本發(fā)明涉及中藥材，尤其涉及一種提高桑黃活性成分含量的方法。

背景技術(shù)：

桑黃是我國(guó)珍稀的藥用真菌。桑黃別名猢猻眼、桑耳、桑臣等，是一種珍貴的大型藥用真菌，其子實(shí)體可入藥。因寄生于桑樹(shù)而得名，桑黃在我國(guó)分布較廣，主要生長(zhǎng)在我國(guó)華北、東北、西北及四川、云南等地，在韓國(guó)和日本等一些東亞國(guó)家也均有生長(zhǎng)，被譽(yù)為“森林黃金”，具有野生子實(shí)體數(shù)量少，人工栽培難度高的特點(diǎn)。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)將桑黃運(yùn)用在血崩、血淋、閉經(jīng)等疾病?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑黃在抗癌方面效果顯著，除此之外，還有抗肺炎、降血脂、抗氧化以及保護(hù)肝臟等作用。是當(dāng)今醫(yī)藥和食品工業(yè)共同研究和關(guān)注點(diǎn)。

隨著桑黃藥用價(jià)值的深入研究，市場(chǎng)對(duì)于桑黃的需求量逐年增加，造成了對(duì)桑黃子實(shí)體的破壞性開(kāi)采，對(duì)于產(chǎn)地的保護(hù)意識(shí)淡薄，造成了子實(shí)體難以成型，資源日益枯竭，在我國(guó)的部分地區(qū)已難以尋找到桑黃的蹤跡，大部分產(chǎn)區(qū)已岌岌可危。人工栽培難度較大，桑黃的開(kāi)發(fā)和利用也因此受到限制。

液體發(fā)酵技術(shù)、固體培養(yǎng)技術(shù)和人工栽培技術(shù)是目前獲得桑黃菌絲體和子實(shí)體主要的途徑。目前，由于子實(shí)體規(guī)模化人工栽培技術(shù)尚不十分成熟，市場(chǎng)上大多采用液體發(fā)酵技術(shù)來(lái)獲取桑黃子實(shí)體或非子實(shí)體產(chǎn)物，對(duì)活性成分的研究甚少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種提高桑黃活性成分含量的方法，采用液體發(fā)酵的方式，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高多糖和黃酮的含量。

技術(shù)方案：本發(fā)明所述的提高桑黃活性成分含量的方法，包括：將桑黃種子液接種于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，所述的液體培養(yǎng)基中含有碳源和氮源，所述的碳源為麥芽糖，所述的氮源為酵母提取物。

所述麥芽糖在液體培養(yǎng)基中的濃度為2-6％，優(yōu)選為2-4％，更優(yōu)選為2％。

所述酵母提取物在液體培養(yǎng)基中的濃度為0.1-0.4％，優(yōu)選為0.2-0.4％，更優(yōu)選為0.4％。

發(fā)酵時(shí)液體培養(yǎng)基中還含有MgSO₄·7H₂O 0.4-0.6‰，KH₂PO₄ 4.5-5‰。優(yōu)選的，發(fā)酵時(shí)液體培養(yǎng)基中還含有MgSO₄·7H₂O 0.5‰，KH₂PO₄ 4.6‰。

上述濃度是指質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

所述桑黃種子液的制備方法為：將桑黃菌種活化后接種于PDA液體培養(yǎng)基，27-29℃搖床中以150-170r/min培養(yǎng)6-7d。

發(fā)酵時(shí)，接種量為9-10％。

所述發(fā)酵的溫度為27-29℃，搖床轉(zhuǎn)速為150-170r/min，時(shí)間為6-9d。優(yōu)選的，所述發(fā)酵的溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為160r/min，時(shí)間為7d。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明采用液體發(fā)酵的方式，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高多糖和黃酮的含量。桑黃的生長(zhǎng)條件在0.2％麥芽糖為碳源，0.4％酵母提取物為氮源時(shí)，多糖和黃酮含量可以獲得較高值。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2不同碳源百分含量下桑黃多糖、黃酮含量；

圖2為實(shí)施例2不同碳源百分含量下桑黃多糖、黃酮的總產(chǎn)量；

圖3為實(shí)施例3不同氮源百分含量下桑黃多糖、黃酮含量；

圖4為實(shí)施例3不同氮源百分含量下桑黃多糖、黃酮總產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的各種等價(jià)形式的修改均落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求所限定的范圍。

實(shí)施例1

桑黃的液體發(fā)酵方法，包括：

(1)菌種活化

將桑黃菌種接種在PDA固體培養(yǎng)基上，放置在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14d，用于液體培養(yǎng)的接種。

(2)桑黃一級(jí)種制備

將配置好的PDA液體培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，每瓶裝100mL，高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30min后使用。在無(wú)菌條件下，用直徑為6mm的無(wú)菌打孔器在已活化的固體培養(yǎng)基上打孔，挑選8片菌種片放入PDA液體培養(yǎng)基中，接種后將三角瓶放入28℃搖床中以160r/min培養(yǎng)7d，獲得桑黃一級(jí)種。

(3)發(fā)酵

在超凈工作臺(tái)中無(wú)菌條件下，使用種子打碎機(jī)將發(fā)酵生長(zhǎng)成的一級(jí)菌種打碎，按10％(v/v)的接種量接入用于發(fā)酵的液體培養(yǎng)基的三角瓶中，pH自然，放置在搖床中以28℃，轉(zhuǎn)速160r/min的發(fā)酵條件培養(yǎng)7d。

多糖含量的測(cè)定方法如下：

多糖的制備：桑黃菌種接種至液體培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)至菌絲球充滿(mǎn)培養(yǎng)基后過(guò)濾，用60目篩子濾去培養(yǎng)基，用蒸餾水洗滌，放置在無(wú)紡布上60℃干燥，得干菌絲體，研磨成粉，稱(chēng)重。精確稱(chēng)取0.05g的菌絲體，浸泡于5mL 1mol/L的NaOH溶液中，于100℃水浴提取1小時(shí)，所得的提取液即為多糖粗品。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：稱(chēng)取干燥(恒溫干燥箱60攝氏度，6小時(shí))至恒重的葡萄糖10mg，放置于100ml的容量瓶，加去離子水定容，即為0.1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1mL，1.2mL，1.4mL，1.6mL分別加入到各具塞試管中，用去離子水補(bǔ)足每管2ml，各管加入1ml的6％苯酚，迅速搖勻。再加入5ml的濃硫酸，放入時(shí)不要沿管壁加入，直接添加有利于濃硫酸快速與樣品混合，靜置10分鐘，100℃水浴15分鐘。取出后放置到室溫，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)量各管吸光度。以試管溶液中的糖濃度為橫坐標(biāo)，各試管分別測(cè)得的吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。試劑空白為參比。

桑黃多糖的含量測(cè)定：采用苯酚硫酸法測(cè)定桑黃多糖的含量。精密稱(chēng)取桑黃多糖0.02mL，用去離子水補(bǔ)足至2mL即為供試品溶液，加入試劑量和操作方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作相同，在分光光度計(jì)上測(cè)量其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算多糖含量。

黃酮含量的檢測(cè)方法如下：

黃酮的萃?。悍Q(chēng)取研磨成粉的桑黃菌絲0.05g，加入5mL70％乙醇，放置在超聲波清洗儀中提取1h，獲得萃取液。

桑黃黃酮的含量測(cè)定：定量移取樣品液1mL于25mL容量瓶中，加入30％乙醇補(bǔ)充至10mL，加入5％NaN0₂ 0.2mL搖勻，靜置5分鐘，加入0.2mL 10％A1(N0₃)₃靜置6分鐘后，加2mL 4％NaOH，加入70％乙醇補(bǔ)充至50mL，510nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定，試劑空白為參比。

蘆丁/乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定：精密稱(chēng)取30mg蘆丁，用70％乙醇配制50ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分別加入到各具塞試管中，各加5％NaNO₂溶液0.2mL，搖勻，放置6min；而后各加10％Al(NO3)3溶液0.2mL，搖勻放置6min；然后加4％NaOH溶液2mL，加70％乙醇定容至5mL，于510nm處測(cè)吸光度，做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。計(jì)算各樣品的黃酮含量。

實(shí)施例2不同百分比的碳源試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：實(shí)施例1的步驟(3)中，液體培養(yǎng)基含不同百分比的碳源(培養(yǎng)基配方為：麥芽糖，酵母提取物2g，蛋白胨2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄4.6g，去離子水1L)，不同百分比的碳源液體培養(yǎng)基中，麥芽糖的含量分別為0.5％、1％、2％、4％、6％。將配置好的不同百分比的碳源液體培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，每瓶100ml，用封口膜封口，再用橡皮筋扎緊。每個(gè)百分比做3個(gè)重復(fù)，高壓蒸汽滅菌鍋121℃下滅菌30min。其他步驟同實(shí)施例1，考察碳源對(duì)桑黃生物活性(多糖和黃酮)的影響。

試驗(yàn)結(jié)果：

碳源是真菌最重要的營(yíng)養(yǎng)成分。它是碳水化合物和蛋白質(zhì)的基本組成元素，又是重要的能量來(lái)源，在相同碳源的不同百分比的液體培養(yǎng)基中，麥芽糖的百分含量分別為0.5％、1％、2％、4％、6％。將已接種的培養(yǎng)基以28℃、160r/min培養(yǎng)7d，檢測(cè)菌絲體的多糖含量和黃酮含量，結(jié)果如圖1、表1。

表1 不同碳源百分含量下桑黃多糖和黃酮含量的差異顯著性

如圖1、表1所示，桑黃菌種在幾個(gè)含有不同碳源百分比的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，但不同碳源對(duì)菌絲多糖及黃酮含量的影響有顯著差異。培養(yǎng)基含有2％的麥芽糖時(shí)桑黃菌株中的黃酮和多糖含量較高，而在麥芽糖含量為4％和6％時(shí)菌絲體中的多糖濃含量較高，但黃酮含量較低。在檢測(cè)多糖和黃酮含量的同時(shí)，對(duì)多糖和黃酮的總產(chǎn)量也進(jìn)行了計(jì)算，如圖2、表2。

表2 不同碳源百分含量下桑黃多糖和黃酮總產(chǎn)量的差異顯著性

如圖2、表2所示，麥芽糖含量在2％時(shí)，多糖和黃酮的總產(chǎn)量較高，在4％和6％含量下多糖含量雖然高，但是黃酮總產(chǎn)量較2％時(shí)要低，所以認(rèn)為，選取2％碳源含量為培養(yǎng)桑黃的最佳碳源百分含量。

實(shí)施例3不同百分比的氮源試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：實(shí)施例1的步驟(3)中，液體培養(yǎng)基含不同百分比的氮源(培養(yǎng)基配方為：麥芽糖20g，酵母提取物，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 4.6g，去離子水1L)，在不同百分比的氮源液體培養(yǎng)基中，酵母提取物的百分含量分別為0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.2％。將配置好的不同百分比的氮源液體培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，每瓶100ml，用封口膜封口，再用橡皮筋扎緊。每個(gè)百分比做3個(gè)重復(fù)。高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌30min。其他步驟同實(shí)施例1，考察氮源對(duì)桑黃生物活性(多糖和黃酮)的影響。

試驗(yàn)結(jié)果：

氮源主要是指成分中含有較多氮的物質(zhì)，主要用以真菌合成蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)。大部分真菌可以有效地利用有機(jī)氮為自身提供營(yíng)養(yǎng)。氮元素對(duì)桑黃的生長(zhǎng)有益處。在相同氮源的不同百分含量的培養(yǎng)基中，酵母提取物的百分含量分別為0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.2％。用相同條件培養(yǎng)桑黃菌種，對(duì)獲得的菌絲球進(jìn)行多糖和黃酮含量測(cè)定，結(jié)果如圖3、表3。

表3 不同氮源百分含量下桑黃多糖和黃酮含量的差異顯著性

從圖3、表3中可以看出，在酵母提取物含量在0.2％和0.4％時(shí)，多糖和黃酮含量較高，較之其他氮源含量有顯著差異。為了對(duì)比得出氮源濃度的優(yōu)劣，對(duì)多糖和黃酮的總產(chǎn)量也進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果如圖4、表4。

表4 不同氮源百分含量下桑黃多糖和黃酮總產(chǎn)量的差異顯著性

如圖4，表4所示，可以看出氮源百分含量在0.4％時(shí)，桑黃多糖和黃酮的總產(chǎn)量均高于其他百分比，所以，選擇0.4％作為桑黃發(fā)酵的最適氮源。

在培養(yǎng)溫度為28℃、搖床轉(zhuǎn)速為160r/min、發(fā)酵時(shí)間為7d的條件下，以桑黃菌絲多糖和黃酮含量為指標(biāo)，研究得出，2％麥芽糖為碳源最適百分比，0.4％酵母提取物為氮源最適百分比，多糖和黃酮的含量可以達(dá)到較高值。