本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種抗癌肽及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性群體中最常見(jiàn)的癌癥，每年新增的乳腺癌患者可達(dá)138萬(wàn)人。WHO調(diào)查表明，2014年中國(guó)女性中乳腺癌患者已達(dá)到187,213人，在所有女性癌癥種類中位列第二。

目前，化療是治療大多數(shù)癌癥的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)療法。已知的可以治療乳腺癌的化療藥物包括天然活性成分(例如紫杉醇、姜黃素、長(zhǎng)春新堿、芹黃素和三氧化二砷等)和化學(xué)藥物(例如環(huán)磷酰胺、卡培他濱、5-氟尿嘧啶等)。由于乳腺癌分子表型各異，對(duì)同種藥物或療法的敏感性也差異甚大，不同表型的乳腺癌免疫原性也不盡相同，且反復(fù)用藥還會(huì)導(dǎo)致耐藥性的形成。因此，探索不同機(jī)制的藥物克服以上困難迫在眉睫。

抗癌肽(Anticancer peptides，ACPs)是一類陽(yáng)離子的兩親性小肽，其氨基酸殘基不超過(guò)50個(gè)且含有堿性和疏水殘基。由于微生物細(xì)胞膜表面和腫瘤細(xì)胞膜表面一樣，都富含負(fù)電荷的糖脂和(或)糖蛋白，因而很多抗菌肽(Antimicrobal peptides，AMPs)往往同時(shí)兼?zhèn)淇咕涂鼓[瘤的雙重作用。ACPs和AMPs均可通過(guò)自身的正電荷與腫瘤細(xì)胞膜或者微生物細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷分子的靜電作用而定位到細(xì)胞膜上，進(jìn)而在膜上聚集鑲嵌在細(xì)胞膜內(nèi)或者穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)干擾細(xì)胞膜的整合而使細(xì)胞裂解或者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。所以ACPs和AMPs也被稱為細(xì)胞滲透性多肽。由于CPPs的細(xì)胞滲透性，使其不僅可以作為開(kāi)發(fā)ACPs和AMPs的資源庫(kù)，也可以作為其他藥物—核酸、蛋白、成像試劑和小分子藥物等的載體，介導(dǎo)這些藥物進(jìn)入靶細(xì)胞。

ACPs因其獨(dú)特的作用機(jī)制而可以成為很有潛力的抗腫瘤藥物。但是，天然來(lái)源的ACPs有很多缺點(diǎn)，例如活性不高、選擇性不強(qiáng)、溶血活性太強(qiáng)、穩(wěn)定性差等，因而不能直接應(yīng)用于臨床。同時(shí)，采用化療藥物對(duì)不同亞型的乳腺癌進(jìn)行治療的過(guò)程中，藥物可能會(huì)通過(guò)對(duì)乳腺癌細(xì)胞ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP binding cassette transporter)在翻譯水平上進(jìn)行調(diào)控，誘導(dǎo)癌細(xì)胞DNA甲基化的異常，或者促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)諸如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp/MDR1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(Multidrug resistance associated protein，MRP)和乳腺癌耐藥蛋白(Breast cancer resistance protein，BCRP)藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等多種途徑形成多藥耐藥機(jī)制。盡管腫瘤細(xì)胞對(duì)ACPs的耐藥性尚未見(jiàn)報(bào)道，但是一些病原菌，例如鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococci)和糞腸球菌(Enterococcus faecalis)對(duì)AMPs的耐藥性已有報(bào)道。

因此，克服天然ACPs的不足，使其更加符合臨床要求以改善其抗腫瘤活性勢(shì)在必行。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種天然抗癌肽的改造方法，以解決上述問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種抗癌肽，其選自下列組的序列中的一種或兩種：

a)、具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

b)、具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本發(fā)明共提供了13條對(duì)癌細(xì)胞具有顯著抑制作用的抗癌肽，其中CMAP-L-242(SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列)及CMAP-L-253(SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列)具有尤其顯著的抗癌活性，在本發(fā)明的實(shí)施例中，這兩條多肽對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用與對(duì)照組相比差異達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)，且細(xì)胞毒性也很小。

如上所述的抗癌肽在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的抗癌肽細(xì)胞毒性小，在人體中使用安全。優(yōu)選的，所述抗癌藥物對(duì)抗的腫瘤種類選自：

腸癌、卵巢癌、前列腺癌癥、肝癌、肺癌、淋巴癌、胰腺癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、耳溝癌、腮腺癌、喉道癌等；更優(yōu)選的，所述抗癌藥物對(duì)抗的腫瘤選自乳腺癌。

本發(fā)明對(duì)所提供的抗癌肽在MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞的敏感性進(jìn)行了驗(yàn)證，證明所述抗癌肽可很好地用于乳腺癌的治療。

一種用于抑制癌細(xì)胞增殖或者增加癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物，所述藥物組合物包含由選自于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列所示的肽或者上述兩種肽的組合，以及可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。

包含所述肽或所述物質(zhì)作為活性成分的組合物可以包含多于一類的選自于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油和乙醇的藥物稀釋劑，但所述稀釋劑不限于這些。

根據(jù)服藥目的和具體疾病可以以不同的方式給予所述組合物。應(yīng)理解，實(shí)際給予的活性成分的量應(yīng)該根據(jù)多種相關(guān)因素確定，包括需要治療的病癥，患者癥狀的嚴(yán)重程度，同時(shí)服用的其他藥物(例如化學(xué)治療劑)，所述患者個(gè)體的年齡、性別、體重，飲食，服藥時(shí)間，選擇的給藥途徑以及所述組合物的比例。所述組合物藥的劑量和給藥途徑可根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度進(jìn)行調(diào)節(jié)。

包含本發(fā)明的肽或物質(zhì)的組合物可以通過(guò)口服或腸胃外途徑給藥。腸胃外服藥意思是通過(guò)口服之外的途徑給予藥物，包括直腸給藥、靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥和肌內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、鼻內(nèi)給藥、吸入、眼部給藥以及皮下給藥。

可以將包含所述肽或物質(zhì)的藥物制劑制備成口服劑型、注射液或局部用制劑等任何形式。所述制劑可以被優(yōu)選制備成口服和注射給藥(真溶液、懸液或乳劑)的形式，并且最優(yōu)選是口服形式例如片劑、膠囊、軟膠囊、液體藥劑、丸劑、顆粒劑等等。

在制備所述制劑過(guò)程中，可以在無(wú)任何賦形劑的情況下將所述肽填充進(jìn)軟膠囊中，或者將所述肽與載體混合或用載體稀釋后形成適當(dāng)?shù)闹苿?。合適的載體的實(shí)例為淀粉、水、鹽水、林格氏(Ringer’s)溶液、葡萄糖等。

本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)編碼如上所述抗癌肽的基因序列；

優(yōu)選的，所述基因序列具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列編碼SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

需要注意的是，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)與上述核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，以及功能等價(jià)體序列。本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的基因序列不僅限于SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，還包括根據(jù)宿主細(xì)胞對(duì)密碼子的偏好性推算出來(lái)的具有簡(jiǎn)并性的其他核苷酸序列，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的。功能等價(jià)體序列還包括與SEQ ID NO：1或2所示序列有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性，且具有編碼抗癌活性多肽的核苷酸序列，在基于本發(fā)明提供內(nèi)容的基礎(chǔ)上，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是容易通過(guò)有限次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證的。其中，序列同一性的百分比可以通過(guò)公知的生物信息學(xué)算法來(lái)獲得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比對(duì)法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比對(duì)法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟悉的。

一種載體，其包含如上所述的基因序列。

本發(fā)明所提供的基因序列可被插入質(zhì)粒、粘粒、病毒(如噬菌體、腺病毒、慢病毒等)、細(xì)菌人工染色體或其他適合轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中的任何載體中。

優(yōu)選的，如上所述的載體，所述載體為pGEX-3X或pMDTM19-T。

一種宿主細(xì)胞，其被如上所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。

優(yōu)選的，如上所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。

一種制備如上所述抗癌肽的方法，包括如下步驟：

在培養(yǎng)基中和合適的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)如上所述的宿主細(xì)胞；

從培養(yǎng)基中或從所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中回收如此產(chǎn)生的抗癌肽。

一種制備如上所述抗癌肽的方法，其特征在于，通過(guò)多肽合成儀進(jìn)行人工合成。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為PEPstrMOD預(yù)測(cè)的多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)；A.CMAP-L-20；B.CMAP-L-23；C.CMAP-L-24；D.CMAP-L-25；

圖2為第一階段所設(shè)計(jì)的多肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用；濃度(100μM)，作用時(shí)間(24h)；

圖3為第二階段所設(shè)計(jì)的多肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用；濃度(100μM)，作用時(shí)間(24h)；

圖4為PEPstrMOD預(yù)測(cè)的多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)；

A.CMAP-L-201；B.CMAP-L-202；C.CMAP-L-232；D.CMAP-L-233；

E.CMAP-L-242；F.CMAP-L-243；G.CMAP-L-252；H.CMAP-L-253；

圖5為所選多肽對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞的抑制作用；濃度(100μM)，作用時(shí)間(24h)；

圖6為所選多肽對(duì)MCF10A和293FT的抑制作用；濃度(100μM)，作用時(shí)間(24h)；

圖7為所選多肽在不同濃度下的溶血率；

A.CDDP；B.CMAP-L-20；C.CMAP-L-23；D.CMAP-L-24；

E.CMAP-L-242；F.CMAP-L-25；G.CMAP-L-253；

圖8為所選多肽的螺旋-輪結(jié)構(gòu)圖；

圖9為多肽CMAP-L-242和CMAP-L-25作用于乳腺癌細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞形態(tài)變化；

A.MDA-MB-231；B.MCF7；C.BT-474；D.ZR-75-1。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

在本實(shí)施例中，以抗菌肽CMAP-8為例，論述本發(fā)明提供的抗癌肽改造方法。

一、材料與方法

1.1材料

1.1.1數(shù)據(jù)庫(kù)

APD(http://aps.unmc.edu/AP/)，用來(lái)計(jì)算多肽的凈電荷和疏水度。CancerPPD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://crdd.osdd.net/raghava/cancerppd/)，用來(lái)查看具有抗乳腺癌活性的ACPs的理化性質(zhì)。

1.1.2軟件

多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件PEPstrMOD：

http://osddlinux.osdd.net/raghava/pepstrmod/。

多肽抗癌活性預(yù)測(cè)軟件AntiCP：

http://crdd.osdd.net/raghava/anticp/index.html。

多肽滲透性預(yù)測(cè)軟件CellPPD：

http://crdd.osdd.net/raghava/cellppd/index.html。

多肽毒性預(yù)測(cè)軟件ToxinPred：

http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/。

多肽的螺旋-輪結(jié)構(gòu)圖生成軟件HELIQUEST analysis：

http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/(Romain Gautier等，2008)。

化學(xué)結(jié)構(gòu)模擬軟件：RasMol 2.7.2.1.1。

作圖軟件：GraphPad Prism 5.0。統(tǒng)計(jì)與分析軟件：SPSS20.0。

1.1.3主要試劑

DMEM培養(yǎng)液(HyClone公司)

RPMI-1640培養(yǎng)液(HyClone公司)

DMEM/F12培養(yǎng)液(HyClone公司)

北美胎牛血清(SCIENCELL公司)

馬血清(Gbico公司)

精蛋白生物合成人胰島素(諾和諾德(中國(guó))制藥有限公司)

牛胰島素(Sigma公司)

重組人表皮生長(zhǎng)因子(PEPROTHECH公司)

氫化可的松(北京索萊寶科技有限公司)

胰酶消化液(HyClone公司)

MTT(噻唑藍(lán)，北京索萊寶科技有限公司)

PBS(粉末，武漢博士德生物工程有限公司)

二甲基亞砜(DMSO)(化學(xué)純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)

二甲基亞砜(DMSO)(生物純，Sigma公司)

順鉑(cis-diamminedichloroplatinum，CDDP)(齊魯制藥有限公司)

1.1.3細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞：MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1；人胚腎上皮細(xì)胞：293FT；人乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞：MCF10A；人血紅細(xì)胞：從人靜脈血中分離所得。

1.1.4試劑配制

(1)多肽溶液的配制(1mM)：所合成的多肽的規(guī)格均為20mg。根據(jù)各個(gè)多肽的相對(duì)分子量計(jì)算出配制1mM溶液所需PBS的體積后，無(wú)菌環(huán)境下將多肽粉末溶解于PBS溶液中，-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)MTT溶液的配制(5mg/mL)：稱取100.00mg MTT粉末溶解于20mL無(wú)菌PBS溶液中，充分?jǐn)嚢枞芙?，無(wú)菌環(huán)境下濾膜(0.22μm)過(guò)濾除菌，分裝后于-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)PBS溶液的配制：取PBS粉末按照包裝說(shuō)明溶解于對(duì)應(yīng)體積的超純水中，磁力攪拌器攪拌至完全溶解，分裝后于105Kpa滅菌30min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)氫化可的松溶液的配制(5mg/mL)：稱取100.00mg氫化可的松粉末溶解于20mL無(wú)水乙醇中，無(wú)菌環(huán)境下濾膜(0.22μm)過(guò)濾除菌，分裝后于-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)溶液的配制(20μg/mL)：PEPROTHECH公司的EGF規(guī)格為100μg，并配有1mL的溶解液(原裝超純水)和10mL的PBS溶液。將EGF粉末于3000rpm離心5min后溶解于1mL溶解液中，再加入4mL的PBS溶液使終體積為5mL。無(wú)菌環(huán)境下濾膜(0.22μm)過(guò)濾除菌，分裝后于-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)牛胰島素溶液的配制(1mg/mL)：Sigma公司的牛胰島素規(guī)格為25mg。將胰島素粉末溶解于不含酚紅的F12培養(yǎng)液中，無(wú)菌環(huán)境下濾膜(0.22μm)過(guò)濾除菌，分裝后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(7)CDDP溶液的配制(1mM)：稱取10.00mg順鉑溶解于33.328mL生理鹽水(0.9％的NaCl溶液)中，無(wú)菌環(huán)境下濾膜(0.22μm)過(guò)濾除菌，分裝后于-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

(8)細(xì)胞凍存液的配制(含10％的DMSO)：取9mL胎牛血清和1mL DMSO(生物純)，混勻后即為細(xì)胞凍存液，分裝后于-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1多肽設(shè)計(jì)

抗菌肽CMAP-8(KDLLSAMLSGVDPK)由貴州大學(xué)真菌資源研究所從蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)中分離所得。為了逐步探究影響ACPs抗腫瘤活性的理化因素和三級(jí)結(jié)構(gòu)，以CMAP-8為母鏈進(jìn)行兩個(gè)階段的設(shè)計(jì)。

在第一階段中，首先對(duì)APD和CancerPPD數(shù)據(jù)庫(kù)中具有抗乳腺癌活性多肽的理化性質(zhì)(一級(jí)序列、氨基酸殘基的數(shù)目、多肽構(gòu)象、抗癌活性、凈電荷和疏水殘基的百分比)進(jìn)行分析。隨后，根據(jù)對(duì)所得信息分析的結(jié)果，利用Lys和Phe兩種氨基酸分別從凈電荷和疏水殘基百分比兩方面對(duì)CMAP-8進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，得到系列多肽。用PEPstrMOD服務(wù)器預(yù)測(cè)所得系列多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用AntiCP、CellPPD和ToxinPred分別預(yù)測(cè)多肽衍生物是否具有抗腫瘤活性、細(xì)胞滲透性和毒性。最后，人工合成所設(shè)計(jì)的多肽并檢測(cè)其體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制活性。篩選出抗乳腺癌活性較好的多肽并分析所選多肽抗癌活性與理化性質(zhì)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

以第一階段中篩選所得的多肽為母鏈進(jìn)行第二階段的設(shè)計(jì)。不改變母鏈中氨基酸殘基的種類和數(shù)目，僅通過(guò)多肽一級(jí)序列的調(diào)整使多肽中的α-螺旋位于不同的位置或者消失，再次得到系列多肽。用PEPstrMOD服務(wù)器預(yù)測(cè)所得系列多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用AntiCP、CellPPD和ToxinPred分別預(yù)測(cè)多肽衍生物是否具有抗腫瘤活性、細(xì)胞滲透性和毒性。最后，人工合成所設(shè)計(jì)的多肽并檢測(cè)其體外對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制活性。篩選出抗乳腺癌活性較好的多肽并分析所選多肽抗癌活性與α-螺旋在多肽中的有無(wú)和位置之間的關(guān)系。綜合分析多肽抗癌活性與理化性質(zhì)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，了解氨基酸殘基對(duì)多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響以及α-螺旋對(duì)多肽抗癌活性的影響。

2.2.2多肽合成

所有多肽均由上海波泰生物科技有限公司(Shanghai Bootech BioScience&Technology Co.，Ltd)采用Fmoc/PyBOP固相合成法合成，再用反向高效液相色譜儀(Reverse-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)純化。純化后多肽(純度為98％)的分子量和純度分別用質(zhì)譜儀和高效液相色譜儀(High-performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定。所有的多肽均以干凍粉的形式封裝保存。

2.2.3細(xì)胞培養(yǎng)

MDA-MB-231、BT-474和293FT培養(yǎng)于含10％FBS、1％非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液；ZR-75-1培養(yǎng)于含20％FBS、1％非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液；MCF7培養(yǎng)于含10％FBS、0.2U/mL人胰島素、1％非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液；MCF10A培養(yǎng)于含5％馬血清、0.5μg/mL氫化可的松、20ng/mL EGF、10μg/mL牛胰島素、1％非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM/F12完全培養(yǎng)液。所有的細(xì)胞均在37℃，5％CO₂，100％濕度的條件下培養(yǎng)。

2.2.4細(xì)胞增殖抑制的測(cè)定(MTT法)

采用MTT法檢測(cè)多肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外抑制作用和對(duì)正常細(xì)胞毒性作用。MTT的化學(xué)名稱是3-(4，5二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍(lán)，是一種四唑鹽。外源的MTT進(jìn)入活細(xì)胞線粒體后可被琥珀酸脫氫酶還原成藍(lán)紫色的結(jié)晶物—甲瓚(Formazan)，沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞由于線粒體失活故不能還原MTT。因此，在一定的細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)，活細(xì)胞還原MTT生成甲瓚的量與活細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)。DMSO可溶解甲瓚，用酶標(biāo)儀測(cè)定甲瓚溶液在570nm處的光密度OD值可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算可得多肽對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率。

(1)培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)收集對(duì)數(shù)期的乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。用各自細(xì)胞的完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，各細(xì)胞加入到96孔板中的細(xì)胞數(shù)如表1所示，每孔100μL。37℃，5％CO₂，100％濕度下培養(yǎng)24h以保證細(xì)胞狀態(tài)良好，貼壁正常。

(2)加藥處理，多肽溶液經(jīng)各細(xì)胞相應(yīng)的完全培養(yǎng)液稀釋后加入96孔板，使其終濃度為100μM，藥物加入后每孔中液體總體積為200μL。CDDP也以同樣的濃度和方式加入到96孔板中作為陽(yáng)性對(duì)照，與多肽藥物等體積的PBS溶液經(jīng)相應(yīng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液稀釋后加入96孔板作為陰性對(duì)照，另外直接加入100μL各細(xì)胞相應(yīng)的完全培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。

(3)藥物處理完成后，在37℃，5％CO₂，100％濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。無(wú)菌條件下每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2h。

(4)測(cè)量結(jié)果，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMSO，振蕩使甲瓚結(jié)晶充分溶解，在570nm處測(cè)OD值。

(5)計(jì)算細(xì)胞存活率(％)＝(測(cè)試組OD值)/(空白組OD值)×100％

表1各細(xì)胞接種量

2.2.5顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

(1)培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞狀態(tài)好時(shí)收集對(duì)數(shù)期的乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。用各自細(xì)胞的完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，各細(xì)胞加入到96孔板中的細(xì)胞數(shù)如表1所示，每孔100μL。37℃，5％CO₂，100％濕度下培養(yǎng)24h以保證細(xì)胞狀態(tài)良好，貼壁正常。

(2)加藥處理，多肽溶液經(jīng)各細(xì)胞相應(yīng)的完全培養(yǎng)液稀釋后加入96孔板，使其終濃度為100μM，藥物加入后每孔中液體總體積為200μL。CDDP也以同樣的濃度和方式加入到96孔板中作為陽(yáng)性對(duì)照，另外直接加入100μL各細(xì)胞相應(yīng)的完全培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。

(3)藥物處理完成后，在37℃，5％CO₂，100％濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察并照相。

2.2.6溶血活性測(cè)定

(1)用EDTAK₂抗凝管采集人靜脈血4mL，充分混勻后備用。

(2)取2mL血樣4℃離心1000×g，10min。用生理鹽水洗三遍，稀釋成2％的紅細(xì)胞混懸液。

(3)將血紅細(xì)胞懸浮液吹打混勻，100μL/孔加入到U型96孔板中。以100μL/孔分別加入多肽和CDDP稀釋液，使得終濃度分別為100μM、50μM、25μM和12.5μM。陰性對(duì)照組為與測(cè)試藥物等體積的PBS溶液，陽(yáng)性對(duì)照組為等體積的無(wú)菌超純水。

(4)37℃，5％CO₂，100％濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h，3000rpm水平離心10min。取上清液至平底96孔板中，410nm處測(cè)OD值

(5)計(jì)算溶血率(％)＝(測(cè)試組OD值-陰性組OD值)/(陽(yáng)性組OD值-陰性組OD值)×100％

三、結(jié)果與分析

3.1第一階段多肽設(shè)計(jì)及檢測(cè)的結(jié)果

3.1.1第一階段多肽設(shè)計(jì)的結(jié)果

在第一階段的設(shè)計(jì)改造中，根據(jù)凈電荷和疏水殘基的百分比的逐漸變化，共設(shè)計(jì)得到了13條多肽衍生物，其序列及理化性質(zhì)見(jiàn)表2。

表2多肽衍生物的序列及分子特征

注：a“+”表示預(yù)測(cè)多肽有該性質(zhì)，“-”表示預(yù)測(cè)多肽沒(méi)有該項(xiàng)性質(zhì)；b“Helical”表示預(yù)測(cè)多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋所占的比例，“Coil”表示預(yù)測(cè)多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲所占的比例。

從表2中AntiCP對(duì)多肽抗癌活性的預(yù)測(cè)結(jié)果可知，除了CMAP-8和CMAP-L-1兩條多肽沒(méi)有抗癌活性外其余多肽均預(yù)測(cè)到抗癌活性。因而可以推測(cè)，對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制效果較好的多肽可能也在除CMAP-8和CMAP-L-1兩條多肽之外其他多肽中。同時(shí)，CellPPD對(duì)多肽細(xì)胞滲透性的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，所有多肽均具有細(xì)胞滲透功能，而且CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25四條多肽細(xì)胞滲透性最強(qiáng)。ToxinePred對(duì)多肽毒性的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，所有多肽均無(wú)細(xì)胞毒性，其中多肽CMAP-L-24細(xì)胞毒性預(yù)測(cè)值最低(-4.63)，因而該多肽的細(xì)胞毒性可能也是最低。PEPstrMOD對(duì)多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CMAP-L-20、CMAP-L-23和CMAP-L-25均為兩段α-螺旋分別位于靠近多肽N端和C端的位置，而多肽CMAP-L-24僅在靠近N端的位置有一小段α-螺旋，該α-螺旋在多肽中所占的比例在所設(shè)計(jì)的13條多肽中為最小(20％)。所預(yù)測(cè)的4條多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。綜合以上結(jié)果可以推測(cè)，CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25四條多肽在抗乳腺癌方面可能會(huì)有特殊的表現(xiàn)。

3.1.2第一階段設(shè)計(jì)的多肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

采用MTT法檢測(cè)了第一階段設(shè)計(jì)改造的多肽對(duì)MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞的抑制率，其結(jié)果如圖2所示。從圖2中可知，抗菌肽CMAP-8對(duì)以上四種乳腺癌細(xì)胞均沒(méi)有明顯的抑制作用，而多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25對(duì)4種乳腺癌細(xì)胞的抑制率與CMAP-8相比差異則均達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)。其中，CMAP-L-25對(duì)ZR-75-1的抑制效果最明顯，在100μM的濃度下，作用24h后細(xì)胞存活率為41.1％。MCF7多肽具有明顯的耐受作用，4條多肽對(duì)其抑制率均低于對(duì)其他3種乳腺癌細(xì)胞。

設(shè)計(jì)改造的多肽體外抗乳腺癌結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致。這表明AntiCP、CellPPD和ToxinPred三個(gè)多肽預(yù)測(cè)服務(wù)器對(duì)多肽相關(guān)性質(zhì)的預(yù)測(cè)結(jié)果是比較準(zhǔn)確的。其原因可能是這3個(gè)多肽預(yù)測(cè)軟件是基于多肽的序列信息而建立起來(lái)的。例如，CellPPD在建立時(shí)考慮了多肽氨基酸的組成、二肽的組成、二進(jìn)制的模式以及序列模體的信息等，而AntiCP在建立時(shí)則大量統(tǒng)計(jì)了多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的ACPs、非ACPs和AMPs中高頻出現(xiàn)的氨基酸進(jìn)而建立的算法對(duì)其他多肽的活性進(jìn)行預(yù)測(cè)。因此，同時(shí)綜合以上3種預(yù)測(cè)指標(biāo)可以對(duì)多肽進(jìn)行有效的設(shè)計(jì)改造，進(jìn)而為其他來(lái)源的天然多肽的設(shè)計(jì)改造提供一個(gè)有效的途徑。

結(jié)合預(yù)測(cè)軟件的設(shè)計(jì)和體外抗乳腺癌的檢測(cè)結(jié)果可知，多肽的凈電荷確實(shí)對(duì)ACPs的抗腫瘤活性有影響。所選出來(lái)對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制效果較好的多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25凈電荷數(shù)均比較大，為+6～+8，均屬于陽(yáng)離子多肽，表明多肽在與乳腺癌細(xì)胞相互作用時(shí)確實(shí)可能先通過(guò)靜電吸引與乳腺癌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸、O-糖苷粘蛋白唾液酸、和肝素等分子相互作用進(jìn)而與細(xì)胞膜接觸。而疏水殘基在這些多肽中所占的比例并非越大越好，但也并非越小越好，而是處于一個(gè)合適的范圍內(nèi)。其原因可能是隨著多肽中疏水殘基比例的升高，多肽的水溶性會(huì)逐漸變差，不利于多肽發(fā)揮藥物活性；而隨著多肽中疏水殘基比例的降低，雖然多肽的水溶性會(huì)變好，但是其兩親性會(huì)變差，對(duì)細(xì)胞膜的親和力也會(huì)降低，因而多肽的藥物活性也會(huì)降低。

3.2第二階段多肽設(shè)計(jì)及檢測(cè)的結(jié)果

3.2.1第二階段多肽設(shè)計(jì)的結(jié)果

經(jīng)過(guò)第一階段的設(shè)計(jì)檢測(cè)篩選后，得到了4條對(duì)MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞具有較好抑制活性的多肽，分別為：CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25。從圖1中PEPstrMOD對(duì)4條多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果可知，CMAP-L-20、CMAP-L-23和CMAP-L-25均有兩段α-螺旋，分別位于靠近多肽N端和C端的位置，而多肽CMAP-L-24僅在靠近N端的位置有一小段α-螺旋。為了討論多肽中α-螺旋的位置及數(shù)目對(duì)多肽抗乳腺癌活性的影響，不改變4條多肽中氨基酸的種類和數(shù)目，僅通過(guò)調(diào)整其一級(jí)序列而再次設(shè)計(jì)得到了系列多肽，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3多肽衍生物的序列及分子特征

注：a加下劃線的單字符表示形成α-螺旋的氨基酸殘基；b“+”表示預(yù)測(cè)多肽有該性質(zhì)，“-”表示預(yù)測(cè)多肽沒(méi)有該項(xiàng)性質(zhì)；c“Helical”表示預(yù)測(cè)多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋所占的比例，“Coil”表示預(yù)測(cè)多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲所占的比例。

表3中，所有多肽的α-螺旋部分均用加下劃線的氨基酸單字符表示，可以看出多肽的凈電荷和疏水度僅與多肽中氨基酸殘基的數(shù)目和種類相關(guān)，與其一級(jí)序列無(wú)關(guān)。AntiCP對(duì)多肽抗癌活性的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，所預(yù)測(cè)的多肽抗癌活性也僅與多肽中氨基酸殘基的數(shù)目和種類相關(guān)，與其一級(jí)序列無(wú)關(guān)，其原因是AntiCP服務(wù)器對(duì)多肽的預(yù)測(cè)是基于對(duì)大量ACPs中不同氨基酸殘基出現(xiàn)頻率的統(tǒng)計(jì)而建立起來(lái)的。CellPPD和ToxinPred對(duì)多肽細(xì)胞滲透性和毒性的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，所預(yù)測(cè)多肽的細(xì)胞滲透性和毒性與多肽的一級(jí)序列相關(guān)。由于多肽一級(jí)序列的改變會(huì)引起其三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而也會(huì)導(dǎo)致多肽抗癌活性、細(xì)胞滲透性和毒性的改變。然而，AntiCP多肽抗癌活性的預(yù)測(cè)僅基于多肽中氨基酸殘基的數(shù)目和種類而并未涉及多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)，可能會(huì)導(dǎo)致其預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際檢測(cè)的結(jié)果有所出入。

為了得到表3中不同三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽，首先要確定Lys和Phe殘基在多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)形成中的作用。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了由15個(gè)Lys殘基組成的多肽CMAP-L和由15個(gè)Phe殘基組成的多肽CMAP-LL(見(jiàn)表3)。PEPstrMOD對(duì)這兩條多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CMAP-L的三級(jí)結(jié)構(gòu)中為100％無(wú)規(guī)卷曲而CMAP-LL的三級(jí)結(jié)構(gòu)中則在靠近N端有66.7％的α-螺旋結(jié)構(gòu)。由于Phe是疏水性氨基酸，其側(cè)鏈不帶電荷，因而不會(huì)產(chǎn)生排斥作用，所以多聚Phe可以形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。由此可知，多肽α-螺旋區(qū)多由疏水性氨基酸或者疏水性氨基酸和其他性質(zhì)的氨基酸共同構(gòu)成。而多聚Lys由于其側(cè)鏈正電荷的相互排斥而不能形成鏈內(nèi)氫鍵，因而也不能形成α-螺旋。結(jié)合表3中α-螺旋多肽序列的規(guī)律也可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有3個(gè)以上的Lys殘基在多肽中聚集就會(huì)阻斷多肽局部α-螺旋的形成。此外，在多肽α-螺旋形成的過(guò)程中，多肽N端或C端的末端氨基酸殘基不參與α-螺旋的形成，而緊靠多肽α-螺旋區(qū)一端或兩端的氨基酸殘基若為疏水性氨基酸則有利于α-螺旋的形成。

3.2.2第二階段設(shè)計(jì)的多肽對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制作用

采用MTT法檢測(cè)了第二階段設(shè)計(jì)改造的多肽對(duì)MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞的抑制率，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，第二階段設(shè)計(jì)改造的多肽中，CMAP-L-202、CMAP-L-242和CMAP-L-253對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率與PBS陰性組相比差異均達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)，而多肽CMAP-L-201、CMAP-L-232、CMAP-L-233、CMAP-L-241、CMAP-L-243和CMAP-L-252對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率與PBS組相比差異則均達(dá)到了顯著水平(Duncan-test，P<0.05)。多肽CMAP-L-202、CMAP-L-252和CMAP-L-253對(duì)ZR-75-1細(xì)胞的抑制率與PBS組相比差異均達(dá)到了顯著水平(Duncan-test，P<0.05)。多肽CMAP-L-242對(duì)以上4種乳腺癌細(xì)胞均具有較好的抑制作用，與PBS組相比差異均達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)。從表3中可知，CMAP-L-242的三級(jí)結(jié)構(gòu)為兩段α-螺旋，結(jié)合第一階段所篩選出的多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23和CMAP-L-25可以推斷，分別在靠近多肽N端和C端各有一段α-螺旋結(jié)構(gòu)的Motif可能是ACPs抗乳腺癌活性較好的Motif之一。

此外，多肽CMAP-L-253在100μM的濃度下，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用24h后，存活率為72.2％，與PBS組相比差異則達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)。在同等條件下，該多肽作用于MCF7和ZR-75-1細(xì)胞后，細(xì)胞存活率分別為85.6％和85.1％，與PBS組相比差異則達(dá)到了顯著水平(Duncan-test，P<0.05)。PEPstrMOD對(duì)CMAP-L-253三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)為100％無(wú)規(guī)卷曲，但其細(xì)胞滲透性的預(yù)測(cè)得分較高，為5.30(見(jiàn)表3)。多肽CMAP-L-243的預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)也為100％無(wú)規(guī)卷曲，其細(xì)胞滲透性的預(yù)測(cè)得分為5.34(見(jiàn)表3)，該多肽對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有明顯的抑制作用。由此可知，多肽的細(xì)胞滲透性對(duì)其抗乳腺癌活性的發(fā)揮至關(guān)重要，

即使在多肽沒(méi)有α-螺旋結(jié)構(gòu)的情況下也可使多肽具有一定的抗乳腺癌活性。PEPstrMOD對(duì)多肽CMAP-L-201、CMAP-L-202、CMAP-L-232、CMAP-L-233、CMAP-L-242、CMAP-L-243、CMAP-L-252和CMAP-L-253三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)見(jiàn)圖4。

比較AntiCP、CellPPD和ToxinPred對(duì)多肽活性預(yù)測(cè)的結(jié)果和多肽抗乳腺癌活性的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果可知，多肽中α-螺旋所占的百分比對(duì)其抗乳腺癌活性影響不大，而α-螺旋的數(shù)目和位置對(duì)多肽抗乳腺癌的活性影響較大。有兩段α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽抗乳腺癌活性總體上比有一段或者沒(méi)有的高，靠近N端的α-螺旋多肽抗乳腺癌活性比靠近C端的高。多肽的細(xì)胞滲透性對(duì)其抗乳腺癌活性有較大的影響，從表3中多肽細(xì)胞滲透性的預(yù)測(cè)得分可知，所篩選出來(lái)的具有抗乳腺癌活性的多肽細(xì)胞滲透性預(yù)測(cè)得分均大于5.0，但是并非細(xì)胞滲透性預(yù)測(cè)得分大于5.0的多肽都具有抗乳腺癌活性，例如CMAP-L的細(xì)胞滲透性預(yù)測(cè)得分為6.79，但是該多肽卻沒(méi)有任何抗乳腺癌活性(圖3中未顯示)。因此，多肽的抗乳腺癌活性是其細(xì)胞滲透性預(yù)測(cè)得分大于5.0之間的充分不必要條件。

綜合兩個(gè)階段多肽設(shè)計(jì)和檢測(cè)結(jié)果可知，ACPs的抗乳腺癌活性是由抗癌肽的凈電荷、疏水度和三級(jí)結(jié)構(gòu)等多種因素共同作用的結(jié)果。因此，在評(píng)價(jià)或設(shè)計(jì)改造ACPs的抗癌活性時(shí)應(yīng)充分考慮以上多種因素。

3.2.3不同乳腺癌細(xì)胞對(duì)ACPs的敏感性差異

MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性各不相同。以上4種乳腺癌細(xì)胞對(duì)所篩選的多肽和CDDP的敏感性差異如圖5所示。由圖5可知，多肽CMAP-L-24、CMAP-L-242和CMAP-L-25對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照組CDDP相比差異達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)；所有多肽對(duì)MCF7細(xì)胞的抑制作用CDDP相比差異均未達(dá)到顯著水平；多肽CMAP-L-242和CMAP-L-25對(duì)BT-474細(xì)胞的抑制作用與CDDP相比差異達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)；多肽CMAP-L-24、CMAP-L-242和CMAP-L-25對(duì)ZR-75-1細(xì)胞的抑制作用與CDDP相比差異達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)，而多肽CMAP-L-23與CDDP相比差異則達(dá)到了顯著水平(Duncan-test，P<0.05)。

此外，由圖5還可知，CDDP是廣譜性抗癌藥物，其對(duì)MCF7、BT-474和ZR-75-1三種乳腺癌細(xì)胞的抑制作用接近，在100μM的濃度下，對(duì)以上3種細(xì)胞作用24h后，細(xì)胞存活率分別為53.3％、52.0％和54.7％，但在同等條件下對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用則相對(duì)較差，作用后細(xì)胞存活率為64.1％。經(jīng)過(guò)兩個(gè)階段的設(shè)計(jì)改造所篩選出來(lái)的6條多肽對(duì)MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞的抑制作用差異較大。其中，多肽CMAP-L-242和CMAP-L-25對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用最好，其在100μM的濃度下，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用24h后，細(xì)胞存活率分別為24.8％和27.8％。

3.2.4所篩選多肽對(duì)正常細(xì)胞的毒性

為了評(píng)估所篩選多肽對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，分別檢測(cè)了多肽對(duì)人乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞MCF10A、人胚腎上皮細(xì)胞293FT及人血紅細(xì)胞的抑制作用。所篩選的6條多肽對(duì)MCF10A細(xì)胞和293FT細(xì)胞的抑制作用如圖6所示。由圖6可知，在100μM的濃度下，CDDP作用于MCF10A細(xì)胞和293FT細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率分別為28.9％和44.7％，而在同等條件下，所篩選的6條多肽作用于以上兩種細(xì)胞后，細(xì)胞存活率均高于CDDP。其中，多肽CMAP-L-24在100μM的濃度下作用293FT細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率為84.7％，表明該多肽對(duì)293FT細(xì)胞的毒性最弱。以上結(jié)果表明，所篩選的多肽對(duì)人正常細(xì)胞MCF10A和293FT的毒性低于CDDP，表現(xiàn)出了較好的選擇殺傷性。

所篩選的6條多肽的溶血活性結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，6條多肽和CDDP在12.5μM、25μM、50μM和100μM濃度下均對(duì)人血紅細(xì)胞沒(méi)有溶血活性，圖中檢測(cè)結(jié)果值波動(dòng)最大不超過(guò)10％，在系統(tǒng)誤差允許的范圍內(nèi)。所選多肽即使在最大濃度下(100μM)也沒(méi)有表現(xiàn)出溶血活性，其原因可能是紅細(xì)胞膜和乳腺癌細(xì)胞膜不同，沒(méi)有富含陰離子的磷脂酰絲氨酸、O-糖苷粘蛋白唾液酸、和肝素等分子，因而多肽不能通過(guò)靜電作用與紅細(xì)胞膜相互作用，也就不能對(duì)紅細(xì)胞膜產(chǎn)生裂解作用。

四、制備方法

菌株、載體與培養(yǎng)基

E.coli TOP10和E.coli BL21(DE3)以及表達(dá)載體p GEX-3X；p MDTM19-T克隆載體。

SOC培養(yǎng)基：0.5％Yeast extract，2％Tryptone，0.05％Na Cl，2.5mmol/L KCl，

10mmol/L MgCl₂，20mmol/L Glucose，pH 7.0

LB培養(yǎng)液：1％Tryptone，0.5％Yeast extract，1％NaCl，p H 7.0

LB固體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)液+1.5％瓊脂糖

TB培養(yǎng)液：1.2％Tryptone，2.4％Yeast extract，0.4％glycerol，0.2％KH₂PO₄，1.6％K₂HPO₄

方法：

1、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA采用寶生物(大連)工程有限公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取，具體操作參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

2、質(zhì)粒DNA的限制性酶切驗(yàn)證用酶切體系為：質(zhì)粒DNA 5μL，Bam HI 1μL，Eco RI 1μL，10×K buffer 2μL，加入雙蒸水至20μL；膠回收用酶切體系為：質(zhì)粒DNA 16μL，Bam HI 1μL，Eco RI 1μL，10×K buffer 5μL，用雙蒸水補(bǔ)足至50μL。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物或回收目的片段。

3、DNA瓊脂糖凝膠電泳

DNA瓊脂糖凝膠電泳步驟如下：①配膠。用1×TAE緩沖液配制1％瓊脂糖溶液，加熱溶解；②膠板制備。待膠液冷卻至約60℃時(shí)，加入染色劑Gel Green(1μL/20μL膠溶液)，混勻后倒入制膠槽，待凝膠凝固后拔出制膠梳子，將凝膠放入裝有1×TAE緩沖液電泳槽內(nèi)；③加樣。在待檢測(cè)的DNA樣品中加入10×Loading Buffer，用移液槍吸打混勻并點(diǎn)樣(待測(cè)樣品和DNA Marker)至加樣孔；④電泳。啟動(dòng)電泳儀，調(diào)節(jié)電壓至110V，保持穩(wěn)壓,電泳約40min；⑤觀察照相。關(guān)閉電泳儀，取出凝膠，用凝膠成像儀拍照并觀察電泳結(jié)果。

4、膠回收

DNA從瓊脂糖凝膠中回收DNA，操作方法參見(jiàn)寶生物(大連)工程有限公司膠回收試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

5、目的基因與載體的連接

SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸片段和質(zhì)粒的連接采用連接試劑盒。T載體連接前無(wú)需處理，而對(duì)于連接具有粘性末端的質(zhì)粒和插入片段，將載體和插入片段按1∶1到1∶10的摩爾比混合，一般取前者0.03pmol，取后者0.3pmol，加入等體積的solution I連接溶液，混勻，16℃下連接1h或過(guò)夜。

6、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法參見(jiàn)寶生物(大連)工程有限公司感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)化步驟如下：①?gòu)?70℃超低溫冰箱中取出分裝有100μL感受態(tài)細(xì)胞的EP管，于冰上放置，融化感受態(tài)細(xì)胞；②將待轉(zhuǎn)化的10μL DNA加入1.5m L eppendorf(EP)離心管中，用粗口吸頭輕柔混合，于冰上放置45min；③于42℃水浴中，熱激90s，不要搖動(dòng)離心管；④快速將EP管轉(zhuǎn)移至冰上，靜置2～3min；⑤各管加入890μL LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因；⑥將適當(dāng)體積已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上；⑦將平板置于37℃至液體被吸干；⑧倒置平板，37℃培養(yǎng)12～16h，待菌落長(zhǎng)好后，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，或接種于含抗生素的LB(或SOC)液體培養(yǎng)液中，過(guò)夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證。

6、T載體的構(gòu)建

參照p MDTM19-T simple vector試劑盒說(shuō)明，將目的基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后，取約0.1～0.3pmol的基因片段加入微量離心管中，并加入1μL的T載體，加水補(bǔ)足至5μL，后加入5μL的Solution I啟動(dòng)反應(yīng)，16℃連接反應(yīng)1h；將10μL的連接液加入100μL感受態(tài)細(xì)胞Top 10(冰上凍融)，進(jìn)心轉(zhuǎn)化；取100μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布LB平板(含有X-Gal、IPTG、Amp)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，培養(yǎng)14h后，挑選白色菌落，PCR確認(rèn)重組T載體中插入片段的長(zhǎng)度大小。PCR上下游引物分別為Bca BEST Primer RV-M和Bca BEST Primer M13-47

7、重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將以上構(gòu)建的重組T載體p MDTM19-T-Acp-1和p MDTM19-T-Acp-2分別與表達(dá)載體p GEX-3X分別進(jìn)行Bam HI與Eco RI雙酶切，膠回收目的片段及酶切后的表達(dá)載體，采用Solution I連接液，于16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)，于Amp(100μg/m L)平板上篩選重組子。提取質(zhì)粒后，經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。

8、重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

分別挑含重組質(zhì)粒與空載體質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)單菌落于20m L含100μg/m L的Amp的LB培養(yǎng)基液中，37℃，200rpm搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)液2％轉(zhuǎn)接入100m L TB培養(yǎng)液中，37℃，200rpm，搖瓶培養(yǎng)至菌體OD600值達(dá)到0.6～0.8，添加IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3h。各取誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后1m L菌液，4℃，10000g，離心10min，收集菌體細(xì)胞，添加100μL 1×還原型電泳上樣緩沖液重懸細(xì)胞，沸水煮5min，上樣，12％SDS-PAGE分析全細(xì)胞中重組蛋白(GST-AHPM-1)的表達(dá)情況。

9、包涵體的洗滌與溶解

誘導(dǎo)培養(yǎng)條件：30℃，200rpm，誘導(dǎo)前OD600值0.6～0.8左右，IPTG終濃度0.4mmol/L，誘導(dǎo)5h。取搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌懸液，離心(4℃，10000g，10min)收集菌體，按每克濕菌體10m L細(xì)胞裂解緩沖液重懸菌體，超聲破菌后，小份分裝，4℃，16000g，離心20min，去掉上清，收集包涵體沉淀。包涵體洗滌與溶解的基本緩沖液為：0.5％Triton X-100，1mmol/L EDTA，150mmol/L Na Cl，50mmol/L Tris-HCI，p H 8.0。通過(guò)在以上基本緩沖液中加入不同終濃度的尿素，或終濃度0.1mol/L二硫蘇糖醇(DTT)，或終濃度5％的甘油，或它們的組合溶液重懸包涵體，于室溫磁力攪拌4h后離心(4℃，16000g，20min)，分離上清和沉淀，利用12％SDS-PAGE分析來(lái)考察最適宜的包涵體洗滌液和溶解液組成。

10、包涵體的純化

將菌體細(xì)胞超聲破碎后，去掉上清，利用洗滌液(0.5％Triton X-100，1mmol/L EDTA，150mmol/L Na Cl，50mmol/L Tris-HCI，p H 8.0，4mol/L尿素)洗滌包涵體沉淀，然后4℃，16000g，離心20min，收集沉淀，重復(fù)洗滌兩次后即為洗凈的包涵體。然后用溶解液(1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCI，p H 8.0，8mol/L尿素，5％甘油)重懸洗滌后的包涵體，加入終濃度0.1mol/L DTT，于磁力攪拌器上室溫?cái)?轉(zhuǎn)速100rpm)溶解4h后，離心(4℃，16000g，20min)，上清液即為隨后用于純化及復(fù)性的包涵體溶液。

11、離子交換色譜純化

AKATA蛋白純化系統(tǒng)：GE Health公司；陽(yáng)離子交換色譜柱：Hi TrapTM CM FF(1m L)和Hi TrapTM SP FF(1m L)，GE Health公司；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；上樣流速：0.3m L/min；洗脫流速：1m L/min；進(jìn)樣體積：0.5m L；蛋白濃度：2mg/m L；Binding buffer：1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCI，p H 8.0，8mol/L尿素，5％甘油；Elution buffer：1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCI，p H 8.0，8mol/L尿素，5％甘油，1mol/L Na Cl。Binding buffer與Elution buffer均過(guò)0.22μm微濾膜除雜待用。

純化流程：先用超純水清洗色譜柱10個(gè)柱體積，再用Binding buffer平衡10個(gè)柱體積，待基線校零后，上樣，Binding buffer洗至無(wú)紫外吸收信號(hào)，換Elution buffer梯度洗脫。見(jiàn)峰收集，多次重復(fù)上樣，合并同類峰，利用超濾離心管(膜截留分子量為3k Da)，4℃，4500g，超濾離心濃縮至一定濃度。

12、梯度透析完全復(fù)性

將SEC純化及部分復(fù)性后收集的目標(biāo)蛋白峰溶液裝入透析袋(截留分子量10k Da)，放入復(fù)性緩沖液中，于4℃磁力攪拌(轉(zhuǎn)速150rpm)，進(jìn)一步進(jìn)行梯度透析完全復(fù)。透析復(fù)性液為：25mmol/L Tris-HCl，p H 7.3，0.15mol/L Na Cl，1mmol/L EDTA，1.5mmol/L GSH，0.3mmol/L GSSG，5％甘油，0～3mol/L尿素。每隔12h換一緩沖液，依次為含3mol/L、2mol/L、1mol/L與0mol/L尿素的復(fù)性液，最后對(duì)含0.9％Na Cl的生理鹽水(p H 7.5)進(jìn)行透析。

五、討論

本試驗(yàn)中，根據(jù)影響凈電荷、疏水度和三級(jí)結(jié)構(gòu)等影響多肽抗腫瘤活性因素的差異對(duì)天然抗菌肽CMAP-8進(jìn)行了兩個(gè)階段的設(shè)計(jì)改造。通過(guò)對(duì)CMAP-8第一階段的設(shè)計(jì)改造和體外抗乳腺癌(MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1)活性檢測(cè)后，共得到4條對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有顯著抑制作用的多肽，分別為：CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24和CMAP-L-25。這4條多肽都是陽(yáng)離子多肽，其凈電荷數(shù)均比較大，為+6～+8，而疏水殘基在所占的比例均為46％(見(jiàn)表2)。結(jié)合表4中其他多肽的凈電荷數(shù)和疏水殘基在多肽中所占的比例可知，多肽的凈電荷數(shù)和疏水殘基的比例共同影響多肽的抗乳腺癌活性，但是這些參數(shù)并非越大越好(因?yàn)楸?中疏水殘基最多的多肽為CMAP-L-11，而該多肽并未表現(xiàn)出明顯的抗乳腺癌活性，表3中凈電荷數(shù)最多的多肽為CMAP-L，該多肽也未表現(xiàn)出明顯的抗乳腺癌活性)。CellPPD對(duì)所得多肽細(xì)胞滲透性的預(yù)測(cè)得分在5.04～5.32之間，大于其他大部分沒(méi)有抗乳腺癌活性的多肽(見(jiàn)表2)。這一結(jié)果表明，多肽的細(xì)胞滲透性對(duì)其抗腫瘤活性有一定的影響，Yenchu Lin等在他們的工作中也發(fā)現(xiàn)了這一影響因素的作用。

CMAP-L-20、CMAP-L-23和CMAP-L-25的預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)均為兩段α-螺旋分別位于靠近多肽N端和C端的位置(見(jiàn)圖1)，而多肽CMAP-L-24僅在靠近N端的位置有一小段α-螺旋，該α-螺旋在多肽中所占的比例在所設(shè)計(jì)的13條多肽中為最小(20％)(見(jiàn)圖1和表2)。在第二階段的設(shè)計(jì)改造過(guò)程中，為了討論多肽中α-螺旋的位置及數(shù)目對(duì)多肽抗乳腺癌活性的影響，不改變所得4條多肽中氨基酸的種類和數(shù)目，僅通過(guò)一級(jí)序列的變化得到具有不同三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽衍生物(見(jiàn)表3)。該系列多肽衍生物的體外抗乳腺癌檢測(cè)結(jié)果表明，多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)其抗乳腺癌活性有很大的影響。多肽CMAP-L-202、CMAP-L-242和CMAP-L-253對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率與PBS陰性組相比差異均達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)，而多肽CMAP-L-201、CMAP-L-232、CMAP-L-233、CMAP-L-241、CMAP-L-243和CMAP-L-252對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率與PBS組相比差異則均達(dá)到了顯著水平(Duncan-test，P<0.05)。多肽CMAP-L-242對(duì)MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞均具有較好的抑制作用，與PBS組相比差異均達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)(見(jiàn)圖3)。多肽CMAP-L-202、CMAP-L-232和CMAP-L-252的預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)中均在靠近N端有一段α-螺旋結(jié)構(gòu)，而多肽CMAP-L-242的預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)為兩段α-螺旋(見(jiàn)圖4)。由此可知，有兩段α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽抗乳腺癌活性總體上比有一段或者沒(méi)有的高，靠近N端的α-螺旋多肽抗乳腺癌活性比靠近C端的高。此外，多肽CMAP-L-233、CMAP-L-243和CMAP-L-253的預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)為100％無(wú)規(guī)卷曲見(jiàn)表3和圖4)，該類結(jié)構(gòu)具有抗乳腺癌活性還是第一次發(fā)現(xiàn)。CellPPD對(duì)該3條多肽細(xì)胞滲透性的預(yù)測(cè)得分分別為5.15、5.34和5.30，表明這3條多肽的細(xì)胞滲透性較好。但是，目前還不清楚100％無(wú)規(guī)卷曲的多肽在發(fā)揮抗乳腺癌作用時(shí)是如何與細(xì)胞膜接觸的進(jìn)而通過(guò)哪些機(jī)制對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷的。

關(guān)于詳細(xì)討論ACPs中α-螺旋的位置及數(shù)目對(duì)多肽抗腫瘤活性的影響至今尚未見(jiàn)報(bào)道，而本試驗(yàn)的結(jié)果表明多肽中α-螺旋結(jié)構(gòu)位置和數(shù)目的改變對(duì)其抗乳腺癌活性有著明顯的影響。因此，在ACPs的設(shè)計(jì)和研究過(guò)程中應(yīng)關(guān)注α-螺旋結(jié)構(gòu)位置和數(shù)目對(duì)其抗癌活性的作用。此外，在第二階段的設(shè)計(jì)改造過(guò)程中，為了得到不同三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽衍生物，我們觀察了氨基酸殘基的疏水性和電荷在多肽α-螺旋形成中的作用。結(jié)果表明，疏水性氨基酸殘基(如Phe等)參與了α-螺旋的形成，而帶電荷的氨基酸殘基(如Lys等)則不利于其形成。當(dāng)有3個(gè)以上的Lys殘基在多肽中聚集就會(huì)阻斷多肽局部α-螺旋的形成。此外，在多肽α-螺旋形成的過(guò)程中，多肽N端或C端的末端氨基酸殘基不參與α-螺旋的形成，而緊靠多肽α-螺旋區(qū)一端或兩端的氨基酸殘基若為疏水性氨基酸則有利于α-螺旋的形成。多肽CMAP-L-20、CMAP-L-23、CMAP-L-24、CMAP-L-242、CMAP-L-25和CMAP-L-253的螺旋-輪結(jié)構(gòu)圖如圖8所示。由圖8可知，多肽一級(jí)序列中相鄰的

氨基酸殘基在形成α-螺旋時(shí)由于多肽主鏈構(gòu)象的改變而相互疏遠(yuǎn)，最終導(dǎo)致親水殘基在一側(cè)而疏水殘基在另一側(cè)，形成疏水面(黃色圓圈部分)和親水面(藍(lán)色圓圈部分)，而多肽CMAP-L-253由于不能形成α-螺旋構(gòu)象，因而也不能形成明顯的疏水面和親水面(圖8F)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，在氨基酸殘基種類和數(shù)目不變的情況下，即使是個(gè)別氨基酸殘基位置的改變都會(huì)導(dǎo)致整個(gè)多肽三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。因此，不論是通過(guò)何種途徑對(duì)ACPs進(jìn)行設(shè)計(jì)改造，都應(yīng)該考慮多肽氨基酸序列的改變對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

4.2不同乳腺癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性差異

本試驗(yàn)中，選用了MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞來(lái)檢測(cè)所設(shè)計(jì)的多肽衍生物的抗腫瘤活性。結(jié)果表明，以上4種乳腺癌細(xì)胞對(duì)同一藥物的敏感性差異較大。例如，多肽CMAP-L-242在100μM的濃度下分別作用MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率分別為24.8％、58.4％、41.5％和44.5％，而在同等條件下，CDDP作用于以上4種乳腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞存活率則分別為64.1％、53.3％、52.0％和54.7％(見(jiàn)圖5)。其原因可能是不同的乳腺癌細(xì)胞由于細(xì)胞表面分子表達(dá)的差異性，導(dǎo)致其對(duì)同種藥物的敏感型有所差異，而CDDP屬于廣譜性抗腫瘤藥，通過(guò)與DNA結(jié)合后形成交聯(lián)導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而干擾DNA的復(fù)制活化損傷相關(guān)的應(yīng)答引起細(xì)胞凋亡(Hee-Jin Ahn等，2015)。

根據(jù)乳腺癌細(xì)胞表面ER、PR、HER2和Ki-67分子的表達(dá)差異，可將乳腺癌細(xì)胞分為L(zhǎng)uminal A、Luminal B、HER2/neu和Basal-like四個(gè)亞型(K.B.Reddy，2011；A.Goldhirsch等，2013；Kristina Subik等，2010)。本試驗(yàn)中所用的4種乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1的亞型歸類見(jiàn)表4。其中，Basal-like亞型的乳腺癌細(xì)胞ER、PR和HER2三中分子均不表達(dá)，故該亞型的乳腺癌細(xì)胞又被稱為三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer，TNBC)。人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231是TNBC中的典型代表。TNBC是惡性較強(qiáng)的乳腺癌亞型，常見(jiàn)于年輕的女性患者，與內(nèi)臟器官轉(zhuǎn)移相關(guān)且預(yù)后較差，但其免疫原性較其他亞型更強(qiáng)一些(Kristina Subik等，2010；Ashley Cimino-Mathews等，2015)。在TNBC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有Cripto-1、Notch/CSL、Wnt/b-catenin和JAK2等多種信號(hào)通路的參與(Michael T等，2015；Maria Cristina Rangel等，2016)。其中，Cripto-1可被脂筏中的糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)的磷脂部分錨定到細(xì)胞膜上，也可以通過(guò)Smad依賴的非經(jīng)典途徑作為GPI錨定的硫酸肝素糖蛋白Glypican-1的配體，后者可活化酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase，c-Src)/絲裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷酸肌醇激酶(Phosphatidylinositol 3kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的繁殖、運(yùn)動(dòng)和生存(Maria Cristina Rangel等，2016)。

表4 4種乳腺癌細(xì)胞的亞型分類(Kristina Subik等，2010)

本試驗(yàn)中，通過(guò)兩個(gè)階段的設(shè)計(jì)檢測(cè)共得到13條對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞有顯著抑制作用的多肽，分別是多肽CMAP-L-20、CMAP-L-201、CMAP-L-202、CMAP-L-23、CMAP-L-232、CMAP-L-233、CMAP-L-24、CMAP-L-241、CMAP-L-242、CMAP-L-243、CMAP-L-25、CMAP-L-252和CMAP-L-253，其中多肽CMAP-L-24、CMAP-L-242和CMAP-L-25對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用與CDDP相比差異達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)，而多肽CMAP-L-253對(duì)其抑制作用與PBS組相比差異達(dá)到了極顯著水平(Duncan-test，P<0.01)。這些多肽可以作為一個(gè)資源庫(kù)，用于ACPs對(duì)MDA-MB-231作用機(jī)制的研究。同時(shí)，這些結(jié)果表明，在對(duì)ACPs的設(shè)計(jì)改造過(guò)程中優(yōu)化多肽中的多個(gè)影響因素可以顯著改善多肽的抗癌活性。

此外，通過(guò)觀察不同多肽作用于MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞后細(xì)胞的形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，同一多肽作用于不同的乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞裂解死亡后的形態(tài)大致相同但略有差異，而不同的多肽作用于同一乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞裂解死亡后形態(tài)卻不盡相同。多肽CMAP-L-20、CMAP-L-242和CMAP-L-25作用于MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞后細(xì)胞的形態(tài)變化如圖9所示。由圖9可知，多肽CMAP-L-20作用于MDA-MB-231、MCF7、BT-474和ZR-75-1四種乳腺癌細(xì)胞后均會(huì)導(dǎo)致大量的細(xì)胞碎片產(chǎn)生，多肽CMAP-L-20、CMAP-L-242和CMAP-L-25作用于MCF7細(xì)胞后也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞碎片的產(chǎn)生，其原因可能是以上多肽是過(guò)類似的殺傷機(jī)制作用于相應(yīng)的乳腺癌細(xì)胞的；而多肽CMAP-L-20、CMAP-L-242和CMAP-L-25作用于MDA-MB-231細(xì)胞后的細(xì)胞碎片產(chǎn)生情況卻有所不同，多肽CMAP-L-20可導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生大量碎片，但是CMAP-L-242和CMAP-L-25作用之后產(chǎn)生的細(xì)胞碎片卻少得多，這可能是因?yàn)椴煌亩嚯挠捎诶砘再|(zhì)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致其作用機(jī)制也有所區(qū)別。

因此，在開(kāi)發(fā)抗乳腺癌藥物的研究中應(yīng)充分考慮不同亞型的乳腺癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性差異，選擇多種亞型的乳腺癌細(xì)胞作為受試細(xì)胞株。同時(shí)，臨床上治療乳腺癌的過(guò)程中也應(yīng)該區(qū)分患者乳腺癌的亞型，針對(duì)不同的亞型選擇不同的治療手段既可改善治療效果也會(huì)減少藥物的副作用。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上各實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 貴州源熙生物研發(fā)有限公司

<120> 抗癌肽及其制備方法與應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Lys Phe Phe Lys Lys Met Lys Lys Phe Val Lys Lys Phe Leu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Lys Lys Lys Lys Phe Phe Met Phe Val Phe Phe Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagaagttct tcaagaagat gaagaagttc gtgaagaagt tcctg 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagaagaaga agttcttcat gttcgtgttc ttcaagaaga agaag 45