本發(fā)明屬于干細(xì)胞培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)液及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUCMSCs)來(lái)源于臍帶華爾氏通膠，可在不同生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)下分化成來(lái)源于3個(gè)胚層的不同組織細(xì)胞類(lèi)型。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便，來(lái)源廣泛，無(wú)倫理學(xué)限制等優(yōu)勢(shì)，不表達(dá)主要組織相容性II類(lèi)抗原，微量表達(dá)主要組織相容性I類(lèi)抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫調(diào)節(jié)功效，移植后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子，具有促血管生成、促細(xì)胞生長(zhǎng)、抗炎癥和抗纖維化等作用。作為目前臨床干細(xì)胞中應(yīng)用較廣泛的干細(xì)胞，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞已開(kāi)展了多種類(lèi)型疾病的臨床應(yīng)用研究。傳統(tǒng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，添加動(dòng)物血清以供應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但會(huì)給干細(xì)胞的生產(chǎn)與科研帶來(lái)多種不利因素，如：批間差異較大，來(lái)源不穩(wěn)定，需要大量驗(yàn)證工作，價(jià)格昂貴，成分不明確，不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)品的分離純化，容易被病毒和支原體感染等。無(wú)血清培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入成分明確的血清替代成分，以滿足干細(xì)胞的培養(yǎng)要求，同時(shí)避免因使用血清帶來(lái)的諸多不利因素。血清替代成分較復(fù)雜，包括生長(zhǎng)因子、蛋白等營(yíng)養(yǎng)成分。無(wú)血清培養(yǎng)基是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞走向臨床應(yīng)用的重要條件，也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。中國(guó)專利申請(qǐng)CN105420182公開(kāi)了一種無(wú)血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括DMEM培養(yǎng)基、堿性成纖維生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素、白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、2-巰基乙醇、亞硒酸鈉和纖連蛋白等，通過(guò)添加較高含量的纖連蛋白實(shí)現(xiàn)了較好的貼壁性能，但細(xì)胞增殖速率較慢。中國(guó)專利申請(qǐng)CN104877963公開(kāi)了一種無(wú)血清的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分：重組人胰島素、重組轉(zhuǎn)鐵蛋白、維生素C、人血清白蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、纖維連接蛋白、胎球蛋白和β細(xì)胞素，通過(guò)添加纖維連結(jié)蛋白和胎球蛋白增強(qiáng)了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁性能，通過(guò)添加β細(xì)胞素維持人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的干細(xì)胞特性，組分較復(fù)雜，成本較昂貴。目前已有一些市售臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，如Gibco、賽業(yè)生物科技等公司的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，但存在價(jià)格昂貴、貼壁性能不夠理想等缺點(diǎn)，貼壁性能不佳會(huì)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化等一系列反應(yīng)產(chǎn)生影響。因此，提供一種成分較簡(jiǎn)單、貼壁性能優(yōu)良的無(wú)血清培養(yǎng)基以促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，通過(guò)添加少量的二氫楊梅素和兒茶素，可顯著提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁性能和增殖速率，利于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞特性保持，培養(yǎng)基的成分較簡(jiǎn)單，成本較低。本發(fā)明的目的將通過(guò)下面的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明提供一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM低糖培養(yǎng)基，還包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素。采用上述技術(shù)方案，以DMEM低糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在添加轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí)添加一定量的二氫楊梅素和兒茶素，兒茶素的濃度不宜過(guò)高，可顯著提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁性能和增殖速率，解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的貼壁性能不夠理想的問(wèn)題，利于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞特性保持，成脂和成骨誘導(dǎo)分化潛能佳，培養(yǎng)基的成分較簡(jiǎn)單，成本較低。雖然臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞都屬于干細(xì)胞，較多培養(yǎng)基成分可以通用，但仍對(duì)培養(yǎng)基有各自的要求，培養(yǎng)基成分的濃度也不盡相同。DMEM低糖培養(yǎng)基提供糖類(lèi)、L-谷氨酰胺和無(wú)機(jī)鹽等基礎(chǔ)物質(zhì)，為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的新陳代謝提供能量來(lái)源。轉(zhuǎn)鐵蛋白為細(xì)胞內(nèi)化和細(xì)胞代謝提供所需的鐵，起到鐵傳遞的作用。血清白蛋白可作為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，還可調(diào)節(jié)滲透壓，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。胰島素可提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的合成代謝能力，刺激細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。血小板衍生生長(zhǎng)因子(Plateletderivedgrowthfactor，PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor，TGF)則主要起到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生存維持和增殖刺激的作用。β-巰基乙醇具有抗氧化的作用，避免蛋白質(zhì)因氧化而失活。二氫楊梅素(dihydromyricelin，DMY)為葡萄屬植物藤茶的提取物，是藤茶中主要活性成分黃酮類(lèi)化合物，分子式為C15H12O8；現(xiàn)有研究表明，DMY具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基、消炎、止咳、祛痰、鎮(zhèn)痛、抑菌、抗高血壓、降脂、抗腫瘤、保肝護(hù)肝等諸多功效，未見(jiàn)將DMY用于干細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道。兒茶素(catechin)是茶湯中最主要的成分，呈苦澀味，通過(guò)從茶葉中提取得到，具有防治心血管疾病、控制肥胖、預(yù)防癌癥等多種功能，可以清除自由基，常用作抗氧化劑，在染料和鞣革工業(yè)也得到較廣泛的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為10～50μg/mL，所述血清白蛋白的濃度為0.5～5mg/mL，所述胰島素的濃度為10～50μg/mL，所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為10～50ng/mL，所述表皮生長(zhǎng)因子的濃度為10～50ng/mL，所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為10～50ng/mL，所述β-巰基乙醇的濃度為1～20μg/mL，所述二氫楊梅素的濃度為10～50μg/mL，所述兒茶素的濃度為1～20μg/mL。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為20～40μg/mL，所述血清白蛋白的濃度為1～3mg/mL，所述胰島素的濃度為15～30μg/mL，所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為15～30ng/mL，所述表皮生長(zhǎng)因子的濃度為15～30ng/mL，所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為15～30ng/mL，所述β-巰基乙醇的濃度為5～15μg/mL，所述二氫楊梅素的濃度為15～30μg/mL，所述兒茶素的濃度為5～15μg/mL。上述濃度是發(fā)明人經(jīng)大量試驗(yàn)篩選確定的優(yōu)選濃度，對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁、增殖和干細(xì)胞特性保持起到重要作用。更優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為25μg/mL，所述血清白蛋白的濃度為2mg/mL，所述胰島素的濃度為25μg/mL，所述血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，所述表皮生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，所述β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，所述二氫楊梅素的濃度為25μg/mL，所述兒茶素的濃度為10μg/mL。優(yōu)選地，所述胰島素為重組胰島素，所述血小板衍生生長(zhǎng)因子為PDGF-BB，所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1。優(yōu)選地，所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基還包括青霉素和/或鏈霉素。更優(yōu)選地，青霉素的濃度為100U/mL，鏈霉素的濃度為0.1mg/mL。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：取DMEM低糖培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素，攪拌均勻，經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌，得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述制備方法還包括加入青霉素和/或鏈霉素的步驟。此外，本發(fā)明還提供了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括：本發(fā)明提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，通過(guò)添加少量的二氫楊梅素和兒茶素，可顯著提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁性能和增殖速率，解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的貼壁性能不夠理想的問(wèn)題，利于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和干細(xì)胞特性保持，成脂和成骨誘導(dǎo)分化潛能佳，培養(yǎng)基的成分較簡(jiǎn)單，成本較低，實(shí)現(xiàn)了二氫楊梅素和兒茶素在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方面的應(yīng)用，也為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)提供了新的選擇，綜合性能優(yōu)于含胎牛血清的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法簡(jiǎn)單，可以制得質(zhì)量穩(wěn)定的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基。附圖說(shuō)明圖1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞使用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的增殖曲線。圖2實(shí)施例一組的培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCMSCs至第5代的細(xì)胞形態(tài)圖。圖3成脂細(xì)胞相關(guān)基因FABP4的相對(duì)表達(dá)水平結(jié)果圖。圖4成骨細(xì)胞相關(guān)基因OPN的相對(duì)表達(dá)水平結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。本發(fā)明中，所涉及的組分、試劑和試劑盒均為常規(guī)市售產(chǎn)品，或可通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段獲得，如DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，貨號(hào)11885-076。實(shí)施例一臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM低糖培養(yǎng)基，還包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素；轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，胰島素的濃度為25μg/mL，血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，二氫楊梅素的濃度為25μg/mL，兒茶素的濃度為10μg/mL。本發(fā)明中，各組分的濃度均以臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的終體積計(jì)。制備方法：取DMEM低糖培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素，攪拌均勻，經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌，得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。實(shí)施例二臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM低糖培養(yǎng)基，還包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素；轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為40μg/mL，血清白蛋白的濃度為1mg/mL，胰島素的濃度為30μg/mL，血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為30ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為15ng/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為20ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為5μg/mL，二氫楊梅素的濃度為30μg/mL，兒茶素的濃度為15μg/mL。制備方法：取DMEM低糖培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素，攪拌均勻，經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌，得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。實(shí)施例三臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM低糖培養(yǎng)基，還包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素；轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為20μg/mL，血清白蛋白的濃度為3mg/mL，胰島素的濃度為20μg/mL，血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為20ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為20ng/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為10ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為20μg/mL，二氫楊梅素的濃度為10μg/mL，兒茶素的濃度為5μg/mL。制備方法：取DMEM低糖培養(yǎng)基，加入轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素，攪拌均勻，經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌，得到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)比例1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM低糖培養(yǎng)基，還包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇和二氫楊梅素；轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，胰島素的濃度為25μg/mL，血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，二氫楊梅素的濃度為25μg/mL。制備方法同實(shí)施例一。對(duì)比例1與實(shí)施例一的區(qū)別在于：不含兒茶素。對(duì)比例2臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM低糖培養(yǎng)基，還包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇和兒茶素；轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，胰島素的濃度為25μg/mL，血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，兒茶素的濃度為10μg/mL。制備方法同實(shí)施例一。對(duì)比例2與實(shí)施例一的區(qū)別在于：不含二氫楊梅素。對(duì)比例3臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM低糖培養(yǎng)基，還包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和β-巰基乙醇；轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，胰島素的濃度為25μg/mL，血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL。制備方法同實(shí)施例一。對(duì)比例3與實(shí)施例一的區(qū)別在于：不含二氫楊梅素和兒茶素。對(duì)比例4臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基，包括DMEM低糖培養(yǎng)基，還包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清白蛋白、胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、β-巰基乙醇、二氫楊梅素和兒茶素；轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為25μg/mL，血清白蛋白的濃度為2mg/mL，胰島素的濃度為25μg/mL，血小板衍生生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，表皮生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的濃度為25ng/mL，β-巰基乙醇的濃度為10μg/mL，二氫楊梅素的濃度為25μg/mL，兒茶素的濃度為30μg/mL。制備方法同實(shí)施例一。對(duì)比例4與實(shí)施例一的區(qū)別在于：兒茶素的濃度由10μg/mL變?yōu)?0μg/mL。試驗(yàn)例一臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁檢測(cè)取未經(jīng)包被的24孔板，設(shè)置實(shí)施例一組、實(shí)施例二組、實(shí)施例三組、對(duì)比例1組、對(duì)比例2組、對(duì)比例3組、對(duì)比例4組和陽(yáng)性對(duì)照組，分別加入實(shí)施例一、實(shí)施例二、實(shí)施例三、對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3、對(duì)比例4的無(wú)血清培養(yǎng)基以及含10％FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔接種1×105個(gè)第3代hUCMSCs，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2h，棄去培養(yǎng)基，使用PBS沖洗去除未貼壁細(xì)胞，然后進(jìn)行消化并收集計(jì)數(shù)，結(jié)果如表1所示。表1不同無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞貼壁檢測(cè)結(jié)果從表1可知，本發(fā)明提供的無(wú)血清培養(yǎng)基能顯著促進(jìn)hUCMSCs的貼壁，與陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞貼壁數(shù)相當(dāng)，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)比例3組(未添加二氫楊梅素和兒茶素)的hUCMSCs貼壁數(shù)最少，貼壁性能較差，說(shuō)明無(wú)血清培養(yǎng)基中所含有的胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等無(wú)法顯著提高h(yuǎn)UCMSCs的貼壁性能；對(duì)比例2組(未添加二氫楊梅素)的hUCMSCs貼壁性能較差，說(shuō)明添加兒茶素的添加無(wú)法顯著提高h(yuǎn)UCMSCs的貼壁性能；對(duì)比例1組(未添加兒茶素)的hUCMSCs貼壁性能一般，優(yōu)于對(duì)比例2組和對(duì)比例3組，但遠(yuǎn)不如本發(fā)明的實(shí)施例一至三組(P＜0.01)，說(shuō)明二氫楊梅素的添加可以顯著促進(jìn)hUCMSCs的貼壁，但效果遠(yuǎn)不如二氫楊梅素和兒茶素同時(shí)添加；而對(duì)比例4組(兒茶素的濃度較高)雖然也能顯著促進(jìn)hUCMSCs的貼壁，但效果遠(yuǎn)不如本發(fā)明的實(shí)施例一至三組(P＜0.01)。通過(guò)對(duì)比各試驗(yàn)組，可以發(fā)現(xiàn)：對(duì)比例2組和對(duì)比例3組不利于hUCMSCs的貼壁，難以實(shí)現(xiàn)后續(xù)的快速增殖；一定含量二氫楊梅素和兒茶素的共同添加起到了協(xié)同促進(jìn)hUCMSCs貼壁的效果，兒茶素的濃度不宜過(guò)高。試驗(yàn)例二hUCMSCs的細(xì)胞增殖檢測(cè)將第3代hUCMSCs以5000個(gè)/mL的密度接種到6孔板中，每孔接種2mL，設(shè)置實(shí)施例一組、實(shí)施例二組、對(duì)比例1組、對(duì)比例4組和陽(yáng)性對(duì)照組，分別加入實(shí)施例一、實(shí)施例二、對(duì)比例1、對(duì)比例4的無(wú)血清培養(yǎng)基以及含10％FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天進(jìn)行換液，連續(xù)培養(yǎng)9天，培養(yǎng)過(guò)程中使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，且每天分別將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.25％胰酶消化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時(shí)間的增殖曲線如圖1所示。從圖1可知，本發(fā)明實(shí)施例一提供的無(wú)血清培養(yǎng)基所培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速率明顯優(yōu)于對(duì)比例1組和對(duì)比例4組，且優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)施例一組的培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCMSCs至第5代的細(xì)胞形態(tài)如圖2所示，細(xì)胞呈梭形。試驗(yàn)例三hUCMSCs的細(xì)胞表型檢測(cè)使用實(shí)施例一的培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCMSCs至第10代，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌后用0.25％胰酶消化，離心后制成懸液，加入單克隆抗體，孵育后，洗滌，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CD73和CD90等的表達(dá)水平，結(jié)果如表2所示。從表2可知，使用本發(fā)明提供的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)hUCMSCs至第10代的細(xì)胞表型中CD73、CD90和CD105等的陽(yáng)性率均大于96％，且CD34、CD45和HLA-DR等的陽(yáng)性率均小于1％，說(shuō)明hUCMSCs的干細(xì)胞特性保持良好。表2使用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的hUCMSCs表型檢測(cè)結(jié)果分子表型表達(dá)水平/％CD7399.14±0.57CD9098.36±0.41CD10599.02±0.61CD16696.58±0.52HLA-ABC97.80±0.46CD140.37±0.04CD190.58±0.05CD340.21±0.03CD450.53±0.07HLA-DR0.36±0.04試驗(yàn)例四hUCMSCs的成脂、成骨誘導(dǎo)分化將第10代hUCMSCs以5000個(gè)/mL的密度接種到6孔板中，每孔接種2mL，分別用實(shí)施例一的無(wú)血清培養(yǎng)基、陽(yáng)性對(duì)照組(含10％FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％匯合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，分別加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)3周后，收集hUCMSCs并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，用采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀成脂細(xì)胞相關(guān)基因FABP4的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。此外，分別加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)4周后，收集hUCMSCs并提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，用采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀成骨細(xì)胞相關(guān)基因OPN的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。從圖3和圖4可知，本發(fā)明提供的無(wú)血清培養(yǎng)基所培養(yǎng)的hUCMSCs成脂、成骨誘導(dǎo)分化潛能好，略優(yōu)于含動(dòng)物血清的培養(yǎng)基。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3