本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及到黃野螟超氧化物歧化酶基因全序列及其克隆方法。該基因編碼超氧化物歧化酶，該酶(sod)廣泛存在于生物體各組織，在機體抗氧化和免疫過程中起著重要作用，具有重要的研究價值。

技術(shù)背景

超氧化物歧化酶(sod)是組成生物體保護酶系統(tǒng)中很重要的酶，生物體在生命活動過程中，特別是在逆境脅迫條件下會產(chǎn)生多種活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)，如超氧陰離子自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫和羥自由基等。這些活性氧具有很強的氧化能力，當(dāng)它們在生物體內(nèi)過量積累時可造成機體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、dna及其他細胞組分的嚴重損傷，對生物體有很大危害。它與過氧化氫酶以及過氧化物酶共同組成了保護酶系統(tǒng)。當(dāng)機體內(nèi)活性氧大量積累時，sod就會被大量誘導(dǎo)生成，催化活性氧發(fā)生歧化反應(yīng)，生成水和過氧化氫。它是唯一能夠特異性清除超氧陰離子自由基的抗氧化酶，平衡機體的氧自由基，從而起到保護機體的作用，所以對超氧化物歧化酶的研究具有重要的現(xiàn)實意義。

黃野螟(heortiavitessoides)屬鱗翅目(lepidoptera)，螟蛾科(pyralidae)，在我國廣泛分布于廣東、廣西、海南和云南等南方各省以及香港特別行政區(qū)。黃野螟是典型的寡食性害蟲，僅取食沉香屬(aquilaria)和漆樹屬(rhus)等少數(shù)幾種植物近年來，隨著海南、廣東和云南等地人工大規(guī)模種植白木香面積的日益擴大，黃野螟的危害也越來越嚴重。有關(guān)黃野螟超氧化物歧化酶基因目前無人研究，本發(fā)明填補了這一空白，對深入研究黃野螟體內(nèi)活性氧調(diào)控機制及進一步探究黃野螟防止新方法奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供黃野螟超氧化物歧化酶基因全序列及其克隆方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

1、黃野螟總rna的提取

將外地采集的黃野螟活成蟲經(jīng)清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無菌去酶的ep管中，并置于-70℃低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。采用e.z.n.a.^tmtotalrnakitii總rna提取試劑盒(omega)來提取黃野螟的總rna。

2、引物設(shè)計和3′race擴增

在本實驗室構(gòu)建的cdna文庫中，查找并獲得了黃野螟超氧化物歧化酶基因的5′端序列，本發(fā)明是在此基礎(chǔ)之上進行3′race擴增，目的在于獲得黃野螟超氧化物歧化酶基因全序列。

3′race擴增的特異性引物為：

hv-sod-3′-outer：cagggattgtcaaagggc；

hv-sod-3′-inner：gcaacattgtggctggct。

3、目的基因克隆及測序

獲得的pcr產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收相應(yīng)目的dna片段，同pmd20-t載體進行連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到e.colidh5α感受態(tài)細胞之中，然后進行amp抗性藍白斑的篩選，挑取合適的陽性菌落進行質(zhì)粒提取。最后經(jīng)由菌落pcr鑒定后進行測序。

4、序列拼接

將測序正確的序列與實驗室已構(gòu)建的黃野螟cdna文庫中的超氧化物歧化酶基因序列進行不重復(fù)拼接，從而獲得超氧化物歧化酶基因全長序列。

黃野螟超氧化物歧化酶基因全長序列，此序列如下：

此序列中劃線處標示的atg為初始密碼子，劃線處標示的taa為終止密碼子。

根據(jù)黃野螟超氧化物歧化酶基因orf(openreadingframe)全序列，得到其氨基酸序列。該序列如下：

本發(fā)明獲得了黃野螟超氧化物歧化酶基因全序列。通過對黃野螟成蟲的預(yù)處理、總rna的提取、3′race擴增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了黃野螟超氧化物歧化酶基因全長序列，該序列全長1070bp，orf序列全長465bp，orf序列共編碼154個氨基酸。

具體實施方式

以下實施例將本發(fā)明進一步說明。

1、黃野螟總rna提取

黃野螟成蟲采自廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林區(qū)土沉香林。經(jīng)清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無菌去酶的ep管中，并置于-80℃低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

采用e.z.n.a.^tmtotalrnakitii總rna提取試劑盒進行黃野螟總rna的提取，具體步驟如下：

1)將黃野螟成蟲在液氮預(yù)冷過研缽中研磨至粉末，稱取大約0.1g樣品，然后放入1.5mlrnase-free離心管中。待液氮蒸發(fā)完后加入1mlrna-solvreagent至離心管中，室溫靜置4min。

2)往離心管里加入200μl氯仿，劇烈顛倒震蕩20s后插入冰中，冰上孵化10min。

3)在4℃條件下，12000r/min離心15min，離心后的樣品分三層：上層水相，中間層和下層有機相。

4)將上層水相的80％轉(zhuǎn)移到新的收集管中，加入1/3的無水乙醇，渦旋15s。

5)將上述全部混合液轉(zhuǎn)移至2ml帶有吸附柱的collectingtube中，室溫下，10000r/min離心1min，然后棄廢液。

6)重復(fù)前述步驟：室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。

7)將吸附柱重新放入新的2mlcollectiontube中，往里加入300μlrnawashbuffer1，在室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。

8)繼續(xù)往吸附柱里加入400μlrnawashbufferl，在室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。

9)繼續(xù)往吸附柱里加入500μlrnawashbuffer2，在室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。

10)重復(fù)前述步驟：往吸附柱里加入500μlrnawashbuffer2，在室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。再次室溫條件下13000r/min，離心2min。

洗脫rna，將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5μlrnase-free離心管中，往里加40μldepc。在室溫條件下13000r/min，離心2min，所得溶液即所需提取的總rna。

注意事項：上述rna實驗所涉及的試劑，須進行干熱滅菌(180℃，60min)處理，涉及到的一次性塑料容器、無菌水須進行高溫高壓滅菌處理。有關(guān)rna實驗使用所涉及到的試劑盒及無菌水都應(yīng)該專用，須避免混用之后所引起的交叉污染。

2、cdna3′末端擴增

參照3′fullracecoresetver.2.0kit試劑盒進行，具體操作步驟如下：

1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

反應(yīng)體系如下：

pcr反應(yīng)程序條件：42℃下反應(yīng)60min，70℃下反應(yīng)15min。

2)巢式pcr擴增

a)outerpcr擴增

反應(yīng)體系如下：

pcr反應(yīng)程序條件：94℃下預(yù)變性4min，94℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，設(shè)置20個循環(huán)，然后72℃下延伸10min。

b)innerpcr擴增

反應(yīng)體系如下：

pcr反應(yīng)程序條件：94℃下預(yù)變性4min，94℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，設(shè)置30個循環(huán)，然后72℃延伸10min。獲得的pcr產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測其擴增的效果。

3、目的基因克隆及測序

1)從瓊脂糖凝膠中回收dna片段

a)柱平衡：先將吸附柱cb2輕輕放進收集管中，往吸附柱cb2上方中緩慢加入500μl的平衡液bl，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱再次緩慢放回到收集管中。

b)將單一目的的dna條帶從瓊脂糖凝膠切下(盡量切除多余部分)，放入到事先已稱好重量的干凈離心管中，并再次稱取其重量。

c)向上述放有膠塊的離心管中加入與膠塊等倍體積的溶液pc(如果膠塊重量為0.1g，其等倍體積可看作是100μl，那么需要加入pc溶液的體積是100μl)，55℃水浴放置10-15min，在這期間須不間斷地緩慢翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。

d)將上述所得溶液緩慢加入到吸附柱cb2中(吸附柱預(yù)先放進收集管中)，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱再次緩慢放回到收集管中。

e)往吸附柱cb2里加入漂洗液pw600μl，室溫靜置5min后，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱cb2再次緩慢放回到收集管中。

f)往吸附柱cb2里再次加入漂洗液pw600μl，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液。

g)將吸附柱cb2再次放回到收集管里，在室溫條件下，12000r/min離心2min，盡可能地去掉漂洗液。然后將吸附柱放置在室溫條件5min左右，徹底晾干。

h)將吸附柱cb2再一次放回到收集管里，往其吸附膜的中間處懸空滴入適量的洗脫緩沖溶液eb，置于室溫3min，12000r/min離心2min，收集dna溶液。

i)將上述dna產(chǎn)物放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2)t載體連接

往pcr管中依次加入：pmd20-t載體1.0μl，前述目標dna產(chǎn)物3.0μl，去離子水1.0μl，solutioni溶液5.0μl，整個反應(yīng)體系體積為10.0μl。置于4℃冰箱中，放置過夜。

3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞

a)取感受態(tài)細胞于冰水浴中融化，并分管為每管50μl。

b)每管加入4.5μl的連接產(chǎn)物，輕彈混均。置于冰水30min。

c)離心管置于42℃水浴里，熱激90s。

d)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰水浴中，冷卻細胞5min(此過程不要搖動離心管)。

e)吸取900μl無菌lb培養(yǎng)基(不含抗生素)加入到離心管中，混勻。

f)在37℃條件下，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)45min。

g)將離心管里的內(nèi)容物充分混勻，吸取100μl已轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞加到已配制好的平板培養(yǎng)基上，用彎頭玻璃棒(無菌)緩慢地將細胞均勻涂抹開來，放于室溫直至培養(yǎng)基表面直至液體被完全吸收后，將培養(yǎng)基倒置，在37℃條件下，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-15h。

4)陽性重組子的鑒定及測序

a)在每個1.5ml的離心管中分別加入含氨芐的培養(yǎng)液600μl，每個平板都挑選出7個白色菌落與一個藍色菌落分別放入培養(yǎng)液中，37℃下，250r/min振蕩培養(yǎng)4h。取其菌液作為進行菌落pcr鑒定的模板。

b)菌落pcr

反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)程序條件為：94℃下3min；94℃下30s；55℃下30s，設(shè)置30個循環(huán)；72℃下1min；72℃下10min。反應(yīng)結(jié)束后吸取5μl的反應(yīng)產(chǎn)物，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實驗進行檢測。

c)將可能含有正確陽性重組子的克隆菌液送到生工生物公司進行測序。

4、將測序正確的序列與實驗室已構(gòu)建的黃野螟cdna文庫中的超氧化物歧化酶基因5′端序列進行不重復(fù)拼接，去掉相互重疊的部分，從而獲得了黃野螟超氧化物歧化酶基因全長序列。