一方案中優(yōu)選地，所述正丙醇-乙酸緩沖液復合溶劑體系中所述正丙醇含量為50％(v/v)。

在上述任一方案中優(yōu)選地，所述正丙醇-乙酸緩沖液復合溶劑體系中所述乙酸緩沖液為pH為6.0、濃度為100mM的乙酸緩沖溶液。

在上述任一方案中優(yōu)選地，所述合成反應的溫度為40℃，震蕩200rpm，反應24h。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明應用固定化生物印跡單寧酶催化合成對羥基苯甲酸丙酯，選用正丙醇醇-乙酸緩沖液的復合溶劑體系提升其催化效率。本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)26.5％的底物轉(zhuǎn)化率。本方法反應溫和、能耗小、污染少，是一種高效便捷的生產(chǎn)方式，為實現(xiàn)對羥基苯甲酸丙酯綠色高效的生產(chǎn)提供了一種新的途徑。本發(fā)明利用生物酶在溫和的條件合成對羥基苯甲酸丙酯，因具有成本低，設備要求不高，且綠色無污染，非常契合化學品綠色合成的要求，具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，也是未來化學品綠色制造的發(fā)展趨勢。因此，本發(fā)明具有重要的應用推廣價值和社會意義。

附圖說明

圖1為不同反應體系的紫外光譜比較；

圖2為不同反應體系的紅外光譜比較；

圖3為印跡酶催化反應樣品與產(chǎn)物、底物的色譜比較；

圖4為不同有機溶劑對印跡酶催化反應性能的影響；

圖5為不同正丙醇含量對印跡酶催化反應性能的影響。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。如無特殊說明，“％”表示體積百分比。單寧酶購于濟南華贊公司。本發(fā)明實施例中，所有乙酸緩沖液的pH為6.0，濃度為100mM。

實驗例1：反應可行性研究

1、生物印跡酶的制備

向50mL錐形瓶中依次加入1mL 50mg/mL對羥基苯甲酸(PHBA)，0.2mL濃度為250mg/mL的單寧酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸緩沖液漩渦震蕩3-5min后。將上述混合物放置在-20℃過夜，再低溫冷凍干燥成粉末，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2、反應體系的配制

2.1、無酶體系：向50mL錐形瓶中依次加入1mL正丙醇，18mL正己烷，1mL 50mg/mL PHBA，0.3mL乙酸緩沖液，0.5g硅藻土配制成反應體系。

2.2、自然酶體系：向50mL錐形瓶中依此加入1mL正丙醇，0.2mL濃度為250mg/mL的單寧酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸緩沖液漩渦震蕩3-5min后。將上述混合物放置在-20℃過夜，在低溫冷凍干燥成粉末，保存于4℃?zhèn)溆?。將上?0mL錐形瓶加入2mL正丙醇，18mL正己烷，0.3mL乙酸緩沖液，1mL 50mg/mLPHBA配制成反應體系。

2.3、印跡酶體系：將裝有1中制備好的生物印跡單寧酶的50mL錐形瓶，依次加入2mL正丙醇，18mL正己烷，0.3mL乙酸緩沖液，配制成催化體系。

3、反應條件

將裝有反應體系的錐形瓶置于40℃，200rpm的微型震蕩培養(yǎng)箱中，催化反應24h。

4、產(chǎn)物鑒定

4.1、紫外檢測

用紫外光譜儀分別對上述三種反應體系進行檢測。由圖1所示，酶能降低反應體系的光吸收值。其中，印跡酶體系降低光吸收值的能力比自然酶體系強。鑒于苯環(huán)上新增基團會遮蔽苯環(huán)使光吸收性下降，由此推斷單寧酶可能具有催化合成對羥基苯甲酸丙酯的能力。進一步地，PHBA可能對單寧酶存在底物誘導的能力。

4.2、紅外檢測

用FT-IR分別對上述三種反應體系進行檢測。由圖2所示，880～680cm^-1之間為C-H面外彎曲振動，不參與反應。1166cm^-1是底物PHBA的特征峰。印跡酶體系、天然單寧酶體系和無酶體系都出現(xiàn)了PHBA的特征峰。通過比較不同樣品紅外波譜在1166cm^-1與858cm^-1的透射比比值發(fā)現(xiàn)，天然單寧酶和印跡單寧酶的數(shù)值逐漸降低(表1)，說明底物的消耗量越來越大，生成的產(chǎn)物可能越來越多，進一步證明了天然單寧酶和印跡單寧酶具有催化該反應的能力。并且，相對于天然酶，印跡酶催化性能更優(yōu)。

表1不同反應樣品的紅外特征波譜分析

4.3、HPLC檢測

用HPLC分別對上述三種反應體系進行檢測。由圖3中標準底物和產(chǎn)物色譜峰所示，保留時間為5min左右的峰是底物特征峰，28min左右的峰是產(chǎn)物對羥基苯甲酸丙酯的特征峰，比較底物、產(chǎn)物和印跡酶反應體系的特征峰，發(fā)現(xiàn)反應樣品中存在對羥基苯甲酸丙酯，證明基于單寧酶催化的PHBA到對羥基苯甲酸丙酯的酯化反應是可以進行的。

因此，選擇選擇生物印跡單寧酶作為催化劑，催化PHBA到對羥基苯甲酸丙酯的酯化反應。

實驗例2：反應體系的確定

1、反應介質(zhì)的選擇

將5個裝有實驗例1的1中固定化印跡單寧酶的50mL錐形瓶，分別加入4mL正丙醇，再依次加入15mL正己烷、正戊烷、正丙醇、苯和石油醚(30～60℃)，1mL乙酸緩沖液，配制成催化體系。將裝有反應體系的錐形瓶置于40℃，200rpm的微型震蕩培養(yǎng)箱中，催化反應24h。結(jié)果如圖4所示，反應介質(zhì)為正丙醇時，酶的催化性能最優(yōu)，底物的轉(zhuǎn)化率最高，達到4.23％(表2)。因此，選擇正丙醇為反應介質(zhì)。

表2不同介質(zhì)的底物轉(zhuǎn)化率

2、正丙醇最佳含量的確定

將5個裝有實驗例1的1中固定化印跡單寧酶的50mL錐形瓶，加入總體積為20mL的正丙醇-乙酸緩沖液的混合溶液，其中，正丙醇體積百分比為25-95％。將裝有反應體系的錐形瓶置于40℃，200rpm的微型震蕩培養(yǎng)箱中，催化反應24h。結(jié)果如圖5所示，正丙醇體積百分比為50％時，底物的轉(zhuǎn)化率最高，達到26.47％，是優(yōu)化前的6倍(表3)。表明基于反應工藝優(yōu)化，提升本發(fā)明的底物轉(zhuǎn)化率的潛力巨大。

表3正丙醇不同含量的底物轉(zhuǎn)化率

實施例1

向50mL錐形瓶中依次加入1mL 50mg/mL PHBA，0.2mL濃度為250mg/mL的單寧酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸緩沖液漩渦震蕩3-5min后。將上述混合物放置在-20℃過夜，再低溫冷凍干燥成粉末，保存于4℃?zhèn)溆?。向裝有制備好的生物印跡單寧酶的50mL錐形瓶，加入總體積為20mL的正丙醇-乙酸緩沖液的混合溶液，其中，正丙醇體積百分比為50％。配制成催化體系。將裝有反應體系的錐形瓶置于40℃，200rpm的微型震蕩培養(yǎng)箱中，催化反應24h。最終底物的轉(zhuǎn)化率為26.47％，純度99.95％。

實施例2

向50mL錐形瓶中依次加入1mL 50mg/mL PHBA，0.2mL濃度為25mg/mL的單寧酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸緩沖液漩渦震蕩3-5min后。將上述混合物放置在-20℃過夜，再低溫冷凍干燥成粉末，保存于4℃?zhèn)溆?。向裝有制備好的生物印跡單寧酶的50mL錐形瓶，加入總體積為20mL的正丙醇-乙酸緩沖液的混合溶液，其中，正丙醇體積百分比為50％。配制成催化體系。將裝有反應體系的錐形瓶置于40℃，200rpm的微型震蕩培養(yǎng)箱中，催化反應24h。最終底物的轉(zhuǎn)化率為26.15％，純度99.93％。

實施例3

向50mL錐形瓶中依次加入1mL 150mg/mL PHBA，0.2mL濃度為250mg/mL的單寧酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸緩沖液漩渦震蕩3-5min后。將上述混合物放置在-20℃過夜，再低溫冷凍干燥成粉末，保存于4℃?zhèn)溆谩Ｏ蜓b有制備好的生物印跡單寧酶的50mL錐形瓶，加入總體積為20mL的正丙醇-乙酸緩沖液的混合溶液，其中，正丙醇體積百分比為50％。配制成催化體系。將裝有反應體系的錐形瓶置于40℃，200rpm的微型震蕩培養(yǎng)箱中，催化反應24h。最終底物的轉(zhuǎn)化率為26.23％，純度99.92％。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。