本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及鑒定Pfmspdbl2基因多態(tài)性的引物及方法。

背景技術(shù)：

瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的蟲媒傳播寄生蟲病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全球有102個(gè)國家和地區(qū)流行瘧疾，約34億人受威脅，每年約有2億病例，近60萬人死亡，其中惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)對人類造成的致死率最高。瘧原蟲生活史包含人和按蚊兩個(gè)宿主，在人體內(nèi)先后寄生于肝臟細(xì)胞和紅細(xì)胞中，稱為紅內(nèi)期和紅外期。惡性瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞是瘧疾感染并致病的關(guān)鍵性步驟，入侵紅細(xì)胞相關(guān)的蛋白主要分布在裂殖子表膜和棒狀體，微線體，致密顆粒等細(xì)胞器，通常具有裂殖體期特異性表達(dá)，確定相關(guān)入侵蛋白并闡明裂殖子入侵紅細(xì)胞機(jī)制是阻斷入侵的前提，更是防治瘧疾的重要手段。裂殖子表膜蛋白(Merozoite surface protein，MSP)家族是參與瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的重要蛋白，被認(rèn)為是紅內(nèi)期疫苗研究潛在的靶抗原，是當(dāng)前瘧疾研究的熱點(diǎn)。

惡性瘧原蟲的基因分型是近年來國際上的研究熱點(diǎn)。不同基因型的惡性瘧原蟲蟲株可能與其致病性、抗原性及對藥物的敏感性有一定的關(guān)系。MSP3家族成員MSPDBL2是惡性瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的重要蛋白，以Pfmspdbl2為標(biāo)靶研制相關(guān)疫苗之前必須考慮并分析其基因多態(tài)性特點(diǎn)，評估其在不同地理區(qū)域和不同人群中的多態(tài)性變異水平十分重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種鑒定惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性的特異性引物。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種鑒定惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性的方法。

本發(fā)明首先提取待測惡性瘧原蟲基因組DNA，然后通過對惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物送測序，經(jīng)序列比對后，得到多態(tài)性鑒定結(jié)果。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明第一個(gè)方面是提供了一對用于惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因PCR擴(kuò)增的特異性引物，其序列為：

上游：5′-GCATTCGATATATGTAATAATTATTAT-3′(如SEQ ID NO：1所示)；

下游：5′-GCTTTATAAGAAACACATATCTAA-3′(如SEQ ID NO：2所示)。

本發(fā)明第二個(gè)方面提供了一種鑒定惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟：

1)提取待測惡性瘧原蟲基因組DNA；

2)惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因序列的擴(kuò)增(用PCR技術(shù)從含有目的基因的惡性瘧原蟲基因組DNA中獲取惡性瘧原蟲Pfmspdbl2的DNA片段)；

3)分別將擴(kuò)增產(chǎn)物送測序，經(jīng)序列比對后，得到多態(tài)性鑒定結(jié)果。

步驟1)具體為：用打孔器將血濾紙片剪裁成直徑約3cm的小片，3枚，放入1.5ml離心管中，按照試劑盒的操作手冊，提取待測惡性瘧原蟲基因組DNA。

步驟2)具體為：以惡性瘧原蟲基因組DNA作為模板，設(shè)計(jì)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性3.0min，98℃變性10sec，55℃退火15sec，68℃延伸3.0min，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min，最后保存于4℃。

步驟3)具體為：分別將擴(kuò)增產(chǎn)物送測序，經(jīng)序列比對后，得到多態(tài)性鑒定結(jié)果。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因擴(kuò)增結(jié)果示意圖。圖1中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-10：PCR產(chǎn)物。

圖2是實(shí)施例1中惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因NJ進(jìn)化樹分析圖。

圖3是實(shí)施例1中惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性π值分析圖。

圖4是實(shí)施例1中惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性Tajima’s D值的分析圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性的鑒定

1材料

1.1惡性瘧原蟲基因組DNA

來自于被惡性瘧原蟲感染的病人的濾紙血，從云南省瘧疾流行區(qū)采集。

1.2主要試劑

2方法

2.1惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因的擴(kuò)增

根據(jù)惡性瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)株3D7株P(guān)fmspdbl2基因?yàn)槟康臄U(kuò)增片段，利用上海英駿生物技術(shù)有限公司引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物，該特異性引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下：

上游：5′-GCATTCGATATATGTAATAATTATTAT-3′(如SEQ ID NO：1所示)；

下游：5′-GCTTTATAAGAAACACATATCTAA-3′(如SEQ ID NO：2所示)。

以惡性瘧原蟲基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件

為98℃預(yù)變性3.0min，98℃變性10sec，55℃退火15sec，68℃延伸3.0min，35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min，最后保存于4℃。DNA聚合酶購自TaKaRa。反應(yīng)體系為25.0μl，具體為5x PrimeSTAR GXL Buffer(緩沖液)5.0μl；dNTP Mixture(2.5mM each)2.0μl；Primer F(上游引物)(10μM each)1.0μl；Primer R(下游引物)(10μM each)1.0μl；Template DNA(DNA模板)3.0μl；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(聚合酶)0.5μl；Nuclease-free water(無核酸酶水)12.5μl。

2.2惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的測序和序列分析

將PCR擴(kuò)增成功的產(chǎn)物送上海華大基因公司進(jìn)行測序，選用標(biāo)準(zhǔn)株3D7作為參照。利用BioEdit軟件對所獲得的基因序列進(jìn)行排序分析，利用MEGA4.1評估序列多態(tài)性。

3結(jié)果

3.1惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因的擴(kuò)增

以惡性瘧原蟲基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出2043bp與預(yù)期長度一致的目的片段(見圖1)，表明成功擴(kuò)增出Pfmspdbl2基因。

3.2惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因擴(kuò)增產(chǎn)物的測序和序列分析

3.2.1測序分型結(jié)果

PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司上海分公司測序。測序結(jié)果顯示，Pfmspdbl2基因16樣本中，野生型占81.25％(13/16)，突變型占18.75％(3/16)，NJ進(jìn)化樹見圖2。

3.2.2π和dn/ds比值分析

以MEGA4.1軟件分析中緬邊境16樣本Pfmspdbl2核苷酸序列多態(tài)性結(jié)果顯示π值為0.04461，利用DnaSP軟件統(tǒng)計(jì)16個(gè)序列，Pfmspdbl2的dn/ds值為1.50934(dn/ds>1比值分析顯示該多態(tài)性可能整體上受到正向選擇的影響(見圖3)。

3.2.3Tajima檢驗(yàn)

Pfmspdbl2的Tajimas’s D值為0.24087，p>0.05沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是Tajima’s D大于0，說明Pfmspdbl2是受平衡選擇的影響(見圖4)。

4討論

瘧疾的流行除受社會、自然和文化環(huán)境影響之外，其本身復(fù)雜多樣的遺傳結(jié)構(gòu)亦是影響瘧疾流行的重要原因。不同地理株惡性瘧原蟲存在表型差異，多表現(xiàn)在藥物抗性及毒力、生長繁殖、基因表達(dá)、入侵紅細(xì)胞和配子體產(chǎn)生等方面。在惡性瘧原蟲中，裂殖子表面蛋白MSP1和裂殖子表面蛋白MSP2在序列和大小上具有顯著多態(tài)性，裂殖子表面蛋白MSP3的多態(tài)性則相對局限。MSP3家族成員MSPDBL2是惡性瘧原蟲入侵紅細(xì)胞的重要蛋白，以MSPDBL2為標(biāo)靶研制相關(guān)疫苗之前必須考慮并分析其基因多態(tài)性特點(diǎn)，評估其在不同地理區(qū)域和不同人群中的多態(tài)性變化水平十分重要。

本發(fā)明公開了一種鑒定惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性的引物及方法，Pfmspdbl2多態(tài)性的影響因素分析，可為以Pfmspdbl2為基礎(chǔ)建立有效傳播阻斷疫苗的研究提供一定的線索。同時(shí)對基因型序列的了解，對于判斷傳染來源，了解病例是輸入感染還是當(dāng)?shù)馗腥揪哂兄匾淖饔谩?/p>

綜上所述，上述各實(shí)施例及附圖僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，皆應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110>中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所

<120>鑒定惡性瘧原蟲Pfmspdbl2基因多態(tài)性的引物及方法

<130> CPC-NP-16-100346-1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 1

GCATTCGATATATGTAATAATTATTAT 27

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 2

GCTTTATAAGAAACACATATCTAA 24