本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法。

背景技術(shù)：

賽可瑞(Xalkori，克唑替尼)是由輝瑞公司研制的抑制Met/ALK/ROS的ATP競(jìng)爭(zhēng)性的多靶點(diǎn)蛋白激酶抑制劑。分別在ALK、ROS和MET激酶活性異常的腫瘤患者中證實(shí)克唑替尼對(duì)人體有顯著臨床療效。Xalkori是腫瘤藥物研發(fā)史上最快速的藥物之一，2011年在美國(guó)上市后引起轟動(dòng)。

克唑替尼的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇是克唑替尼化學(xué)合成過(guò)程中一個(gè)重要的中間體。但目前主要以化學(xué)合成為主，但該方法步驟繁瑣，產(chǎn)品收率低，污染大，不適于規(guī)?；a(chǎn)(US7858643B2)。目前(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇的生物制備方法，在催化過(guò)程中需要使用昂貴的輔酶NADP和使用葡萄糖脫氫酶進(jìn)行輔酶再生，不利于該中間體的廉價(jià)制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法，方法簡(jiǎn)單易行，產(chǎn)品收率高，生產(chǎn)成本低、環(huán)保，從而滿足克唑替尼的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)要求。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法，以2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮為底物，磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，加入羰基還原酶、輔因子及氫供體形成生物催化反應(yīng)體系，發(fā)生生物催化反應(yīng)生成(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇。

作為優(yōu)選，所述羰基還原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述羰基還原酶的編碼基因如SEQ ID NO.2所示。

作為優(yōu)選，所述輔因子為NAD⁺。

作為優(yōu)選，所述氫供體為異丙醇。

作為優(yōu)選，每升生物催化反應(yīng)體系中2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮的用量為50-100g。

作為優(yōu)選，每升生物催化反應(yīng)體系中羰基還原酶的用量為3-10g。

作為優(yōu)選，每升生物催化反應(yīng)體系中輔因子的用量為0.05-0.1g。

作為優(yōu)選，每升生物催化反應(yīng)體系中氫供體的用量為50-100mL。

作為優(yōu)選，所述磷酸緩沖液的pH為6.5-7.5。

作為優(yōu)選，所述生物催化反應(yīng)的溫度為25-35℃，反應(yīng)時(shí)間8-12h。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用新型的羰基還原酶催化還原反應(yīng)，具有生物催化劑使用量小、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短、收率高、光學(xué)純度好等優(yōu)勢(shì)。與現(xiàn)有技術(shù)的化學(xué)法相比，經(jīng)濟(jì)性高、污染小，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明構(gòu)建的重組羰基還原酶的表達(dá)質(zhì)粒pET26-CM3；

圖2是大腸桿菌BL21(DE3)/pET26-CM3誘導(dǎo)表達(dá)后重組羰基還原酶的SDS-PAGE電泳圖；其中M是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品，1號(hào)是破碎后上清液，2號(hào)是純化后的重組羰基還原酶。

圖3是反應(yīng)過(guò)程中底物和產(chǎn)物HPLC液相圖。(A)反應(yīng)0h的液相圖；(B)反應(yīng)6h后的液相圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

本發(fā)明的工藝路線如下：

實(shí)施例1：

(1)羰基還原酶編碼基因的合成：根據(jù)羰基還原酶CM3的原始基因序列(genebank Sequence ID:ABB91667.1)，按照大腸桿菌密碼子分析用表對(duì)原始基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化并進(jìn)行目的基因的全合成，基因合成委托上海捷瑞生物科技有限公司進(jìn)行，獲得的編碼基因序列如SEQ ID NO.2所示，翻譯后的羰基還原酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。合成后的編碼基因兩端分別帶用NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)并連接到pET26b(+)上，獲得重組表達(dá)載體pET26b-CM3(見(jiàn)圖1)。

(2)羰基還原酶的表達(dá)：

制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將重組表達(dá)載體pET26b-CM3通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)到表達(dá)菌株BL21(DE3)中并涂布到含有50μg/mL的LB平板上(10g/L蛋白胨,0.5g/L酵母粉,10g/L氯化鈉,20g/L瓊脂,pH7.0)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落，將單菌落接入到5mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日取1mL菌液加入到含卡那霉素的100mL TB培養(yǎng)基中(12g/L蛋白胨,24g/L酵母粉,4mL/L甘油,0.1M磷酸緩沖液,pH 7.0)，37℃下振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀至3.0，然后添加IPTG至終濃度為0.1mM，25℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜。圖2說(shuō)明重組羰基還原酶在大腸桿菌中獲得了正確表達(dá)。

(3)細(xì)胞破碎：5000g離心10min后收集菌體，用0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)緩沖液重懸菌體，超聲破碎后所得液體即為粗酶液。

(4)生物催化反應(yīng)：將5g底物2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮加入到含有85mL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.0)的250mL反應(yīng)器中，隨后，將15mL含有5mL異丙醇，10mg NAD⁺，500mg羰基還原酶的0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)加入該反應(yīng)器中。在30℃下磁力攪拌反應(yīng)，并用堿調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值，使其維持在7.0左右。利用薄層層析法定性檢測(cè)底物的消耗及產(chǎn)物的生成情況。HPLC檢測(cè)底物完全消耗(約8-10小時(shí))，加NaCl至飽和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相萃取。無(wú)水硫酸鈉除水，抽濾，減壓濃縮，得油狀液體，手性ee值大于99,收率為90.5％。圖3說(shuō)明利用該重組羰基還原酶可以催化底物生成產(chǎn)物，6h后產(chǎn)物峰明顯增大，底物峰減小。

(5)產(chǎn)物鑒定：利用核磁共振1H NMR對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，(S)-2’,6’-二氯-3’-氟苯乙醇核磁數(shù)據(jù)1H NMR(400MHz,chloroform-D)δppm 1.65(d,J＝6.8Hz,3H)5.58(q,J＝6.9Hz,1H)6.96-7.10(m,1H)7.22-7.36(m,1H)。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例與實(shí)施例不同之處在于步驟(4)：

將100g底物2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮加入到含有850mL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.0)的2.5L反應(yīng)器中，隨后，將150mL含有100mL異丙醇，50mg NAD⁺，10g羰基還原酶的0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)加入該反應(yīng)器中。在30℃下磁力攪拌反應(yīng)，并用堿調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值，使其維持在7.0左右。利用薄層層析法定性檢測(cè)底物的消耗及產(chǎn)物的生成情況。HPLC檢測(cè)底物完全消耗，加NaCl至飽和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相萃取。無(wú)水硫酸鈉除水，抽濾，減壓濃縮，得油狀液體，手性ee值大于99，產(chǎn)品收率為89.5％。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例與實(shí)施例不同之處在于步驟(4)：

將80g底物2’,6’-二氯-3’-氟苯乙酮加入到含有850mL磷酸緩沖液(0.1M，pH7.0)的2.5L反應(yīng)器中，隨后，將150mL含有70mL異丙醇，80mg NAD⁺，3g羰基還原酶的0.1M磷酸緩沖液(pH7.0)加入該反應(yīng)器中。在30℃下磁力攪拌反應(yīng)，并用堿調(diào)節(jié)反應(yīng)的pH值，使其維持在7.0左右。利用薄層層析法定性檢測(cè)底物的消耗及產(chǎn)物的生成情況。HPLC檢測(cè)底物完全消耗，加NaCl至飽和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相萃取。無(wú)水硫酸鈉除水，抽濾，減壓濃縮，得油狀液體，手性ee值大于99，產(chǎn)品收率為88.6％。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大學(xué)

<120> 一種利用羰基還原酶制備克唑替尼中間體的方法

<130> 2016.12

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Thr Thr Ser Asn Ala Leu Val Thr Gly Gly Ser Arg Gly Ile

1 5 10 15

Gly Ala Ala Ser Ala Ile Lys Leu Ala Gln Glu Gly Tyr Ser Val Thr

20 25 30

Leu Ala Ser Arg Ser Val Asp Lys Leu Asn Glu Val Lys Ala Lys Leu

35 40 45

Pro Ile Val Gln Asp Gly Gln Lys His Tyr Ile Trp Glu Leu Asp Leu

50 55 60

Ala Asp Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala

65 70 75 80

Ser Ser Tyr Asp Val Phe Val Ser Asn Ala Gly Val Ala Ala Phe Ser

85 90 95

Pro Thr Ala Asp His Asp Asp Lys Glu Trp Gln Asn Leu Leu Ala Val

100 105 110

Asn Leu Ser Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Lys Asp Val

115 120 125

Ser Glu Arg Pro Ala Asp Asn Pro Leu Gln Ile Ile Tyr Ile Ser Ser

130 135 140

Val Ala Gly Leu His Gly Ala Ala Gln Val Ala Val Tyr Ser Ala Ser

145 150 155 160

Lys Ala Gly Leu Asp Gly Phe Met Arg Ser Val Ala Arg Glu Val Gly

165 170 175

Pro Lys Gly Ile His Val Asn Ser Ile Asn Pro Gly Tyr Thr Lys Thr

180 185 190

Glu Met Thr Ala Gly Ile Glu Ala Leu Pro Asp Leu Pro Ile Lys Gly

195 200 205

Trp Ile Glu Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Leu Phe Leu Ala Lys

210 215 220

Ser Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Leu Ile

225 230 235 240

Ala

<210> 2

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacgacta cttcaaatgc gctcgtcact ggaggcagcc gcggcattgg cgctgcttcc 60

gccattaagc tggctcagga gggctacagt gttacgctgg cctctcgcag tgttgataaa 120

ctgaatgaag taaaggcgaa actcccaatt gtacaggacg ggcagaagca ctacatttgg 180

gaactcgatc tggctgatgt ggaagctgct tcgtcgttca agggtgctcc tttgcctgct 240

agcagctacg acgtcttcgt ttcgaacgcg ggcgtcgctg cgttctcgcc cacagccgac 300

cacgatgata aggagtggca gaacttgctc gccgtgaact tgtcgtcgcc cattgccctc 360

acgaaggccc tcttgaagga cgtctccgaa aggcctgcgg acaatccgtt gcagattatc 420

tacatttcgt cggtggccgg cttgcatggc gccgcgcagg tcgccgtgta cagtgcatct 480

aaggccggtc ttgatggttt tatgcgctcc gtcgcccgtg aggtgggccc gaagggcatc 540

catgtgaact ccatcaaccc cggatacacc aagactgaaa tgaccgcggg cattgaagcc 600

ctgcctgatt tgcctatcaa ggggtggatc gagcccgagg caattgctga cgcggttctg 660

tttctggcaa agtccaagaa tatcaccggc acaaacattg tggtcgacaa tggcttgatt 720

gcttag 726