本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記、分子標(biāo)記的引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

分子標(biāo)記(Molecular Markers)，是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記--形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有標(biāo)記的數(shù)量不限，能分析不同生物發(fā)育階段的物種，且不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，因此，DNA分子標(biāo)記較其他方法具有優(yōu)越性。

DNA分子標(biāo)記常用的標(biāo)記方法包括RFLP分子標(biāo)記、RAPD分子標(biāo)記和SSR(Simple Sequence Repeats)分子標(biāo)記。SSR分子標(biāo)記是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一類由幾個(gè)核苷酸(一般為1～6個(gè))為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。由于每個(gè)SSR兩側(cè)的序列一般是相對(duì)保守的單拷貝序列。由于微衛(wèi)星可在多個(gè)等位基因間顯示差異，因而在作物的遺傳圖譜構(gòu)建，遺傳多樣性發(fā)析，親緣關(guān)系鑒定，DNA指紋圖譜構(gòu)建，品種鑒定，QTL分析及分子輔助育種中均具有公認(rèn)的優(yōu)越性及應(yīng)用前景。從品種間具廣泛位點(diǎn)變異的角度考慮，SSR分子標(biāo)記比RFLP及RAPD分子標(biāo)記更具多態(tài)性，尤其對(duì)花生、六倍體小麥等用常見(jiàn)分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)不出很多DNA片段多態(tài)性的作物品種來(lái)說(shuō)，具有更大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

蘿卜是我國(guó)重要的蔬菜作物，但分子生物學(xué)等基礎(chǔ)研究相對(duì)比較落后，遠(yuǎn)不能滿足育種或其他領(lǐng)域研究的需求，同時(shí)，蘿卜種質(zhì)資源豐富，但是栽培品種表型相似性高，遺傳背景狹窄，例如，崔娜等人報(bào)道了75份蘿卜材料的平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)以及基因多樣性指數(shù)的數(shù)值都不高，具體地來(lái)自韓國(guó)白蘿卜品種晨曉和雪鳳凰等15對(duì)蘿卜品種之間的相似系數(shù)為1.00，表明它們可能具有相同的遺傳背景。鑒于此，蘿卜不同品種之間區(qū)分較為困難，目前尚沒(méi)有一種有效的SSR分子標(biāo)記能夠區(qū)分耐熱蘿卜品種的純度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記、分 子標(biāo)記的引物及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的分子標(biāo)記具有共顯性，能夠有效區(qū)分出耐熱蘿卜品種，并能進(jìn)一步對(duì)耐熱型蘿卜品種的純度進(jìn)行鑒定。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記，包括SSR17和SSR75一種或兩種；

所述SSR17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述SSR75的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明還提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記的引物，包括SSR17的正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物，以及SSR75的正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物中的一組或兩組；

所述SSR17的正向擴(kuò)增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示；SSR17的反向擴(kuò)增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；

所述SSR75的正向擴(kuò)增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示；SSR75的反向擴(kuò)增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。

本發(fā)明提供了所述的耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記在品種純度鑒定中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述耐熱蘿卜包括夏抗40天。

優(yōu)選的，所述品種純度鑒定包括以下步驟：

1)提取待測(cè)樣品DNA；

2)用權(quán)利要求2所述引物對(duì)所述步驟1)得到的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到電泳圖；

4)比較所述步驟3)得到的電泳圖和預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)電泳帶型，所述標(biāo)準(zhǔn)電泳帶型為純合體父本、純合體母本和雜合體子一代在電泳圖中的帶型，若待測(cè)樣品的帶型與所述雜合體子一代的帶型一致則判斷為子一代雜合體，若待測(cè)樣品的帶型與純合體父本或純合體母本的帶型一致或與上述三者帶型均不一致則判斷為非子一代雜合體。

本發(fā)明提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記，包括SSR17和SSR75一種或兩種；所述SSR17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述SSR75的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。本發(fā)明得到針對(duì)耐熱蘿卜品種的2個(gè)EST-SSR分子標(biāo)記，并且所述SSR17和SSR75具有共顯性表達(dá)特性，利用具有共顯性關(guān)系的2個(gè)EST-SSR分子標(biāo)記對(duì)商品種耐熱蘿卜品種--夏抗40天的群體純度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其純度高達(dá)92％，同田間表型一致，因此，所述2個(gè)EST-SSR分子標(biāo)記能夠用于耐熱蘿卜品種的純度檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中SSR17和SSR75分子標(biāo)記的PCR電泳圖；

圖2為實(shí)施例2中SSR17分子標(biāo)記對(duì)夏抗40天及其父母親本擴(kuò)增的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖3為實(shí)施例3中SSR75分子標(biāo)記對(duì)夏抗40天及其父母親本擴(kuò)增的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖4為實(shí)施例4中SSR17分子標(biāo)記對(duì)子一代群體品種純度鑒定的電泳圖；

圖5為實(shí)施例5中SSR75分子標(biāo)記對(duì)子一代群體品種純度鑒定的電泳圖；

圖6為實(shí)施例6中夏抗40品種田間種植情況。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記，包括SSR17和SSR75一種或兩種；

所述SSR17的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

所述SSR75的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明還提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記的引物，包括包括SSR17的正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物，以及SSR75的正向擴(kuò)增引物和反向擴(kuò)增引物中的一組或兩組；

所述SSR17的正向擴(kuò)增引物的核苷酸序列優(yōu)選如序列表中SEQ ID No.3所示；所述SSR17的反向擴(kuò)增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；

所述SSR75的正向擴(kuò)增引物的核苷酸序列優(yōu)選如序列表中SEQ ID No.5所示；所述SSR75的反向擴(kuò)增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。

本發(fā)明中，所述耐熱蘿卜優(yōu)選包括夏抗40天。

本發(fā)明中，所述SSR17和SSR75的正反向引物的設(shè)計(jì)方法是以NCBI網(wǎng)站中公開(kāi)的蘿卜品種EST序列為模板，采用Primer3.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)EST-SSR引物。

本發(fā)明中，所述SSR17或SSR75的正反向引物應(yīng)用到PCR擴(kuò)增中。所述PCR擴(kuò)增中優(yōu)選將SSR17正反向擴(kuò)增引物和SSR75的擴(kuò)增引物分別在不同PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增。

所述的的PCR擴(kuò)增中反應(yīng)體系優(yōu)選如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增中反應(yīng)體系

本發(fā)明中，所述PCR擴(kuò)增過(guò)程中反應(yīng)程序優(yōu)選如下：

第一步:PCR儀上蓋預(yù)熱104℃；

第二步:94℃預(yù)變性3min；

第四步:72℃延伸4min。

所述PCR擴(kuò)增體系的原料的來(lái)源沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的PCR擴(kuò)增體系的原料即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述PCR擴(kuò)增體系的原料購(gòu)自東盛生物(http://www.dongshengbio.com/)。

本發(fā)明提供了所述的耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記在品種純度鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明中，所述品種純度鑒定的具體方法優(yōu)選包括以下步驟：

1)提取待測(cè)樣品的DNA；

2)用上述技術(shù)方案所述引物對(duì)所述步驟1)得到的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得到電泳圖；

4)比較所述步驟3)得到的電泳圖和預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)電泳帶型，所述標(biāo)準(zhǔn)電泳帶型為純合體父本、純合體母本和雜合體子一代在電泳圖中的帶型，若待測(cè)樣品的帶型與所述雜合體子一代的帶型一致則判斷為雜合體，若待測(cè)樣品 的帶型與純合體父本或純合體母本的帶型一致則判斷為純合體。

本發(fā)明中，所述DNA的提取方法沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的DNA提取方法即可，例如試劑盒法或CTAB法。

本發(fā)明中，所述PCR擴(kuò)增的方法沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的PCR擴(kuò)增的方法即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所用的PCR儀為MJ PTC-200 DNA Engine Thermal Cycler。

本發(fā)明中，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法沒(méi)有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法即可。

本發(fā)明中，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳過(guò)程的電壓優(yōu)選為1200～1500V，更優(yōu)選為1400V。所述聚丙烯酰胺凝膠電泳過(guò)程的電流60mA～80mA，更優(yōu)選為70mA。

得到待測(cè)樣品的電泳圖后，本發(fā)明根據(jù)所述待測(cè)樣品的電泳圖和預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)電泳帶型，得到待測(cè)樣品的品型。具體的，所述標(biāo)準(zhǔn)電泳帶型為純合體父本、純合體母本和雜合體子一代在電泳圖中的帶型，提取純合體父本、純合體母本和雜合體子一代的DNA，按照上述技術(shù)方案所述PCR擴(kuò)增方案和聚丙烯酰胺凝膠電泳方案，得到純合體父本、純合體母本和雜合體子一代的電泳圖。

本發(fā)明中，所述雜合體子一代為夏抗40天。所述夏抗40天蘿卜品種的來(lái)源從商業(yè)途徑購(gòu)買。本發(fā)明實(shí)施例中，所述夏抗40天蘿卜品種的來(lái)源購(gòu)自武漢七葉紅都市園藝有限公司。本發(fā)明中，所述夏抗40天的品種是由武漢市蔬菜科學(xué)研究所選育的耐熱白皮蘿卜品種，該蘿卜已經(jīng)2000年完成成果驗(yàn)收。所述夏抗40天蘿卜品種的父本和母本的試驗(yàn)材料葉片從武漢市蔬菜科學(xué)研究所獲得。

本發(fā)明中，所述SSR17或SSR75分子標(biāo)記的引物擴(kuò)增得到的電泳圖可單獨(dú)用來(lái)鑒定品種純度，也可以將SSR17和SSR75分子標(biāo)記擴(kuò)增得到的兩個(gè)電泳圖結(jié)合起來(lái)鑒定品種純度。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

根據(jù)NCBI中公開(kāi)的蘿卜EST序列，采用Primer3.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)SSR引物，通過(guò)南京金斯瑞公司合成SEQ ID No.3～SEQ ID No.62對(duì)SSR引物。

提取耐熱蘿卜-夏抗40天及其父母親本的DNA，具體包括以下步驟：

1、將蘿卜幼嫩葉片放入2ml平底EP管中，放入液氮中。

2、迅速研磨直至成粉末狀。

3、取出EP管迅速加入0.6ml預(yù)熱到65℃的CTAB溶液(2％CTAB 20gm CTAB、20mM EDTA、100mM Tris-Cl pH 8.0、1.4M NaCl溶于一升水中

調(diào)整pH 7.5-8.0，滅菌后加0.2％巰基乙醇)，快速混勻后放置在65℃干浴器中20min,每5min緩慢顛倒一次。

4、用剪口的槍頭吸出上清液到新的EP管中，加入300ul氯仿、異戊醇(體積比24:1)，混勻5min。

5、1500g離心10min。

6、取出上清，重復(fù)第4-5步。

7、取出上清，加入400ul異丙醇?；靹蚝箅x心12000rpm，10min。

8、用76％乙醇溶液潤(rùn)洗一次。

9、晾干后加入20ul雙蒸水，溶解DNA。

按照表2配置PCR反應(yīng)體系。

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序如下：

第一步:PCR儀上蓋預(yù)熱104℃；

第二步:94℃預(yù)變性3min；

第四步:72℃延伸4min。

擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE膠檢測(cè)

將SSR17和SSR75位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后的凝膠進(jìn)行EB染色，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照。

SSR17、SSR75和SSR80位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增情況如圖1所示。從圖1中可以看出，SSR17、SSR75和SSR80擴(kuò)增位點(diǎn)能夠得到清晰的條帶，說(shuō)明上述3對(duì)引物具有較好的特異性。

實(shí)施例2

按照實(shí)施例1的方法對(duì)夏抗40天父母親本的DNA進(jìn)行SSR17位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。

將擴(kuò)增得到夏抗40天的SSR17擴(kuò)增產(chǎn)物和夏抗40天父母親本的DNA進(jìn)行SSR17位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PAGE凝膠電泳。

PAGE膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)是將瓊脂糖凝膠電泳初步篩選出的引物對(duì)紅蘿卜基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的(夏抗40天父本,夏抗40天母本，夏抗40天)擴(kuò)增產(chǎn)物中，均添加5ul上樣緩沖液,用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠。電泳儀的設(shè)置參數(shù)一般是電壓1200～1500V，電流60mA～80mA的功率下電泳1.5小時(shí)。電泳槽內(nèi)緩沖液一般為0.5×TBE或者1×TBE。電泳結(jié)束后,取下膠板進(jìn)行銀染顯色。具體操作流程如下:

(1)玻璃板清洗:用清潔劑將玻璃板兩面反復(fù)清洗擦拭干凈,用清水和純水清洗(up水)清洗后，長(zhǎng)板和短板處理如下,

長(zhǎng)板:先用無(wú)水酒精2ml擦凈晾干，放室溫,反硅化處理，無(wú)水酒精2ml+反硅化劑(親和硅烷)10ul+冰乙酸10ul,濾紙涂勻晾干

短板:先用無(wú)水酒精2ml擦凈晾干，放室溫，硅化處理，剝離硅烷2ml。濾紙涂勻晾干。

(2)制膠和灌膠:1.0mm板取60mlPAGE(1.5mm板取80ml)儲(chǔ)存液，加420ul 10％AP和42ul TEMD溶液,搖勻后導(dǎo)入板子間隙(注意不要有氣泡進(jìn)入)，將梳子倒置，使無(wú)孔的一方插入膠板中。然后，將膠板水平放置15min左右，待你凝固(在室溫20℃左右時(shí))。

(3)電泳:將凝固好的玻璃板放置在電泳槽后，在上下槽中分別添加適量0.5×TBE緩沖液，預(yù)電泳10min后，暫停電泳。然后在梳齒空內(nèi)加入DNA擴(kuò)增樣4.5ul。

(4)銀染:電泳結(jié)束后，在裝有染色液的盆中加入3ml甲醛混勻，然后將膠板短板移除，將帶有膠的長(zhǎng)坂放入到染色液中，搖床60-70搖5min(新配銀染液染色5min，用過(guò)5到6次后，染色10min)。銀染液制備:3g AgNO₃+2L ddH₂O(可用8～10次)

(5)漂洗:將長(zhǎng)膠板從銀染液中取出,然后用純水清洗2～3次，轉(zhuǎn)入到顯色液中。

(6)顯色:加入2LNaOH溶液中，顯色約5min左右，加3ml甲醛(搖床60～80min左右)。色液制備:30g NaOH，2L ddH₂O，用之前加熱(約50℃)效果較好。(可1L ddH₂O加熱至100度左右，另加1L ddH₂O，配NaOH，二者混合)。停止顯色后用純水清洗干凈。

(7)照相:顯色結(jié)束后，將膠放在白色背景下，照相保存，并讀取記錄顯色條帶。

SSR17擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE凝膠電泳圖見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出，夏抗40天父本和夏抗40天母本的條帶大小不相同，說(shuō)明存在等位基因，夏抗40天擴(kuò)增的條帶有兩條，并且得到的兩條條帶分別與父本和母本的條帶相同，說(shuō)明夏抗40天蘿卜品種的SSR17位點(diǎn)具有共顯性。

實(shí)施例3

按照實(shí)施例1的方法對(duì)夏抗40天父母親本的DNA進(jìn)行SSR75位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增。

將實(shí)施例1中擴(kuò)增得到夏抗40天的SSR75擴(kuò)增產(chǎn)物和夏抗40天父母親本的DNA SSR75擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PAGE凝膠電泳。所述PAGE凝膠電泳步驟同實(shí)施例2，在此不做贅述。

SSR75擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE凝膠電泳圖見(jiàn)圖3。從圖3中可以看出，夏抗40天父本和夏抗40天母本的條帶大小不相同，說(shuō)明存在等位基因，夏抗40天擴(kuò)增的條帶有兩條，并且得到的兩條條帶分別與父本和母本的條帶相同，說(shuō)明夏抗40天蘿卜品種的SSR75位點(diǎn)具有共顯性。

實(shí)施例4

對(duì)商品夏抗40天蘿卜品種進(jìn)行純度鑒定，鑒定方法如下：

按照實(shí)施例1的方法對(duì)夏抗40天子一代進(jìn)行DNA提取。將商品夏抗40天蘿卜品種和父本、母本和夏抗40天采用實(shí)施例1的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增SSR17位點(diǎn)，采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行PAGE凝膠電泳，得到的PAGE凝膠電泳圖如圖5所示。

由圖4可以看出，通過(guò)以父本、母本和夏抗40天的帶型作為參照，將待檢測(cè)的子一代群體中每一個(gè)體的電泳帶型是否與夏抗40天的帶型是否一致，與夏抗40天的帶型一致的則表明為子一代真雜合體，否則為非子一體真雜合體，根據(jù)計(jì)算，子一代中真雜合體純度達(dá)到92％。

實(shí)施例5

對(duì)商品夏抗40天蘿卜品種進(jìn)行純度鑒定，鑒定方法如下：

按照實(shí)施例1的方法對(duì)夏抗40天子一代進(jìn)行DNA提取。將商品夏抗40天蘿卜品種和父本、母本和夏抗40天采用實(shí)施例1的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增SSR75位點(diǎn)，采用實(shí)施例2的方法進(jìn)行PAGE凝膠電泳，得到的PAGE凝膠電泳圖如圖5所示。

由圖5可以看出，通過(guò)以父本、母本和夏抗40天的帶型作為參照，將待檢測(cè)的子一代的電泳帶型是否與夏抗40天的帶型是否一致，與夏抗40天的帶型一致的則表明子一代為雜合種，否則為純種；根據(jù)計(jì)算，子一代中純度達(dá)到95％。

實(shí)施例6

夏抗40品種在田間種植后采用人工觀察形態(tài)指標(biāo)及稱量畝產(chǎn)等指標(biāo)，田間表現(xiàn)如圖6，并對(duì)蘿卜的根、葉等重要植物學(xué)性狀進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3。從根形上看，夏抗40天蘿卜為長(zhǎng)圓柱形，葉形為板葉。結(jié)合葉形和根形表現(xiàn)，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)夏抗40天蘿卜田間純度可達(dá)92.21±2.35％(M±SD)。

表3夏抗40天植物學(xué)性狀

由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明提供了耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記，為SSR17或SSR75。本發(fā)明通過(guò)對(duì)耐熱蘿卜品種--夏抗40天篩選得到2個(gè)EST-SSR分子標(biāo)記，并且所述SSR17和SSR75具有共顯性表達(dá)特性，利用具有共顯性關(guān)系的2個(gè)EST-SSR分子標(biāo)記對(duì)商品種耐熱蘿卜品種--夏抗40天的群體純度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其純度高達(dá)92％以上，同田間表型一致，因此，所述2個(gè) EST-SSR分子標(biāo)記能夠用于耐熱蘿卜品種的純度檢測(cè)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 黃岡師范學(xué)院

<120> 耐熱蘿卜EST-SSR分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaagcagatg attgcaaaac cttaagccat tctaacaaaa gaaaacttgc agaagacatt 60

gatgatacag catcaccacc accaccatca tcatcatcat catcatcatc aagttctgat 120

gattcttctg tcgaggactt tccatcttca aaacggatg 159

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggggagtta gtgggaagaa gaggaatgta gcagcagcag cacatggtgg tggtgggaag 60

aaaaaggatt gtgatgatga aaagttggtg ttttttgatg atcaagtggt gaaggagaag 120

gtggtggtag aggagagtgt tactgagaag aaagttgaac agtttttcaa gggtttgaag 180

tcaaataatg agagagctgt ggctagtggt ggtggtggtg gtggtgatgg agagcctttc 240

cttgtgacga 250

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaagcagatg attgcaaaac c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catccgtttt gaagatggaa a 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggggagtta gtgggaagaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcgtcacaag gaaaggctct 20