本發(fā)明屬于表面分子印跡聚合物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法。

背景技術(shù)：

菠蘿蛋白酶(bromelain,BR)是從鳳梨屬植物菠蘿中提取的半胱氨酸巰基蛋白水解酶，也稱鳳梨酶或鳳梨酵素。因其可以將蛋白質(zhì)、酰胺、肽和脂等分解成小分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，常常被當(dāng)做食品的添加劑，廣泛的應(yīng)用于肉質(zhì)的嫩化、啤酒和白酒的澄清、干酪生產(chǎn)和水解蛋白等方面。此外，菠蘿蛋白酶在醫(yī)藥方面具有極高的藥物價(jià)值和治療價(jià)值。研究表明菠蘿蛋白酶具有消炎、抗腫瘤、抑制血小板聚集、溶解纖維蛋白、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和免疫、及皮膚清創(chuàng)的特性，也具有促進(jìn)藥物的吸收、促進(jìn)傷口愈合和改善心血管循環(huán)系統(tǒng)的作用。目前，商業(yè)化分離純化菠蘿蛋白酶的方法主要有：高嶺土吸附法、沉淀法、膜分離法以及單寧沉淀法和超濾濃縮法等。但這些分離方法普遍存在生產(chǎn)工藝繁雜，提取效率低，選擇性差，對(duì)環(huán)境有污染等問(wèn)題。因此，需要一種特異性強(qiáng)、分離效率高、穩(wěn)定性好的從復(fù)雜基質(zhì)中提取菠蘿蛋白酶的分離分析方法。

分子印跡技術(shù)(molecularly imprinting technique,MIT)是一種合成對(duì)特定模板分子具有專一識(shí)別能力的分子印跡聚合物的新型技術(shù)。由于其具有結(jié)構(gòu)預(yù)定性、識(shí)別特異性、性質(zhì)穩(wěn)定性和廣泛適用性的特點(diǎn)，已成功的應(yīng)用于分離分析、仿生催化、藥物釋放、生物傳感器等領(lǐng)域。目前，小分子的印跡聚合物技術(shù)已趨于成熟，但對(duì)于水溶性蛋白質(zhì)的分子印跡聚合物的制備，由于蛋白質(zhì)存在體積龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、可結(jié)合位點(diǎn)多、容易變性失活等特點(diǎn)，常規(guī)的合成印跡聚合物的方法對(duì)其印跡比較困難，適用性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，具有簡(jiǎn)單方便、分離效率高、特異性強(qiáng)和可重復(fù)利用的優(yōu)點(diǎn)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)將石榴皮粉末加入草酸鐵銨水溶液中得到質(zhì)量濃度為350.0mg/mL混合液，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)取石榴皮磁性碳材料加入Tris緩沖液中得到其質(zhì)量濃度為2.0～8.0mg/mL的混合液，再加入模板分子菠蘿蛋白酶使其質(zhì)量濃度在1.0～2.0mg/mL之間，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入功能單體多巴胺使其質(zhì)量濃度在2.0～10.0g/L之間，反應(yīng)溫度為25～40℃，磁力攪拌6～24h，將得到的聚合物離心、干燥，用洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物。

所述的步驟1)中草酸鐵銨水溶液濃度為0.8M。

所述的步驟2)中Tris緩沖液pH值為8.0～8.6。

所述的步驟2)中洗脫劑為2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液或2％氯化鈉-2％冰醋酸混合溶液。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

以石榴皮碳化得到的磁性多孔碳材料為載體，結(jié)合多巴胺自聚合技術(shù)，通過(guò)表面印跡法溫和的制備了菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物。制備過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低廉，得到的印跡聚合物具有特異性強(qiáng)、分離效率高、可重復(fù)利用和吸附平衡時(shí)間短等特點(diǎn)，極大了提高了對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附容量。并且，由于其具有磁響應(yīng)性，在外加磁場(chǎng)的條件下可實(shí)現(xiàn)對(duì)聚合物的快速分離，為蛋白質(zhì)的分離和純化提供了一種新方法。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1石榴皮磁性碳材料和菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的掃描電鏡圖，其中圖1a為石榴皮磁性碳材料；圖1b為菠蘿蛋白酶印跡聚合物(MIP)；圖c為空白分子印跡聚合物(NIP)。

圖2為實(shí)施例1菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的吸附動(dòng)力學(xué)曲線圖。

圖3為實(shí)施例1菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的靜態(tài)吸附曲線圖。

圖4為實(shí)施例1菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物和空白的分子印跡聚合物對(duì)溶菌酶(Lyz)、菠蘿蛋白酶(BR)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和胃蛋白酶(pepsin)的吸附量柱狀圖。

圖5為實(shí)施例1～4合成過(guò)程中石榴皮磁性碳材料含量對(duì)菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物和空白分子印跡聚合物吸附效果的影響柱狀圖。

圖6為實(shí)施例5～8合成過(guò)程中功能單體多巴胺含量對(duì)菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物和空白分子印跡聚合物吸附效果的影響柱狀圖。

圖7為實(shí)施例9～11合成過(guò)程中合成時(shí)間對(duì)菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物和空白分子印跡聚合物吸附效果的影響柱狀圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

本實(shí)施例的有益效果為：

用實(shí)施例1制備得到的菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物進(jìn)行搖床吸附實(shí)驗(yàn)，吸附后的上清液用熒光分光光度儀于280nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)熒光光譜圖計(jì)算得到其對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附量為135mg/g、印跡因子2.25。

參照?qǐng)D1，從圖1可以看出，與圖a石榴皮磁性碳材料的掃描電鏡圖相比，合成的菠蘿蛋白酶印跡聚合物(MIP)和空白分子印跡聚合物(NIP)的表面明顯有粗糙顆粒附著，證明了分子印跡聚合物涂層的沉積。

參照?qǐng)D2，從圖2可以看出，隨著吸附時(shí)間的增加，印跡材料對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附量不斷上升，40min時(shí)基本達(dá)到吸附平衡，飽和吸附量為135mg/g。實(shí)驗(yàn)表明，印跡材料具有較快的吸附速率，平衡時(shí)間較短。原因在于一方面實(shí)驗(yàn)采用具有較大比表面積的磁性多孔碳材料，導(dǎo)致吸附速度加快；另一方面表面印跡法形成的聚多巴胺層中的印跡孔穴及孔道較淺，菠蘿蛋白酶分子擴(kuò)散阻力小，很容易進(jìn)入印跡孔穴與結(jié)合位點(diǎn)接觸。

參照?qǐng)D3，從圖3可以看出，MIPs對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附容量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于NIPs對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附容量。當(dāng)菠蘿蛋白酶的初始濃度大于180ug/mL時(shí)，MIPs對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附量無(wú)明顯變化達(dá)到吸附平衡，飽和吸附量為134mg/g、印跡因子為2.21，證明了合成的印跡聚合物存在特異性吸附孔穴。

參照?qǐng)D4，從圖4可以看出，印跡聚合物對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附能力明顯強(qiáng)于其他蛋白質(zhì)。印跡聚合物表面的聚合物薄層內(nèi)分布有大量菠蘿蛋白酶的印跡孔穴，這些孔穴在尺寸大小、空間結(jié)構(gòu)和作用位點(diǎn)等方面與菠蘿蛋白酶高度匹配，與溶菌酶(Lyz)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和胃蛋白酶(pepsin)的匹配度低，導(dǎo)致四者被吸附能力明顯弱于菠蘿蛋白酶。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了印跡材料對(duì)菠蘿蛋白酶具有特異的識(shí)別選擇性和高度的結(jié)合親和性。

實(shí)施例2，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.04g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，加入0.12g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例3，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.08g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例4，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.10g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例5，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.08g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例6，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.10g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例7，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.14g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例8，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.16g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例9，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌6h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例10，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌18h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例11，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌24h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

實(shí)施例12，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.5的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，35℃磁力攪拌24h，將得到的聚合物離心、干燥。用2％氯化鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

空白分子印跡聚合物(NIP)的合成與洗脫方法與此相同，只是在合成過(guò)程中未加入模板分子菠蘿蛋白酶。

本實(shí)施例的有益效果為：

用實(shí)施例12制備得到的菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物進(jìn)行搖床吸附實(shí)驗(yàn)，吸附后的上清液用熒光分光光度儀于280nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)熒光光譜圖計(jì)算得到其對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附量為94mg/g、印跡因子1.49。

表1為實(shí)施例1～12分子印跡聚合物合成過(guò)程中各反應(yīng)物的用量表。

參照?qǐng)D5，從實(shí)施例1～4所得的合成過(guò)程中石榴皮磁性碳材料含量對(duì)菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)和空白分子印跡聚合物(NIP)吸附效果的影響柱狀圖可以看出，加入石榴皮磁性碳材料為60mg時(shí)，合成的聚合物有最大的吸附量和較好的印跡因子。

參照?qǐng)D6，從實(shí)施例5～8合成過(guò)程中功能單體多巴胺含量對(duì)菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)和空白分子印跡聚合物(NIP)吸附效果的影響柱狀圖可以看出，隨著多巴胺加入量的增多印跡孔穴也不斷增多，在120mg時(shí)印跡聚合物達(dá)到最大吸附量，進(jìn)一步的加入多巴胺會(huì)破壞原有的印跡位點(diǎn)，增大非特異性吸附而使得印跡因子下降。

參照?qǐng)D7，從實(shí)施例9～11合成時(shí)間對(duì)菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)和空白分子印跡聚合物(NIP)吸附效果的影響柱狀圖可以看出，最佳的合成時(shí)間為12h，繼續(xù)延長(zhǎng)制備的時(shí)間會(huì)使聚合物涂層過(guò)厚，阻止模板蛋白對(duì)印跡位點(diǎn)的吸附，而使印跡效果變差。

實(shí)施例13，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.0的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，25℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

本實(shí)施例的有益效果為：

用實(shí)施例13制備得到的菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物進(jìn)行搖床吸附實(shí)驗(yàn)，吸附后的上清液用熒光分光光度儀于280nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)熒光光譜圖計(jì)算得到其對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附量為124mg/g、印跡因子2.10。

實(shí)施例14，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.3的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，30℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

本實(shí)施例的有益效果為：

用實(shí)施例14制備得到的菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物進(jìn)行搖床吸附實(shí)驗(yàn)，吸附后的上清液用熒光分光光度儀于280nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)熒光光譜圖計(jì)算得到其對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附量為130mg/g、印跡因子2.21。

實(shí)施例15，一種磁性碳材料表面菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)取70.0g石榴皮粉末加入200mL 0.8M草酸鐵銨水溶液中，80℃浸泡3d，在100℃下干燥后通入氮?dú)猓?50℃碳化3h，將得到的黑色固體粉碎，用蒸餾水和無(wú)水乙醇洗滌得到石榴皮磁性碳材料；

2)稱取0.06g石榴皮磁性碳材料加入20mL pH 8.6的Tris緩沖液中，再加入0.02g模板分子菠蘿蛋白酶，室溫?cái)嚢?h進(jìn)行預(yù)聚合，然后加入0.12g功能單體多巴胺，40℃磁力攪拌12h，將得到的聚合物離心、干燥，用2％十二烷基磺酸鈉-2％冰醋酸混合溶液作為洗脫劑除去模板分子菠蘿蛋白酶，之后用蒸餾水洗滌至中性，60℃干燥得到菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物(MIP)。

本實(shí)施例的有益效果為：

用實(shí)施例15制備得到的菠蘿蛋白酶分子印跡聚合物進(jìn)行搖床吸附實(shí)驗(yàn)，吸附后的上清液用熒光分光光度儀于280nm激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)熒光光譜圖計(jì)算得到其對(duì)菠蘿蛋白酶的吸附量為132mg/g、印跡因子2.13。