本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種含有L-脯氨酰胺片段的化合物及其制備方法和應用，為抗腫瘤藥物的開發(fā)和應用提供了新的選擇。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的疾病之一。根據(jù)2013年全國腫瘤登記結(jié)果，中國惡性腫瘤發(fā)病率為235/10萬，肺癌和乳腺癌分別位居男、女性發(fā)病首位，十年來中國惡性腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病率與世界水平接近。但是，惡性腫瘤死亡率高于世界水平，2012年中國惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)為306.5萬，約占全球發(fā)病的五分之一；惡性腫瘤死亡人數(shù)為220.5萬，約占全球惡性腫瘤死亡人數(shù)的四分之一。在美國，惡性腫瘤患者的5年生存率大約在60％至70％，而我國惡性腫瘤患者5年生存率大約在30％左右。

目前，臨床對于惡性腫瘤的治療，一般有外科手術(shù)、放射治療及藥物化療等。其中藥物化療可以針對局部性和擴散性癌變組織，臨床上應用十分廣泛。但是，傳統(tǒng)的藥物選擇性較差，在殺死腫瘤細胞的同時也會殺死正常組織的細胞，導致明顯的毒副作用。因此，研究開發(fā)新結(jié)構(gòu)類型的抗腫瘤藥物具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤患者中存在PI3K信號轉(zhuǎn)導通路的異常調(diào)節(jié)。形成PI3K通路異常調(diào)節(jié)的原因包括抑癌基因PTEN的缺失，受體酪氨酸激酶的擴增或過度活化(例如：erbB3，erbB2，EGFR)，Akt基因區(qū)域或PIK3CA基因的擴增。特別是在很多腫瘤患者中存在PIK3CA突變。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，32％的結(jié)腸直腸癌患者，27％的惡性膠質(zhì)瘤患者，25％的胃癌患者，36％的肝癌患者，18～40％的乳腺癌患者中存在PIK3CA突變，尚未發(fā)現(xiàn)PIK3CB，PIK3CD和PIK3CG突變。另外，PIK3CA中存在兩個主要的突變位點E545K和H1047R，其中Glu545在螺旋區(qū)域(外顯子9)，His1047在PI3Kα的催化區(qū)域(外顯子10)。

研究表明，在腫瘤細胞中，PIK3CA基因敲除后，會阻斷信號轉(zhuǎn)導通路，阻礙細胞生長；在小鼠體內(nèi)，刪除純合子p110α后會導致小鼠胚胎壞死。進一步說明了PI3Kα靶標的重要性。目前，已有一些PI3Kα抑制劑被報道，例如PIK75、A66S、MLN1117、BYL719等，它們都在動物模型中表現(xiàn)出很好的抑制腫瘤的作用，其中MLN1117和BYL719已進入臨床研究。

因此，設(shè)計并合成一系列新的具有抗腫瘤作用的化合物，尤其是對PI3Kα具有抑制作用的抗腫瘤化合物，對抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)及日后的臨床應用具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種含有L-脯氨酰胺片段的化合物及其制備方法和應用，該類化合物具有抗腫瘤活性，可應用于抗腫瘤藥物的制備，而且其合成原料易得、合成方法容易實現(xiàn)。

為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供了一種含有L-脯氨酰胺片段的化合物，包括含有L-脯氨酰胺片的5-芳基吡啶類化合物、含有L-脯氨酰胺片的5-芳基吡嗪類化合物和含有L-脯氨酰胺片的6-芳基苯并噻唑類化合物；所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的結(jié)構(gòu)式為：

其中，R為取代苯基或取代吡啶基；X為C或N；R¹為取代苯基、取代吡啶基或取代嘧啶基。

式(1)中，當X為C時，該化合物為含有L-脯氨酰胺片的5-芳基吡啶類化合物，其中R為3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶基、N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰氨基、N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰氨基、5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基、3-三氟甲基-4-氯苯基、3-三氟甲氧基-4-氯苯基、4-吡啶基或3-吡啶基；

式(1)中，當X為N時，該化合物為含有L-脯氨酰胺片的5-芳基吡嗪類化合物，其中R為3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶基、N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰氨基、N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰氨基、5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基、3-三氟甲基-4-氯苯基、3-三氟甲氧基-4-氯苯基或4-(1H-1-吡唑基)苯基；

式(2)為含有L-脯氨酰胺片的6-芳基苯并噻唑類化合物，其中R¹為3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶基、2-甲氧基-3-甲磺酰氨基-5-溴吡啶基、5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基、3-三氟甲基-4-氯苯基、3-三氟甲氧基-4-氯苯基、2-三氟甲基-5-溴吡啶、2-甲氧基-5-溴吡啶、3-甲氧基-5-溴吡啶、2-氨基-5-溴吡啶、2-氨基-5-溴嘧啶、3-羥基苯基或3-羥甲基苯基。

所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，制備含脲的母核：

2-氨基-5-溴吡啶與CDI和L-脯氨酰胺發(fā)生兩步縮合反應得到含脲的母核(S)-N¹-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺；

或者2-氨基-5-溴吡嗪與三光氣和L-脯氨酰胺發(fā)生兩步縮合反應得到含脲的母核(S)-N¹-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺；

或者2-氨基-6-溴苯并噻唑與CDI和L-脯氨酰胺發(fā)生兩步縮合反應得到含脲的母核(S)-N¹-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺；

步驟2，制備中間體：

對氟苯磺酰氯與3-氨基-2-氯-5-溴吡啶或2-氯-5-溴苯胺經(jīng)磺?；八夥磻玫街虚g體3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶或N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰胺；

或者對氟苯胺與2-氯-5-溴苯磺酰氯發(fā)生磺?；磻玫街虚g體N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺。

步驟3，制備目標化合物：

步驟2制得的中間體與雙頻哪醇硼酸酯反應得到芳烴硼酸酯；芳烴硼酸酯再與步驟1制得的含脲的母核發(fā)生Suzuki偶聯(lián)反應，得到含有L-脯氨酰胺片段的化合物。

所述步驟1的具體操作為：將2-氨基-5-溴吡啶和CDI溶解于溶劑二氧六環(huán)中，在氮氣保護下進行反應，反應結(jié)束后冷卻至室溫，加入L-脯氨酰胺和TEA，室溫下攪拌進行反應，反應結(jié)束后旋蒸除去溶劑，再加入水抽濾，濾餅烘干后經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，得到含脲的母核(S)-N¹-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺；

或者將三光氣溶解于溶劑二氯甲烷中，在冰浴條件下向其中滴加2-氨基-5-溴吡嗪的二氯甲烷溶液，滴完后撤去冰浴，室溫下攪拌進行反應，反應結(jié)束后再加入L-脯氨酰胺的二氯甲烷溶液和TEA，室溫下攪拌繼續(xù)進行反應，反應結(jié)束后旋蒸除去溶劑，用乙酸乙酯萃取，萃取的有機相經(jīng)洗滌、干燥后用硅膠柱色譜分離純化，得到含脲的母核(S)-N¹-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺；

或者稱取2-氨基-6溴苯并噻唑和CDI，加入DMF作為溶劑，室溫下攪拌進行反應，反應結(jié)束后抽濾，將濾餅放入反應容器中，加入L-脯氨酰胺和DMF，室溫下攪拌繼續(xù)進行反應，反應結(jié)束后，加水析出沉淀并抽濾，濾餅烘干后經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，得到含脲的母核(S)-N¹-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺。

所述步驟2的具體操作為：稱取3-氨基-2-氯-5-溴吡啶或2-氯-5-溴苯胺，加入對氟苯磺酰氯，再加入吡啶進行反應，反應結(jié)束后冷卻至室溫，加水析出固體并抽濾，將濾餅放入反應容器中，加入無水K₂CO₃、水和甲醇，室溫下攪拌進行反應，反應結(jié)束后旋蒸除去溶劑，經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，得到中間體3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶或N-(2-氯-5-溴苯基)-4-氟苯磺酰胺；

或者稱取2-氯-5-溴苯磺酰氯和對氟苯胺，加入二氯甲烷和吡啶，室溫下攪拌進行反應，反應結(jié)束后旋蒸除去二氯甲烷，加水，抽濾，濾餅烘干后經(jīng)硅膠柱色譜分離純化，得到中間體N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺。

所述步驟3的具體操作為：稱取中間體，加入雙頻哪醇硼酸酯、乙酸鉀和Pd(dppf)Cl₂，再加入二氧六環(huán)，氮氣保護下加熱回流反應，反應結(jié)束后冷卻至室溫，得到芳烴硼酸酯，再加入含脲的母核、碳酸鉀、Pd(dppf)Cl₂和水，氮氣保護下加熱回流反應，反應結(jié)束后冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，再經(jīng)硅膠色譜柱分離純化，即得到含有L-脯氨酰胺片段的化合物。

所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。

所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在制備具有PI3Kα抑制作用的抗腫瘤藥物中的應用。

所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在制備抗結(jié)腸癌藥物和/或抗乳腺癌藥物中的應用。

所述的含有L-脯氨酰胺片段的化合物添加輔料制成片劑、膠囊劑、軟膠囊劑或注射劑，其中每片、每?；蛎恐е苿┲泻?0～500mg的含有L-脯氨酰胺片段的化合物；所述的輔料包括添加劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、潤滑劑、崩解劑中的一種或幾種。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物，包括含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡啶類化合物、含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡嗪類化合物和含有L-脯氨酰胺片段的6-芳基苯并噻唑類化合物，是以吡啶、吡嗪和苯并噻唑作為母核，并在母核上連接L-脯氨酰胺片段后得到的。藥理學實驗表明，本發(fā)明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物在多種腫瘤細胞株上具有良好的抑制活性，具有較強的體外抗腫瘤活性，可應用于抗腫瘤藥物的制備，為抗腫瘤藥物的開發(fā)和應用提供了新的選擇，還可進一步應用于抗腫瘤藥物的設(shè)計與優(yōu)化。

本發(fā)明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物的制備方法，先以2-氨基-5-溴吡啶、2-氨基-5-溴吡嗪和2-氨基-6-溴苯并噻唑作為起始化合物，經(jīng)兩步縮合反應得到含脲的母核，然后制備出需要在母核5位或6位上引入的中間體，中間體與雙頻哪醇硼酸酯反應得到芳烴硼酸酯后再與母核發(fā)生Suzuki偶聯(lián)反應，即得到目標化合物。該方法具有原料易得、反應條件溫和、合成方法容易實現(xiàn)、反應過程操作簡單、所用試劑便宜、產(chǎn)率較高的優(yōu)點。

進一步的，藥理學研究表明，本發(fā)明提供的含有L-脯氨酰胺片段的6-芳基苯并噻唑類化合物在100nmol/L時對PI3Kα的抑制作用明顯，且對腫瘤細胞HCT-116和MDA-MB-453有明顯的增殖抑制活性。

進一步的，藥理學研究表明，本發(fā)明制備的化合物T₂₃具有對PI3Kα的選擇性，且在HCT116和MDA-MB-453上表現(xiàn)出明顯的抑制活性?；衔颰₁₆-T₁₈、T₂₁-T₂₇在100nmol/L時對PI3Kα的抑制作用明顯，其中T₁₆、T₁₇和T₂₃對PI3Kα的IC₅₀值達到納摩爾級別?；衔颰₄-T₆對HCT116的半數(shù)抑制濃度均小于10μmol/L，化合物T₁₆-T₂₇對HCT116和MDA-MB-453兩株細胞的半數(shù)抑制濃度均小于或接近10μmol/L。化合物T₁₆、T₁₈-T₂₀和T₂₃對HCT116的抑制活性與陽性藥BYL719相當，化合物T₁₆、T₁₇和T₂₂-T₂₅對MDA-MB-453的抑制活性與陽性藥BYL719相當。

進一步的，本發(fā)明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物，能夠用于制備抗腫瘤藥物制劑，其中每片、每?；蛎恐幬镏苿┲泻?0-500mg含有L-脯氨酰胺片段的化合物。在利用本發(fā)明的含有L-脯氨酰胺片段的化合物制備抗腫瘤藥物制劑時，可以將該藥物制成片劑、膠囊劑、軟膠囊劑或注射劑。這些藥物制劑可按照各種制劑的常規(guī)制備工藝制成。對于片劑或膠囊劑，優(yōu)選的含量為20-150mg。并且本發(fā)明涉及的口服制劑中可含有藥用輔料，包括添加劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、潤滑劑、崩解劑等，如淀粉、糊精、葡萄糖、乳糖、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、果膠、環(huán)糊精、土溫-80、聚乙烯醇、硬脂酸鎂、滑石粉等。

具體實施方式

本發(fā)明提供的含有L-脯氨酰胺片段的化合物，包括含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡啶類化合物、含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡嗪類化合物和含有L-脯氨酰胺片段的6-芳基苯并噻唑類化合物，具有原料易得、反應條件溫和、反應過程操作簡單的特點。其中本發(fā)明提供的含有L-脯氨酰胺片段的6-芳基苯并噻唑類化合物具有較強的抗腫瘤活性，可進一步應用于抗腫瘤藥物的設(shè)計與優(yōu)化。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳細的說明，實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。盡管用較佳的實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解，在不脫離本發(fā)明的范圍下可以對本發(fā)明進行修改、變形或等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1(S)-N¹-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-吡啶基}-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁)的制備

(1)(S)-N¹-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺的合成

稱取2-氨基-5-溴吡啶1.0g(5.78mmol)和CDI 3.75g(23.12mmol)于100mL茄形瓶中，再加入15mL二氧六環(huán)作為溶劑，氮氣保護，80℃反應12h，冷卻至室溫，加入1.98g(17.34mmol)L-脯氨酰胺和1mL TEA，室溫攪拌5h，停止反應，旋蒸除去溶劑，加水后抽濾，取濾餅烘干，硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝30/1，得1.20g白色晶體，產(chǎn)率66.30％。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ8.86(s,1H,-CONHAr),8.34(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.91(dd,1H，J＝2.0Hz,J＝8.0Hz,Ar-H),7.86(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.39(s,1H,-NH₂),6.99(s,1H,-NH₂),4.27-4.28(m,1H,-CO-NCH-),3.59-3.64(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.45-3.49(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.04-2.10(m,1H,-NCHCH₂-),1.84-1.89(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

(2)3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶的合成

稱取化合物3-氨基-2-氯-5-溴吡啶1.00g(4.82mmol)和對氟苯磺酰氯2.80g(14.46mmol)于100mL茄形瓶中，再加入10mL吡啶，70℃反應8h，冷卻至室溫，加水析出固體，抽濾，將濾餅轉(zhuǎn)移至100mL茄形瓶中，加入無水K₂CO₃ 3.00g(21.71mmol)，水6mL，甲醇20mL，室溫攪拌12h，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑(V/V)：石油醚/乙酸乙酯＝10/1，得1.40g白色固體，產(chǎn)率：79.53％。

(3)3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶的合成

稱取化合物3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-溴吡啶0.53g(1.44mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯0.44g(1.73mmol)、乙酸鉀0.42g(4.32mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.11g(0.14mmol)于100mL茄形瓶中，加入12mL二氧六環(huán)，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，直接投下一步。

(4)(S)-N¹-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-吡啶基}-1,2-四氫吡咯二甲酰胺的合成

向3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶(理論產(chǎn)量0.59g，1.44mmol)的反應體系中，加入(S)-N¹-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.30g(0.96mmol)、碳酸鉀0.40g(2.88mmol)、Pd(dppf)Cl₂ 0.07g(0.10mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝15/1，得0.11g淡黃色固體，產(chǎn)率：22.80％，mp：218-220℃。ESI-MS(m/z)：519.0[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ10.50(br,1H,-SO₂NHAr),δ8.90(s,1H,-CONHAr),8.63(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.56(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.05(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝9.2Hz,Ar-H),8.01(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.99(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),7.80-7.83(m,2H,Ar-H),7.42-7.46(m,2H,Ar-H),7.39(s,1H,-NH₂),6.99(s,1H,-NH₂),4.31-4.34(m,1H,-CO-NCH-),3.63-3.69(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.48-3.54(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.08-2.13(m,1H,-NCHCH₂-),1.86-1.92(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例2(S)-N¹-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-4-氯苯基]-2-吡啶基}-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂)的制備

制備方法同實施例1，用2-氯-5-溴苯胺代替2-氨基-5-溴吡啶。產(chǎn)率：18.03％，mp：166-168℃。ESI-MS(m/z)：518.0[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ10.21(br,1H,-SO₂NHAr),δ8.83(s,1H,-CONHAr),8.41(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.98(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.91(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.78-7.82(m,2H,Ar-H),7.57(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.50(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.41-7.46(m,3H,Ar-H),7.38(s,1H,-NH₂),6.98(s,1H,-NH₂),4.31-4.33(m,1H,-CO-NCH-),3.63-3.67(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.49-3.54(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.08-2.12(m,1H,-NCHCH₂-),1.87-1.92(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例3(S)-N¹-(5-{4-氯-3-[N-(4-氟苯基)磺酰氨基]苯基}-2-吡啶基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₃)的制備

(1)N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺的合成

稱取化合物2-氯-5-溴苯磺酰氯0.50g(1.72mmol)和對氟苯胺0.21g(1.90mmol)于100mL茄形瓶中，加入20mL二氯甲烷和0.15mL吡啶，室溫攪拌12h，旋蒸除去二氯甲烷，向體系中加入一定量的水，抽濾烘干，硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑(V/V)：石油醚/乙酸乙酯＝5/1，得0.66g白色固體，產(chǎn)率：88.01％，mp：171-173℃。

(2)3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-6-氯-N-(4-氟苯基)苯磺酰胺的合成

稱取化合物N-(4-氟苯基)-2-氯-5-溴苯磺酰胺0.42g(1.15mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯0.35g(1.38mmol)、乙酸鉀0.34g(3.45mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.06g(0.08mmol)于100mL茄形瓶中，加入12mL二氧六環(huán)，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，直接投下一步。

(3)合成(S)-N¹-(5-{4-氯-3-[N-(4-氟苯基)磺酰氨基]苯基}-2-吡啶基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺

向3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-6-氯-N-(4-氟苯基)苯磺酰胺(理論產(chǎn)量0.47g，1.15mmol)的反應體系中，加入(S)-N¹-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.30g(0.96mmol)、碳酸鉀0.40g(2.88mmol)、Pd(dppf)Cl₂ 0.05g(0.07mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.25g白色固體，產(chǎn)率：50.28％，mp：134-136℃。ESI-MS(m/z)：518.0[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ10.68(br,1H,-SO₂NHAr),δ8.86(s,1H,-CONHAr),8.54(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.18(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.03(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.98(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.94(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.71(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.41(s,1H,-NH₂),7.15-7.18(m,2H,Ar-H),7.07-7.11(m,2H,Ar-H),6.99(s,1H,-NH₂),4.30-4.32(m,1H,-CONCH-),3.62-3.66(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.51-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.06-2.13(m,1H,-NCHCH₂-),1.87-1.91(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例4(S)-N¹-[5-(5′-三氟甲基-6′-氯-3′-吡啶基)-2-吡啶基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₄)的制備

(1)3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-5-三氟甲基-6-氯吡啶的合成

稱取化合物3-三氟甲基-2-氯-5-溴吡啶0.20g(0.77mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯0.23g(0.92mmol)、乙酸鉀0.23g(2.31mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.04g(0.05mmol)于100mL茄形瓶中，加入12mL二氧六環(huán)，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，直接投下一步。

(2)(S)-N¹-[5-(5′-三氟甲基-6′-氯-3′-吡啶基)-2-吡啶基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺的合成

向3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-5-三氟甲基-6-氯吡啶(理論產(chǎn)量0.24g，0.77mmol)的反應體系中，加入(S)-N¹-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.16g(0.51mmol)、碳酸鉀0.21g(1.53mmol)、Pd(dppf)Cl₂ 0.06g(0.05mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.06g白色固體，產(chǎn)率：30.21％，mp：190-192℃。ESI-MS(m/z)：414.0[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ9.07(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),δ8.92(s,1H,-CONHAr),8.77(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.61(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.23(dd,1H,J＝2.8Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),8.01(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.41(s,1H,-NH₂),6.99(s,1H,-NH₂),4.31-4.32(m,1H,-CONCH-),3.63-3.67(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.51-3.52(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.06-2.12(m,1H,-NCHCH₂-),1.88-1.91(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例5(S)-N¹-[5-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-2-吡啶基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₅)的制備

制備方法同實施例4，用2-三氟甲基-4-溴芐氯代替3-三氟甲基-2-氯-5-溴吡啶。產(chǎn)率：35.32％，mp：176-178℃。ESI-MS(m/z)：413.1[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ8.85(s,1H,-CONHAr),8.67(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.14(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),8.11(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.03(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.99(d,1H,J＝9.2Hz,Ar-H),7.81(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.41(s,1H,-NH₂),6.99(s,1H,-NH₂),4.30-4.33(m,1H,-CONCH-),3.64-3.68(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.51-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.08-2.13(m,1H,-NCHCH₂-),1.85-1.91(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例6(S)-N¹-[5-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-2-吡啶基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₆)的制備

制備方法同實施例4，用2-三氟甲氧基-4-溴芐氯代替3-三氟甲基-2-氯-5-溴吡啶。產(chǎn)率：36.44％，mp：200-204℃。ESI-MS(m/z)：429.1[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ8.84(s,1H,-CONHAr),8.64(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),8.10(dd,1H,J＝1.2Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.98(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.91(s,1H,Ar-H),7.76-7.83(m,2H,Ar-H),7.41(s,1H,-NH₂),6.99(s,1H,-NH₂),4.30-4.32(m,1H,-CONCH-),3.63-3.68(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.49-3.51(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.08-2.13(m,1H,-NCHCH₂-),1.85-1.91(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例7(S)-N¹-[5-(4′-吡啶基)-2-吡啶基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₇)的制備

稱取化合物(S)-N¹-(5-溴-2-吡啶基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.30g(0.96mmol)、4-吡啶基硼酸0.18g(1.44mmol)、碳酸鉀0.40g(2.88mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.07g(0.10mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六環(huán)12mL和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝20/1，得0.10g白色固體，產(chǎn)率：33.49％，mp：243-245℃。ESI-MS(m/z)：312.1[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ8.90(s,1H,-CONHAr),8.74(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.62(d,1H,J＝6.0Hz,Ar-H),8.19(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),8.02(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.77(d,1H,J＝6Hz,Ar-H),7.40(s,1H,-NH₂),7.00(s,1H,-NH₂),4.31-4.37(m,1H,-CO-NCH-),3.63-3.71(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.48-3.54(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.06-2.13(m,1H,-NCHCH₂-),1.83-1.93(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例8(S)-N¹-[5-(4-甲氧基苯基)-2-吡啶基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₈)的制備

制備方法同實施例7，用4-甲氧基苯硼酸代替4-吡啶基硼酸。產(chǎn)率：52.03％，mp：206-208℃。ESI-MS(m/z)：341.1[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ8.65(s,1H,-CONHAr),8.51(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),7.97(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.8Hz,Ar-H),7.93(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.63(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.38(s,1H,-NH₂),7.03(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),6.98(s,1H,-NH₂),4.30-4.32(m,1H,-CO-NCH-),3.80(s,3H,-OCH₃),3.62-3.66(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.47-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.07-2.11(m,1H,-NCHCH₂-),1.86-1.92(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例9(S)-N¹-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-吡嗪基}-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₉)的制備

(1)(S)-N¹-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺的合成

稱取三光氣0.85g(2.87mmol)于100mL茄形瓶中，加入溶劑二氯甲烷，冰浴下滴加0.50g(2.87mmol)2-氨基-5-溴吡嗪的二氯甲烷溶液，滴加完成后，撤去冰浴，室溫攪拌12h，再加入0.98g(8.61mmol)L-脯氨酰胺的二氯甲烷溶液和1.2mL TEA，室溫攪拌1h，停止反應，旋蒸除去溶劑，用乙酸乙酯萃取，收集有機相，飽和氯化鈉洗一次，無水硫酸鈉干燥后，硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝30/1，得0.30g黃色晶體，產(chǎn)率33.27％。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ8.86(s,1H,-CONHAr),8.34(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.91(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.0Hz,Ar-H),7.86(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.39(s,1H,-NH₂),6.99(s,1H,-NH₂),4.27-4.28(m,1H,-CO-NCH-),3.59-3.64(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.45-3.49(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.04-2.10(m,1H,-NCHCH₂-),1.84-1.89(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

(2)(S)-N¹-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-吡嗪基}-1,2-四氫吡咯二甲酰胺的合成

向3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶(理論產(chǎn)量0.59g，1.43mmol)的反應體系中，加入(S)-N¹-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.24g(0.95mmol)、碳酸鉀0.39g(2.85mmol)、Pd(dppf)Cl₂ 0.07g(0.10mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝15/1，得0.06g淡黃色固體，產(chǎn)率：12.15％，mp：159-161℃。ESI-MS(m/z)：520.0[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ10.53(br,1H,-SO₂NHAr),δ9.41(s,1H,-CONHAr),9.22(s,1H,Ar-H),9.00(s,1H,Ar-H),8.93(s,1H,Ar-H),8.35(s,1H,Ar-H),7.80-7.83(m,2H,Ar-H),7.44-7.46(m,3H,Ar-H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),4.34-4.35(m,1H,-CONCH-),3.67(s,1H,-NCH₂CH₂-),3.52-3.54(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.12(m,1H,-NCHCH₂-),1.89(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例10(S)-N¹-{5-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-4-氯苯基]-2-吡嗪基}-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₀)的制備

制備方法同實施例9，用N-[3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-6-氯苯基]-4-氟苯磺酰胺代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶。產(chǎn)率：27.09％，mp：233-235℃。ESI-MS(m/z)：519.0[M+H]⁺。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ10.22(br,1H,-SO₂NHAr),δ9.30(s,1H,-CONHAr),9.17(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.30(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),7.93(d,2H,J＝9.2Hz,Ar-H),7.77-7.80(m,2H,Ar-H),7.52(d,J＝8.4Hz,1H,Ar-H),7.39-7.44(m,3H,Ar-H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),4.33-4.34(m,1H,-CONCH-),3.65-3.68(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.53-3.58(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.09-2.13(m,1H,-NCHCH₂-),1.89-1.91(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例11(S)-N¹-(5-{4-氯-3-[N-(4-氟苯基)磺酰氨基]苯基}-2-吡嗪基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₁)的制備

制備方法同實施例9，用3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-6-氯-N-(4-氟苯基)苯磺酰胺代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶。產(chǎn)率：30.10％，mp：202-205℃。ESI-MS(m/z)：519.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ10.68(br,1H,-SO₂NHAr),δ9.37(s,1H,-CONHAr),9.20(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.98(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.66(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.30(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.75(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.43(s,1H,-NH₂),7.14-7.17(m,2H,Ar-H),7.07-7.11(m,2H,Ar-H),7.01(s,1H,-NH₂),4.33-4.35(m,1H,-CONCH-),3.64-3.70(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.53-3.55(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.09-2.13(m,1H,-NCHCH₂-),1.87-1.91(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例12(S)-N¹-[5-(5-三氟甲基-6-氯-3-吡啶基)-2-吡嗪基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₂)的制備

稱取3-三氟甲基-2-氯-5-溴吡啶0.37g(1.43mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯0.44g(1.716mmol)、乙酸鉀0.28g(2.86mmol)和Pd(PPh₃)₄ 0.08g(0.072mmol)于100mL茄型瓶中，加入DME 8mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，得到含有產(chǎn)物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-5-三氟甲基-6-氯吡啶的反應體系，冷卻至室溫，向此體系中加入(S)-N¹-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.30g(0.95mmol)、碳酸鈉0.20g(1.90mmol)、Pd(PPh₃)₄ 0.06g(0.05mmol)、乙醇8mL和水5.2mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.14g白色固體，產(chǎn)率：35.54％，mp：237-239℃。ESI-MS(m/z)：415.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ9.48(s,1H,-CONHAr),9.37(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),9.26(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),9.18(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.86(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.43(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),4.35-4.36(m,1H,-CONCH-),3.66-3.40(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.50-3.56(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.88-1.92(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例13(S)-N¹-[5-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-2-吡嗪基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₃)的制備

制備方法同實施例9，用2-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶。產(chǎn)率：37.80％，mp：175-180℃。ESI-MS(m/z)：414.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ9.37(s,1H,-CONHAr),9.22(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),9.08(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.48(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.39(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.85(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.43(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),4.33-4.35(m,1H,-CONCH-),3.65-3.69(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.53-3.55(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.09-2.13(m,1H,-NCHCH₂-),1.88-1.91(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例14(S)-N¹-[5-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-2-吡嗪基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₄)的制備

制備方法同實施例9，用2-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶。產(chǎn)率：27.14％，mp：182-184℃。ESI-MS(m/z)：430.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ9.38(s,1H,-CONHAr),9.21(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),9.05(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.23(s,1H,Ar-H),8.18(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.82(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.42(s,1H,-NH₂),7.00(s,1H,-NH₂),4.34-4.35(m,1H,-CONCH-),3.65-3.69(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.50-3.57(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.07-2.14(m,1H,-NCHCH₂-),1.87-1.90(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例15(S)-N¹-{5-[4-(1H-1-吡唑基)苯基]-2-吡嗪基}-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₅)的制備

稱取1-(4-溴苯基)-1H-吡唑0.26g(1.16mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯0.35g(1.38mmol)、乙酸鉀0.34g(3.48mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.06g(0.08mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六環(huán)12mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，得到含有產(chǎn)物1-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)苯基]-1H-吡唑的反應體系，冷卻至室溫，向此體系中加入(S)-N¹-(5-溴-2-吡嗪基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.30g(0.95mmol)、碳酸鉀0.39g(2.85mmol)、Pd(dppf)Cl₂ 0.05g(0.07mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝20/1，得0.12g白色固體，產(chǎn)率：33.48％，mp：235-238℃。ESI-MS(m/z)：378.1[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ9.25(s,1H,-CONHAr),9.20(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),8.99(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.62(d,1H,J＝2.8Hz,Ar-H),8.22(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.98(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.80(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),7.43(s,1H,-NH₂),7.02(s,1H,-NH₂),6.59-6.60(m,1H,Ar-H),4.33-4.35(m,1H,-CONCH-),3.65-3.71(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.50-3.56(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.09-2.14(m,1H,-NCHCH₂-),1.88-1.92(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例16(S)-N¹-{6-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-苯并噻唑基}-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₆)的制備

(1)(S)-N¹-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺的合成

稱取2-氨基-6溴-苯并噻唑1.00g(4.36mmol)和CDI 2.83g(17.46mmol)于100mL茄形瓶中，加入15mL DMF作為溶劑，常溫攪拌24h，停止反應，抽濾取濾餅于100mL茄型瓶中，加入0.50g(4.36mmol)L-脯氨酰胺和12mL DMF，室溫攪拌5h，停止反應，加水析出大量白色沉淀，抽濾，取濾餅烘干，硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得1.10g白色固體，產(chǎn)率68.34％，mp：203-205℃。1H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.15(br,1H-CONHAr),8.15(s,1H,Ar-H),7.50-7.55(m,2H,Ar-H),7.45(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),4.29-4.31(m,1H,-CONCH-),3.63-3.64(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.49-3.51(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.09-2.14(m,1H,-NCHCH₂-),1.88-1.89(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

(2)(S)-N¹-{6-[3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-3-吡啶基]-2-苯并噻唑基}-1,2-四氫吡咯二甲酰胺的合成

向3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶(理論產(chǎn)量0.79g，1.91mmol)的反應體系中，加入(S)-N¹-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.47g(1.27mmol)、碳酸鉀0.53g(3.81mmol)、Pd(dppf)Cl₂ 0.09g(0.13mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流10h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝15/1，得0.15g淡黃色固體，產(chǎn)率：13.65％，mp：222-224℃。ESI-MS(m/z)：575.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.20(br,1H,-CONHAr)，δ10.54(br,1H,-SO₂NHAr),8.62(d,1H,J＝1.2Hz,Ar-H),8.27(s,1H,Ar-H),8.01(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.80-7.83(m,2H,Ar-H),7.74-7.75(m,1H,Ar-H),7.66(d,J＝7.6Hz,1H,Ar-H),7.42-7.49(m,3H,Ar-H,-NH₂),7.03(s,1H,-NH₂),4.24-4.37(m,1H,-CONCH-),3.66-3.68(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.58-3.62(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.89(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例17(S)-N¹-[6-(5-甲磺酰氨基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₇)的制備

稱取3-甲磺酰氨基-2-甲氧基-5-溴吡啶0.32g(1.15mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯0.35g(1.38mmol)、乙酸鉀0.34g(3.48mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.06g(0.08mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六環(huán)12mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，得到含有產(chǎn)物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-5-甲磺酰胺基-6-甲氧基吡啶的反應體系，冷卻至室溫，向此體系中加入(S)-N¹-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.35g(0.96mmol)、碳酸鉀0.48g(3.45mmol)、Pd(dppf)Cl₂ 0.11g(0.14mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流7h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得白色固體0.05g，產(chǎn)率：10.83％，mp：190-194℃。ESI-MS(m/z)：491.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.11(br,1H,-CONHAr),δ9.35(br,1H,-SO₂NHAr),8.35(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),8.20(s,1H,Ar-H),7.91(d,1H,J＝2.0Hz,Ar-H),7.63-7.71(m,2H,Ar-H),7.45(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),4.29-4.32(m,1H,-CONCH-),3.97(s,3H,-OCH₃),3.66(s,1H,-NCH₂CH₂-),3.48-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.10(s,3H,-SO₂CH₃),2.10-2.14(m,1H,-NCHCH₂-),1.89-1.92(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例18(S)-N¹-[6-(5-三氟甲基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₈)的合成

(1)6-(5-三氟甲基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-氨基苯并噻唑的合成

稱取3-三氟甲基-2-甲氧基-5-溴吡啶0.50g(1.95mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯0.60g(2.34mmol)、乙酸鉀0.57g(5.85mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.10g(0.14mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六環(huán)12mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，得到含有產(chǎn)物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-5-甲磺酰胺基-6-甲氧基吡啶的反應體系，冷卻至室溫，向此體系中加入2-氨基-6-溴苯并噻唑0.37g(1.63mmol)、碳酸鉀0.67g(4.88mmol)、Pd(dppf)Cl₂0.15g(0.20mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流6h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝50/1，得0.40g白色固體，產(chǎn)率：75.43％。

(2)合成(S)-N¹-[6-(5-三氟甲基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺

稱取6-(5-三氟甲基-6-甲氧基-3-吡啶基)-2-氨基苯并噻唑0.40g(1.23mmol)和CDI 0.80g(4.92mmol)于100mL茄形瓶中，加入8mL DMF作為溶劑，常溫攪拌24h，停止反應，抽濾取濾餅于100mL茄型瓶中，加入0.14g(1.23.mmol)L-脯氨酰胺和8mL DMF，室溫攪拌5h，停止反應，加水析出大量白色沉淀，抽濾，取濾餅烘干，硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.30g白色固體，產(chǎn)率52.40％，mp：245-247℃。ESI-MS(m/z)：466.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.14(br,1H,-CONHAr),8.82(s,1H,Ar-H),8.39(s,1H,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),7.75-7.77(m,2H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH₂),7.02(s,1H,-NH₂),4.28-4.32(m,1H,-CONCH-),4.04(s,3H,-OCH₃),3.66-3.68(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.52-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.08-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.89(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例19(S)-N¹-[6-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₁₉)的制備

制備方法同實施例16，用2-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶。產(chǎn)率：26.33％，mp：191-193℃。ESI-MS(m/z)：469.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.16(br,1H,-CONHAr),8.37(s,1H,Ar-H),8.12(s,1H,Ar-H),8.05(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.76-7.83(m,3H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),4.29-4.33(m,1H,-CONCH-),3.65-3.66(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.52-3.54(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.08-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.89(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例20(S)-N¹-[6-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂₀)的制備

制備方法同實施例16，用2-(3-三氟甲氧基-4-氯苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷代替3-(4-氟苯磺酰氨基)-2-氯-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)吡啶。產(chǎn)率：25.46％，mp：188-190℃。ESI-MS(m/z)：485.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.16(br,1H,-CONHAr),8.33(s,1H,Ar-H),7.90(s,1H,Ar-H),7.82(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.74-7.79(m,3H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),4.29-4.33(m,1H,-CONCH-),3.66-3.67(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.52-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.89-1.90(m,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例21(S)-N¹-[6-(6-三氟甲基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂₁)的制備

稱取2-三氟甲基-5-溴吡啶0.26g(1.15mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯0.35g(1.38mmol)、乙酸鉀0.34g(3.48mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.06g(0.08mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六環(huán)12mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，得到含有產(chǎn)物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-5-三氟甲基吡啶的反應體系，冷卻至室溫，向此體系中加入(S)-N¹-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.35g(0.96mmol)、碳酸鉀0.48g(3.45mmol)、Pd(dppf)Cl₂ 0.11g(0.14mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流6h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.09g白色固體，產(chǎn)率：21.53％，mp：237-239℃。ESI-MS(m/z)：436.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.20(br,1H,-CONHAr),8.16(d,1H,J＝0.8Hz,Ar-H),8.41(d,2H,J＝6.4Hz,Ar-H),7.99(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.77-7.85(m,2H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH₂),7.02(s,1H,-NH₂),4.31-4.34(m,1H,-CONCH-),3.66-3.67(s,1H,-NCH₂CH₂-),3.53-3.54(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.90(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例22(S)-N¹-[6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂₂)的制備

制備方法同實施例21，用2-甲氧基-5-溴吡啶代替2-三氟甲基-5-溴吡啶。產(chǎn)率：26.21％，mp：248-249℃。ESI-MS(m/z)：398.1[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.09(br,1H,-CONHAr),8.53(s,1H,Ar-H),8.21(s,1H,Ar-H),8.06(dd,1H,J＝1.6Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.66-7.67(m,2H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),6.92(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),4.30-4.32(m,1H,-CONCH-),3.91(s,3H,-OCH₃),3.66-3.67(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.52-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.12(m,1H,-NCHCH₂-),1.90(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例23(S)-N¹-[6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂₃)的制備

(1)6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-氨基苯并噻唑的合成

稱取3-甲氧基-5-溴吡啶0.49g(2.62mmol)、雙聯(lián)頻哪醇硼酸酯0.80g(3.14mmol)、乙酸鉀0.77g(7.86mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.13g(0.18mmol)于100mL茄型瓶中，加入二氧六環(huán)12mL，氮氣保護，120℃加熱回流3h，得到含有產(chǎn)物3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷-2-基)-5-甲氧基吡啶的反應體系，冷卻至室溫，向此體系中加入2-氨基-6-溴苯并噻唑0.50g(2.18mmol)、碳酸鉀0.90g(6.54mmol)、Pd(dppf)Cl₂ 0.16g(0.22mmol)和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流6h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝40/1，得0.35g白色固體，產(chǎn)率：62.40％。

(2)(S)-N¹-[6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺的合成

稱取6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-氨基苯并噻唑0.35g(1.36mmol)和CDI 0.88g(5.44mmol)于100mL茄形瓶中，加入8mL DMF作為溶劑，常溫攪拌24h，停止反應，抽濾取濾餅于100mL茄型瓶中，加入0.16g(1.36mmol)L-脯氨酰胺和8mL DMF，室溫攪拌5h，停止反應，加水析出大量白色沉淀，抽濾，取濾餅烘干硅膠柱色譜分離純化，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝25/1，得0.25g白色固體，產(chǎn)率46.25％，mp：211-212℃。ESI-MS(m/z)：398.1[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.14(br,1H,-CONHAr),8.54(s,1H,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.28(d,1H,J＝2.4Hz,Ar-H),7.69-7.78(m,3H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),4.31-4.32(m,1H,-CONCH-),3.93(s,3H,-OCH₃),3.66-3.67(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.52-3.54(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.90(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例24(S)-N¹-[6-(6-氨基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂₄)的制備

制備方法同實施例21，用2-氨基-5-溴吡啶代替2-三氟甲基-5-溴吡啶。產(chǎn)率：10.62％，mp：249-250℃。ESI-MS(m/z)：383.1[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.14(br,1H,-CONHAr),8.29(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),8.08(s,1H,Ar-H),7.79(dd,1H,J＝2.0Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.57-7.60(m,2H,Ar-H),7.44(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),6.58(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),6.21(s,2H,Ar-NH₂),4.31-4.32(m,1H,-CONCH-),3.65-3.67(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.48-3.51(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.07-2.13(m,1H,-NCHCH₂-),1.90(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例25(S)-N¹-[6-(6-氨基-3-嘧啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂₅)的制備

制備方法同實施例21，用2-氨基-5-溴嘧啶代替2-三氟甲基-5-溴吡啶。產(chǎn)率：21.74％，mp：220-221℃。ESI-MS(m/z)：384.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.06(br,1H,-CONHAr),8.62(s,2H,Ar-H),8.16(s,1H,Ar-H),7.61-7.63(m,2H,Ar-H),7.45(s,1H,-NH₂),7.01(s,1H,-NH₂),6.77(s,2H,Ar-NH₂),4.31-4.32(m,1H,-CONCH-),3.66-3.67(m,1H,-NCH₂CH₂-),3.52-3.54(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.90(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例26(S)-N¹-[6-(3-羥苯基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂₆)的制備

稱取3-羥基苯硼酸0.14g(0.98mmol)、(S)-N¹-(6-溴-2-苯并噻唑基)-1,2-四氫吡咯二甲酰胺0.30g(0.81mmol)、碳酸鉀0.41g(2.94mmol)和Pd(dppf)Cl₂ 0.05g(0.07mmol)于100mL的茄型瓶中，加入二氧六環(huán)12mL和水3mL，氮氣保護，120℃加熱回流6h，冷卻至室溫，旋蒸除去溶劑，硅膠柱色譜分離純化三次，洗脫劑(V/V)：氯仿/甲醇＝15/1，得0.14g白色固體，產(chǎn)率：45.19％，mp：213-215℃。ESI-MS(m/z)：383.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.08(br,1H,-CONHAr),9.53(s,1H,-OH),8.12(s,1H,Ar-H),7.75-7.67(m,2H,Ar-H),7.45(s,1H,-NH₂),7.24-7.28(m,1H,Ar-H),7.11-7.13(d,1H,J＝7.2Hz,Ar-H),7.06(s,1H,Ar-H),7.01(s,1H,-NH₂),6.76(d,1H,J＝7.2Hz,Ar-H),4.31-4.33(m,1H,-CONCH-),3.65(s,1H,-NCH₂CH₂-),3.51-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.12(m,1H,-NCHCH₂-),1.89(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例27(S)-N¹-[6-(3-羥甲苯基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂₇)的制備

制備方法同實施例26，用3-羥甲基苯硼酸代替3-羥基苯硼酸。產(chǎn)率：68.31％，mp：226-228℃。ESI-MS(m/z)：397.1[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.09(br,1H,-CONHAr),8.19(s,1H,Ar-H),7.66-7.68(m,2H,Ar-H),7.58(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.41-7.44(m,2H,Ar-H,-NH₂),7.30-7.32(d,1H,J＝7.2Hz,Ar-H),7.01(s,1H,-NH₂),5.25-5.28(m,1H,Ar-H),4.58(d,2H,J＝6Hz,Ar-CH₂-),4.29-4.35(m,1H,-CONCH-),3.66(s,1H,-NCH₂CH₂-),3.52-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.10-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.89(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例28(R)-N¹-[6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯二甲酰胺(T₂₈)的制備

制備方法同實施例23，用D-脯氨酰胺代替L-脯氨酰胺。產(chǎn)率46.17％，mp：172-173℃。ESI-MS(m/z)：398.0[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.14(br,1H,-CONHAr),8.54(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.27(d,1H,J＝2.8Hz,Ar-H),7.69-7.78(m,3H,Ar-H),7.46(s,1H,-NH₂),7.02(s,1H,-NH₂),4.30-4.33(m,1H,-CONCH-),3.93(s,3H,-OCH₃),3.66(s,1H,-NCH₂CH₂-),3.51-3.53(m,1H,-NCH₂CH₂-),2.08-2.15(m,1H,-NCHCH₂-),1.89(s,3H,-CH₂-CH₂-CH₂-CH-)ppm。

實施例29N¹-[6-(5-甲氧基-3-吡啶基)-2-苯并噻唑基]-1,2-四氫吡咯(T₂₉)的制備

制備方法同實施例23，用四氫吡咯代替L-脯氨酰胺。產(chǎn)率55.67％，mp：>290℃。ESI-MS(m/z)：355.1[M+H]⁺，¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆)：δ11.06(br,1H，-CONHAr),8.54(d,1H,J＝1.6Hz,Ar-H),8.33(s,1H,Ar-H),8.27(d,1H,J＝2.8Hz,Ar-H),7.76(dd,1H,J＝2.4Hz,J＝8.4Hz,Ar-H),7.66-7.67(m,2H,Ar-H),3.93(s,3H,-OCH₃),3.45(s,4H,-NCH₂CH₂-),1.87(s,4H,-NCH₂CH₂-)ppm。

藥效學實驗部分

1、目標化合物體外激酶抑制實驗：主要測定化合物對PI3Kα激酶的抑制活性，并測定部分化合物對PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ激酶的IC₅₀值。

p110α/p85的測試方法及具體操作步驟：

(1)準備化合物

①化合物的連續(xù)稀釋液和源板的準備：將待測化合物用100％的DMSO配制至最終最高抑制濃度的100倍，將100μL的化合物溶液加入到96孔板中。例如，當最高抑制濃度為0.1μmol/L時，在這一步就將化合物用DMSO配制成10μmol/L。在同一96孔板的兩個孔中分別加入100μL的DMSO溶液(100％)，作為空白對照。并將此板標記為源板。

②中間板的準備：在源板中取4μL的化合物溶液加入到新的96孔板中，將此板作為中間板。在中間板的每個孔中加入96μL的激酶緩沖液，振蕩混勻10min。

③試驗板的準備：在中間板的每個孔中取2.5μL的化合物溶液加入到384孔板中，準備兩份這樣的384孔板。例如，將標號為A1的96孔板中的溶液轉(zhuǎn)移到標號為A1和A2的384孔板中；將標號為A2的96孔板中的溶液轉(zhuǎn)移到標號為A3和A4的384孔板中等。

(2)激酶PI3Kα反應

①激酶反應緩沖液的準備：1倍量激酶緩沖液的組成：50mmol/L HEPES(pH 7.4)、3mmol/L MgCl₂、1mmol/L EGTA、100mmol/L NaCl、0.03％CHAPS和2mmol/L DTT。

②準備四倍量的激酶溶液：用1倍量激酶緩沖液配制PI3Kα溶液至其最終濃度的4倍。本實驗中PI3Kα的最終濃度為1.65nmol/L。取2.5μL的激酶溶液加入到試驗板的每個孔中，沒有酶的對照孔除外(此對照孔加入2.5μL的緩沖溶液)，振蕩混勻。

③準備兩倍量的底物溶液：用1倍量的激酶反應緩沖液配制PIP2底物和ATP底物溶液至其最終試驗濃度的2倍。本實驗中PIP2的最終濃度為50μmol/L，ATP的最終濃度為25μmol/L。取5μL的底物溶液加入到試驗板的每個孔中，振蕩混勻。

④激酶反應：封上試驗板，室溫下孵育1h。

⑤激酶檢測：使Kinase-Glo試劑平衡至室溫。在試驗板的每個孔中加入10μL的Kinase-Glo試劑終止反應。用離心機短暫混勻，放在搖床上緩慢振蕩15min后，用酶標儀檢測化學發(fā)光信號。

⑥讀取并收集Flexstation酶標儀上的數(shù)據(jù)。

⑦曲線擬合：在Flexstation酶標儀程序中復制相對光單位(relative light unit，RLU)的值。將RLU值轉(zhuǎn)換為百分抑制率。曲線用Graphpad 5.0擬合。

百分抑制率＝100-(最大值-樣本RLU)/(最大值-最小值)×100％

最大值是沒有酶的對照孔的RLU值，最小值是沒有化合物的對照孔的RLU值。

p110β/p85、p110δ/p85和p110γ的測試方法與p110α/p85相同。

2、目標化合物體外抑制腫瘤細胞增殖實驗：采用MTT法評價化合物對人結(jié)腸癌(HCT116)和乳腺癌(MDA-MB-453)的增殖抑制活性。

具體操作步驟：

(1)復蘇：從液氮罐中取出一支凍存的HCT116(或MDA-MB-453)細胞，迅速放入37℃溫水中，將融化的凍存液加入15mL離心管中，加入8mL培養(yǎng)基，離心，棄上清，用5mL培養(yǎng)基將離心管中的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶置于含5％CO₂的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)傳代：復蘇后約1～2天細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，傾倒培養(yǎng)基，用PBS洗培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞2次，洗完后將PBS倒干凈，加入1mL 0.25％胰蛋白酶，顯微鏡下觀察，待細胞松動變圓后，加入帶血清的培養(yǎng)基(2mL)終止，輕輕吹打瓶底，使細胞脫離，待細胞完全脫離瓶底時，轉(zhuǎn)移至離心管中離心，傾倒上清液，用培養(yǎng)基將細胞吹打均勻后，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

(3)MTT實驗：當細胞處于對數(shù)生長期時，接種96孔培養(yǎng)板，每孔200μL細胞懸液，接種密度為結(jié)腸癌細胞HCT116 4500個/孔，乳腺癌細胞MDA-MB-453為8000個/孔，置37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后給藥。將96孔板分為空白組、陰性組、實驗組和陽性對照組，首先給藥濃度設(shè)為1×10^-5mol/L以進行化合物的初步篩選，每個藥設(shè)三個平行孔。給藥后置于37℃，5％的CO₂培養(yǎng)箱中孵育72h(MDA-MB-453細胞孵育5天)，然后每孔均加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4小時后，取出96孔板，小心吸取上清液，向各孔加入150μL DMSO，置于酶標儀中震蕩10分鐘，于490nm測定吸光度值(OD值)，計算抑制率。

抑制率＝[(陰性組OD平均值-給藥組OD平均值)/陰性組OD平均值]×100％

(4)細胞水平的IC₅₀評價：對于在給藥濃度為1×10^-5mol/L時的抑制率高于或接近50％的化合物，設(shè)5.00×10^-5、1.67×10^-5、5.56×10^-6、1.85×10^-6、6.17×10^-7和2.06×10^-7mol/L 6個濃度梯度給藥，按初篩方法分別測得OD值。IC₅₀采用Graphpad Prism軟件計算，各實驗組均獨立重復三次。

實驗結(jié)果如表1至3所示，其中T₁-T₂₉分別為實施例1-29制得的產(chǎn)物。

表1化合物T₁-T₁₅對PI3Kα的抑制活性和對腫瘤細胞的增殖抑制活性(n＝3)

^a藥物作用濃度為1×10^-7mol/L；^b藥物作用濃度為1×10^-5mol/L；^c“---”表示未做。

表2化合物T₁₆-T₂₇對PI3Kα的抑制活性和對腫瘤細胞的增殖抑制活性(n＝3)

^a藥物作用濃度為1×10^-7mol/L；^b藥物作用濃度為1×10^-5mol/L。

表3化合物T₁₆、T₁₇、T₂₃、T₂₆、T₂₈和T₂₉對不同亞型的PI3K的抑制活性

由表1可看出，含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡啶化合物和含有L-脯氨酰胺片段的5-芳基吡嗪類化合物在100nmol/L時對PI3Kα的抑制活性較弱。目標化合物T₁-T₁₅中，除了化合物T₄、T₅和T₆在HCT116上有較明顯作用外，均對兩株細胞的作用不明顯。

由表2可看出，含有L-脯氨酰胺片的6-芳基苯并噻唑類化合物T₁₆-T₁₈、T₂₁-T₂₇在100nmol/L時對PI3Kα的抑制作用明顯。且化合物在兩株細胞上均表現(xiàn)出明顯抑制作用?；衔颰₁₆、T₁₈-T₂₀和T₂₃對HCT116的抑制活性與陽性藥BYL719相當；化合物T₁₆、T₁₇和T₂₂-T₂₅對MDA-MB-453的抑制活性與陽性藥BYL719相當。

由表3可看出，化合物T₁₆、T₁₇和T₂₃對PI3Kα的IC₅₀達到了納摩爾級別，且T₂₃和T₂₆對PI3Kα的抑制作用明顯強于PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ。而T₂₈和T₂₉對PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ的抑制作用很弱。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍內(nèi)。