本發(fā)明屬于植物培養(yǎng)基
技術領域：
，具體涉及一種紅景天細胞培養(yǎng)基。背景內(nèi)容長鞭紅景天RhodiolafastigiataS.H.Fu為景天科(Crassulaceae)紅景天屬RhodiolaL.植物，其根及根莖主要含有紅景天苷等次生代謝產(chǎn)物，具有抗疲勞、抗衰老、抗缺氧、抗微波輻射及抗腫瘤等功效，是極具開發(fā)前景的環(huán)境適應藥物之一，亦是我國傳統(tǒng)名貴藥材珍品。由于受到需求遞增、生態(tài)環(huán)境日漸退化雙重因素的影響，紅景天野生資源正日益稀竭，部分物種幾近滅絕。紅景天組織培養(yǎng)經(jīng)過了幾十年的研究雖有很大的進展，但還滿足不了紅景天的進一步開發(fā)利用的需要。獲得高產(chǎn)細胞系是實現(xiàn)長鞭紅景天大規(guī)模生產(chǎn)的前提，而細胞系的獲得往往需要一種細胞培養(yǎng)基。而目前對紅景天培養(yǎng)基的研究主要集中在愈傷組織的培養(yǎng)及芽誘導培養(yǎng)，如中國專利申請(CN101831398A)公布了一種添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養(yǎng)基及制法和用途，技術方案為：向配制MS基本培養(yǎng)基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混合均勻，用無機酸或無機堿調(diào)節(jié)混合液的pH為5.6～5.8，高溫濕熱滅菌后加入經(jīng)過濾除菌的二甲基亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養(yǎng)基中含有細胞分裂素BAP的濃度為1μmol·L-1～20μmol·L-1，生長素NAA的濃度為0.1μmol·L-1～5μmol·L-1，二甲基亞砜的濃度為0.001mL·L-1～20mL·L-1。中國專利申請(CN101773070A)公開了一種紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟：植物體的選擇及無菌處理、愈傷組織誘導培養(yǎng)和大規(guī)模培養(yǎng)三個環(huán)節(jié)，其核心技術是愈傷組織誘導培養(yǎng)，是在基本培養(yǎng)基MS添加蔗糖0-50g/L，瓊脂0-10g/L，α-萘乙酸0.1-5.0mg/L，6-芐氨基嘌呤0.1-5.0mg/L的基礎上，加入非生物誘導子硝普鈉SNP和硝酸銀。因此，目前亟需一種紅景天細胞培養(yǎng)基，為獲得高產(chǎn)紅景天細胞系提供基礎，有助于紅景天大規(guī)模培養(yǎng)和次級代謝物的大量生產(chǎn)。技術實現(xiàn)要素：為獲得紅景天高產(chǎn)細胞系，實現(xiàn)紅景天大規(guī)模培養(yǎng)和次級代謝物的大量生產(chǎn)，本發(fā)明提供了一種紅景天細胞培養(yǎng)基。本發(fā)明培養(yǎng)基能顯著提高紅景天細胞生物量和紅景天苷的積累量，并且培養(yǎng)基成分簡單，生產(chǎn)成本低，可達到產(chǎn)業(yè)化水平，能夠?qū)崿F(xiàn)紅景天的大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明紅景天細胞培養(yǎng)基是通過以下技術方案實現(xiàn)的：一種紅景天細胞培養(yǎng)基，基礎培養(yǎng)基中主要添加由以下成分及其終濃度：蔗糖20-40g/L，6-芐氨基嘌呤1-5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.05-0.15mg/L，α-萘乙酸0.1-0.5mg/L，酪醇1-20mmol/L，硝酸銀10-80μmol/L，硝酸銨10-80μmol/L。優(yōu)選地，基礎培養(yǎng)基中添加由以下成分及其終濃度：蔗糖32g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸銀68μmol/L，硝酸銨32μmol/L。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基初始pH為5.7-5.9。優(yōu)選地，所述基礎培養(yǎng)為MS培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述紅景天細胞培養(yǎng)基適用于細胞懸浮培養(yǎng)體系。本發(fā)明紅景天細胞培養(yǎng)基根據(jù)紅景天細胞生長特性，經(jīng)過大量實驗篩選得到本發(fā)明培養(yǎng)基組成成分及其濃度。碳源的形式和質(zhì)量濃度對愈傷組織細胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的量有明顯影響，一般采用蔗糖、果糖和葡萄糖作為碳源。本發(fā)明技術人員選擇了蔗糖作為紅景天細胞生長所需的碳源，確定了蔗糖濃度的使用范圍，并篩選得到了最佳的使用濃度為32g/L。激素是調(diào)節(jié)植物細胞生長發(fā)育和代謝產(chǎn)物形成的主要物質(zhì)，在本發(fā)明培養(yǎng)基中，6-芐氨基嘌呤，2,4-二氯苯氧乙酸和α-萘乙酸相互作用，并在相應的濃度范圍內(nèi)能夠起到促進紅景天細胞生長和紅景天苷等次級代謝物的產(chǎn)生。本發(fā)明技術人員發(fā)現(xiàn)，在細胞培養(yǎng)基中加入酪醇能夠促進紅景天苷的形成。經(jīng)過實驗證明當初始培養(yǎng)基中酪醇濃度為1-20mmol/L時，促進紅景天苷形成效果明顯，其中酪醇濃度為12mmol/L時效果最佳。氮元素不僅是植物細胞的重要組成元素，也是一些次級代謝產(chǎn)物的組成元素，如生物堿。雖然，紅景天苷中不直接含有N元素，但因其為苯丙氨酸的衍生物，故氮素供應的形式以及作用質(zhì)量濃度從理論上講都可以影響紅景天苷的代謝。NH4+/NO3-的比值和量與植物細胞生長和次生代謝累積關系密切，本發(fā)明技術人員發(fā)現(xiàn)，當細胞培養(yǎng)基中NH4+/NO3-比值為1:2.5時，對紅景天苷的合成促進作用最大。本發(fā)明紅景天細胞培養(yǎng)基與現(xiàn)有培養(yǎng)基相比，具有以下優(yōu)勢：(1)本發(fā)明培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的紅景天細胞生物量是對比例培養(yǎng)基中的2.5倍，紅景天苷的積累量是對比例培養(yǎng)基中的3.6倍，本發(fā)明紅景天細胞培養(yǎng)基對紅景天細胞生長和次級代謝物的積累具有突出的作用效果。(2)本發(fā)明紅景天細胞培養(yǎng)基成分簡單，生產(chǎn)成本低，可達到產(chǎn)業(yè)化水平，能夠?qū)崿F(xiàn)紅景天的大規(guī)模生產(chǎn)。附圖說明圖1：實施例1-3及對比例1-3培養(yǎng)基中紅景天細胞的生物量比較。圖2：實施例1-3及對比例1-3培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的愈傷組織顆粒中紅景天苷的含量的比較。具體實施方式以下通過具體實施方式的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實施例1一種紅景天細胞培養(yǎng)基一種紅景天細胞培養(yǎng)基，其向基礎培養(yǎng)基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖32g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸銀48μmol/L，硝酸銨32μmol/L。紅景天細胞培養(yǎng)基的制備方法：稱取相應質(zhì)量的蔗糖，6-芐氨基嘌呤，2,4-二氯苯氧乙酸，α-萘乙酸，酪醇，硝酸銀，硝酸銨依次加入到MS培養(yǎng)基中，攪拌均勻，將pH調(diào)整至5.8，120℃滅菌20min，即得。實施例2一種紅景天細胞培養(yǎng)基一種紅景天細胞培養(yǎng)基，其向基礎培養(yǎng)基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖20g/L，6-芐氨基嘌呤1mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，α-萘乙酸0.1mg/L，酪醇1mmol/L，硝酸銀10μmol/L，硝酸銨10μmol/L。制備方法與實施例1類似。實施例3一種紅景天細胞培養(yǎng)基一種紅景天細胞培養(yǎng)基，其向基礎培養(yǎng)基B5中添以下成分及其終濃度：蔗糖40g/L，6-芐氨基嘌呤5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.15mg/L，α-萘乙酸0.5mg/L，酪醇20mmol/L，硝酸銀80μmol/L，硝酸銨80μmol/L。制備方法與實施例1類似。對比例1一種紅景天細胞培養(yǎng)基一種紅景天細胞培養(yǎng)基，其向基礎培養(yǎng)基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖50g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸銀48μmol/L，硝酸銨32μmol/L。制備方法與實施例1類似。與實施例1的區(qū)別在于，培養(yǎng)基中蔗糖濃度為50g/L。對比例2一種紅景天細胞培養(yǎng)基一種紅景天細胞培養(yǎng)基，其向基礎培養(yǎng)基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖32g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇24mmol/L，硝酸銀48μmol/L，硝酸銨32μmol/L。制備方法與實施例1類似。與實施例1的區(qū)別在于，培養(yǎng)基中酪醇濃度為24mmol/L。對比例3一種紅景天細胞培養(yǎng)基一種紅景天細胞培養(yǎng)基，其向基礎培養(yǎng)基MS中添以下成分及其終濃度：蔗糖32g/L，6-芐氨基嘌呤4.5mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸0.08mg/L，α-萘乙酸0.43mg/L，酪醇12mmol/L，硝酸銀32μmol/L，硝酸銨32μmol/L。制備方法與實施例1類似。與實施例1的區(qū)別在于，培養(yǎng)基中NH4+/NO3-比例為1:2。試驗例1細胞生物量的測定以長鞭紅景天實生苗幼莖作為外植體誘導產(chǎn)生愈傷組織，生長旺盛的愈傷組織繼代培養(yǎng)20天分別加入實施例1-3、對比例1-3制備得到的培養(yǎng)基中，建立細胞懸浮培養(yǎng)體系。細胞懸浮培養(yǎng)系每隔10天繼代1次。培養(yǎng)基初始pH為5.8。培養(yǎng)室內(nèi)光周期為14h/d，培養(yǎng)溫度為24℃，搖床轉(zhuǎn)速為110r/min。將上述試驗例1收獲得到的各小細胞團分別用5倍體積的蒸餾水充分洗滌3次，抽干表面水分，稱其鮮質(zhì)量，后于60℃烘箱中烘至恒質(zhì)量，放入干燥器內(nèi)冷卻，稱其干質(zhì)量。具體結(jié)果如表1所示。表1不同培養(yǎng)基中細胞生物量的變化培養(yǎng)基細胞生物量(g/L)實施例132.5±1.25實施例228±0.89實施例327±0.65對比例113±1.22對比例215±0.37對比例320±0.87由表1可知，利用實施例培養(yǎng)基得到的紅景天細胞量明顯高于對比例培養(yǎng)基，其中實施例1培養(yǎng)基中得到的細胞生物量是對比例1中的2.5倍。由此可知，本發(fā)明紅景天細胞培養(yǎng)基能明顯促進紅景天細胞的生長。各培養(yǎng)基中細胞生物量的比較如圖1所示。試驗例2紅景天苷的提取及測定將各培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的長鞭紅景天愈傷組織顆粒65℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎(過40目篩)，75％乙醇浸提12h，后于90℃水浴中回流提取40min，加入5倍紅景天體積75％乙醇。提取液用4層紗布濾過。濾液減壓蒸餾(70℃，7kPa)除去大部分乙醇，上AB-8樹脂柱，20％乙醇洗脫，洗脫體積流量為5mL/min，收集洗脫液再經(jīng)二次減壓蒸餾(70℃，7kPa)除去大部分乙醇，冷凍干燥，得淺棕色固體，待用。HPLC法測定紅景天苷量，結(jié)果如表2所示。表2不同培養(yǎng)基愈傷組織中紅景天苷的含量培養(yǎng)基紅景天苷的含量(紅景天苷量/細胞干質(zhì)量mg/g)實施例123.4±0.39實施例219.7±0.57實施例317.2±0.91對比例16.5±0.43對比例28.6±0.64對比例37.8±0.32由表2可知，利用實施例培養(yǎng)基得到的組織中紅景天苷含量明顯高于對比例培養(yǎng)基，其中實施例1培養(yǎng)基中得到的是對比例1中的3.6倍。由此可知，本發(fā)明紅景天細胞培養(yǎng)基能明顯促進紅景天細胞中次級代謝物紅景天苷的生成。各培養(yǎng)基愈傷組織中紅景天苷的含量比較如圖2所示。當前第1頁1 2 3