本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及土曲霉菌及其在生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：纖維素酶是一種能降解纖維素物質(zhì)并產(chǎn)生葡萄糖的復(fù)合酶，它主要是由三種具有不同催化作用并相互之間起協(xié)同作用的酶組合而成的。具有不同的催化功能的三種酶分別是：內(nèi)切葡聚糖酶（CX酶）、外切葡聚糖酶(C1酶)、β-葡萄糖苷酶(BG酶)，這三種成分組成一個誘導(dǎo)型復(fù)合酶系。纖維素酶對纖維素具有專一、高效的水解作用，產(chǎn)生有多種作用的糖類化合物，使其在制漿造紙行業(yè)、能源生產(chǎn)、食品加工、飼料工業(yè)等方面都有很廣泛的應(yīng)用。蔗渣是一種重要的制漿造紙資源，傳統(tǒng)的蔗渣制漿多采用堿法化學(xué)制漿，在化學(xué)制漿前進行酶的預(yù)處理是提高蔗渣制漿效果、減少污染的有效措施。傳統(tǒng)的酶預(yù)處理主要是使用半纖維素酶等降解半纖維素（蔗渣造紙制漿用復(fù)合酶液的生產(chǎn)方法及應(yīng)用，申請?zhí)枺?01310490346.X），我們考慮采用纖維素酶對蔗渣進行預(yù)處理。不同來源的纖維素酶對不同性質(zhì)的纖維素酶作用效果不一樣，實驗證明，市售的纖維素酶對蔗渣纖維素的降解效果有待提高，因此獲得對蔗渣纖維素分解效率高的纖維素酶就非常必要。纖維素酶主要是由微生物發(fā)酵得到。能產(chǎn)纖維素酶的微生物有細菌、放線菌和絲狀真菌等，其中絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶酶系較全，且其產(chǎn)生的酶多為胞外酶，便于后期的分離提取，被研究得最多。因此，本發(fā)明以甘蔗渣為唯一碳源，改造的査式培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，從土壤中篩選能高效降解蔗渣纖維素的纖維素酶產(chǎn)生菌，獲得幾株產(chǎn)酶效率較高的絲狀真菌，其中產(chǎn)酶效率最高、性質(zhì)最優(yōu)的一株經(jīng)鑒定為土曲霉，其所產(chǎn)的纖維素酶能耐高溫、降解蔗渣纖維素效果良好。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株產(chǎn)纖維素酶的土曲霉菌株，以及利用該菌株生產(chǎn)纖維素酶的方法。本發(fā)明所提供的土曲霉（Aspergillusterreus），名稱為gd2129，已于2016年10月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC，地址為：中國湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山），保藏號為CCTCCM2016586。本發(fā)明所述土曲霉gd2129是一株篩選自土壤的菌株。所述土曲霉（Aspergillusterreus）gd2129CCTCCM2016586菌株是從廣西壯族自治區(qū)永福制糖廠蔗渣堆放處取得土壤篩選出來的。取1-3g土樣，用無菌水震蕩搖勻，吸取適量的土壤溶液于富集培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，富集培養(yǎng)基的唯一碳源為蔗渣纖維素，保證了篩選出的菌株能專一、高效地降解蔗渣纖維素。選取蔗渣纖維崩解快的富集液，稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基平皿于30℃培養(yǎng)進行分離，然后將出現(xiàn)的單菌落接種于剛果紅鑒別培養(yǎng)基上，再在30℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72小時，通過透明圈直徑大小與菌落直徑大小的比值來篩選產(chǎn)纖維素酶菌種。所述土曲霉gd2129富集培養(yǎng)基的配制方法為：NaNO30.3-0.8g，KH2PO40.5-1.5g，MgSO40.3-0.8g，KCl0.3-0.8g，F(xiàn)e2(SO4)3微量，加水至1000ml，自然pH，以蔗渣纖維為唯一碳源。所述土曲霉gd2129初篩培養(yǎng)基的配制方法為：羧甲基纖維素鈉3-8g，瓊脂15-20g，NaN032-4g，K2HP040.5-1.5g，KCl0.3-0.8g，MgS040.3-0.8g，F(xiàn)eS040.05-0.015g，加蒸餾水定容至1000ml，自然pH。所述土曲霉gd2129剛果紅鑒別培養(yǎng)基的配制方法為：瓊脂15-20g，剛果紅0.1-0.3g，NaN032-4g，MgS040.3-0.8g，羧甲基纖維素鈉3-7g，K2HP040.5-1.5g，F(xiàn)eS040.01g，KCl0.5g，加蒸餾水定容至1000ml。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)纖維素酶的方法，是發(fā)酵利用土曲霉gd2129菌株得到纖維素酶。所述利用土曲霉（Aspergillusterreus）gd2129CCTCCM2016586菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配制方法如下：稻草6-10g，豆餅粉1-3g，無機鹽母液8-13mL。無機鹽母液的組成為：KH2P042-4g，K2HP041-3g，MgS04·7H2O0.5-2g，無水CaCl20.2-1g，加水至500mL，自然pH。所述土曲霉gd2129的發(fā)酵條件可為：溫度為28-32℃，初始pH為4.0-5.5，接種量按質(zhì)量計為10-15%，種齡為72h，發(fā)酵時間為5天；所述具體發(fā)酵條件優(yōu)選：發(fā)酵時間為120h，接種量為15%，C：N為4:1，種齡為72h，pH為5.0。使用本發(fā)明提供的方法，土曲霉gd2129發(fā)酵纖維素酶濾紙酶活產(chǎn)量可以達到3.1u/g。上述所述濾紙酶活的定義為：在pH5.5，50℃下，酶液每分鐘內(nèi)降解濾紙產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需要的酶量為一個濾紙酶活單位（U）。固體培養(yǎng)物酶活測定方式為：稱量1g固體發(fā)酵物于50mL三角瓶中，用玻璃棒把固體發(fā)酵物打散，再用移液管加10mL無菌水，封口30℃搖床振蕩60min后，用移液槍取1.0mL液體放于1.5mL塑料離心管中，離心機離心3min（轉(zhuǎn)速為12000r/min），然后測其濾紙酶活，用DNS法，酶活單位為U/g。以上任一所述方法制備得到的纖維素酶也屬于本發(fā)明的保護范圍。土曲霉gd2129所發(fā)酵得到的纖維素酶，適合的緩沖液為檸檬酸緩沖液，在pH3-9都有活力，最優(yōu)pH為5.0；在37℃-65℃都有活力，65℃活力還較高，其中最優(yōu)溫度為55℃。為一種高溫纖維素酶。附圖說明圖1土曲霉個體形態(tài)（X400倍）圖2發(fā)酵時間對gd2129產(chǎn)酶的影響圖3不同初始pH對gd2129產(chǎn)酶的影響圖4不同接種量對gd2129產(chǎn)酶的影響圖5不同C:N對gd2129產(chǎn)酶的影響圖6溫度對土曲霉gd2129酶活性質(zhì)的影響。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，比例為質(zhì)量百分比。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例1、土曲霉（Aspergillusterreus）gd2129CCTCCM2016586的獲得一、菌株的獲得土樣：從廣西壯族自治區(qū)永福制糖廠蔗渣堆放處取得土壤。篩選：取1-3g土樣，用無菌水震蕩搖勻，吸取適量的土壤溶液于富集培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)。選取蔗渣纖維崩解快的富集液，稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基平皿于30℃培養(yǎng)進行分離，然后將出現(xiàn)的單菌落接種于剛果紅鑒別培養(yǎng)基上，再在30℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72小時，通過透明圈直徑大小與菌落直徑大小的比值來篩選產(chǎn)纖維素酶菌種。富集培養(yǎng)基：NaNO30.5g，KH2PO41.0g，MgSO40.5g，KCl0.5g，F(xiàn)e2(SO4)3微量，加水至1000ml，自然pH，以蔗渣纖維為唯一碳源。初篩培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉5g，瓊脂17g，NaN033g，K2HP04lg，KCl0.5g，MgS040.5g，F(xiàn)eS040.01g，加蒸餾水定容至1000ml，自然pH。剛果紅鑒別培養(yǎng)基：瓊脂17g，剛果紅0.2g，NaN033g，MgS040.5g，羧甲基纖維素鈉5g，K2HP04lg，F(xiàn)eS040.01g，KCl0.5g，加蒸餾水定容至1000ml。經(jīng)過篩選，得到一株降解蔗渣纖維素的產(chǎn)纖維素酶菌株，將其命名為gd2129。二、菌株鑒定1、形態(tài)特征鑒定菌株在PDA培養(yǎng)基上生長，菌絲為白色，三天后轉(zhuǎn)為黃褐色，分生孢子頭的頂囊半球形，小梗雙層，呈放射狀排列。顯微照片如圖1（X400倍）所示。2、分子鑒定提取菌株基因組DNA，作為PCR擴增模板，采用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')組成的引物對進行ITS序列的擴增。反應(yīng)條件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35cycles；72℃5min。擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果見序列表中的序列1。對測定的序列進行BLAST軟件比較分析，并用MEGA5.0軟件進行同源性分析，菌株gd2129與Aspergillusterreus相似性達99%。根據(jù)形態(tài)特征鑒定和分子鑒定的結(jié)果，菌株gd2129屬于土曲霉（Aspergillusterreus）。土曲霉（Aspergillusterreus）gd2129已于2016年10月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC，地址為：中國湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山），保藏號為CCTCCM2016586。實施例2、土曲霉（Aspergillusterreus）gd2129在纖維素酶生產(chǎn)中的應(yīng)用一、種子培養(yǎng)將土曲霉gd2129接種到PDA斜面上活化。然后接種于種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)72h。種子培養(yǎng)基：K2HP042gNaN033g無水CaCl20.5g葡萄糖15gKH2P043gMgS04·7H2O1.0g加蒸餾水至1000mL，自然pH二、發(fā)酵將種子斜面的孢子用無菌水洗下，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，混勻，30℃培養(yǎng)5天。發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草8g，豆餅粉2g，無機鹽母液10mL。無機鹽母液的組成為：KH2P043g，K2HP042g，MgS04·7H2O1.0g，無水CaCl20.5g，加水至500mL，自然pH。發(fā)酵物濾紙酶活可以達到3.1U/g。酶活力的測定超凈工作臺紫外滅菌30min，滅菌完畢后，在超凈工作臺上，稱量1g固體培養(yǎng)物于50mL三角瓶中，用玻璃棒把固體培養(yǎng)物打散，再用移液管加10mL無菌水，封口30℃搖床振蕩60min后，用移液槍取1.0mL液體放于1.5mL塑料離心管中，離心機離心3min（轉(zhuǎn)速為12000r/min），然后測其濾紙酶活，用DNS法，酶活單位為U/g。DNS法測定纖維素酶活力：取0.5mL上述離心后的上層清液于帶刻度的25mL比色管中，再加入1.0mL檸檬酸緩沖液和一條1cm×6cm的濾紙，濾紙條需折疊成M型紙條，使其完全浸沒在酶液中，再放到50℃恒溫水浴鍋中水浴60min。水浴60min后加3.0mLDNS試劑停止酶反應(yīng)，再在100℃水中水浴5min后，冷卻，定容到25mL搖勻備用，最后以水調(diào)零，在可見分光光度器中測量540nm處的吸光值A(chǔ)1。測酶活時要添加空白對照組和平行對照組?？瞻讓φ战M與實驗組操作基本一樣，僅是不加濾紙反應(yīng)，吸光度為A0。酶活定義：在pH5.5，50℃下，酶液每分鐘內(nèi)降解濾紙產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需要的酶量為一個濾紙酶活單位（U）。實驗的濾紙酶活為X，單位為U/g，按下式計算：式中m——根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得的（A1-A0）對應(yīng)的葡萄糖重量，gM——葡萄糖的摩爾質(zhì)量，為180.2g/molT——酶解反應(yīng)時間，minn——總稀釋倍數(shù)為為1000——轉(zhuǎn)化因子，1mmol=1000μmol四、產(chǎn)酶條件優(yōu)化1、發(fā)酵時間的優(yōu)化按實施例2第二步驟將篩選出的菌株gd2129做發(fā)酵時間的優(yōu)化，從接種后第二天開始測酶活，每24h測一次，以確定最優(yōu)的發(fā)酵時間。發(fā)酵結(jié)果顯示，最優(yōu)發(fā)酵時間為5天。具體結(jié)果見附圖2。2、pH的優(yōu)化用0.1mol/LHCl和0.1mol/LNaOH把發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別調(diào)成4.5、5、5.5、6，依實施例2第二步驟方法發(fā)酵，測發(fā)酵第五天濾紙酶活，以確定較優(yōu)的pH。結(jié)果顯示，較優(yōu)發(fā)酵pH為5.0，具體結(jié)果見附圖3。3、接種量的優(yōu)化種子培養(yǎng)基接種量為10%，15%，20%，25%，依實施例2第二步驟方法發(fā)酵，以確定較優(yōu)的接種量。結(jié)果顯示，最優(yōu)接種量為15%，具體結(jié)果見附圖4。4、C：N的優(yōu)化根據(jù)課題組之前的研究，以稻草為碳源，以豆餅粉為氮源。將固體培養(yǎng)基中稻草和豆餅粉的比例為3:1、4:1、5:1、6:1，依實施例2第二步驟方法發(fā)酵，測發(fā)酵第五天濾紙酶活，以確定較優(yōu)的C：N。結(jié)果顯示，最優(yōu)C:N為4:1，具體結(jié)果見附圖5。實施例3、土曲霉（Aspergillusterreus）gd2129的生產(chǎn)的纖維素酶酶活性質(zhì)一、粗酶液的提取依實施例二進行g(shù)d2129的發(fā)酵，取發(fā)酵好的固體培養(yǎng)物10g，用玻棒攪碎培養(yǎng)物，加入150ml蒸餾水，攪拌均勻，封口30℃搖床振蕩60min后，12000r/min離心3min，上清液為粗酶液。二、緩沖液種類及pH對酶活的影響根據(jù)資料顯示，不同的緩沖液對纖維素酶的酶活有影響，我們選取了常用的檸檬酸緩沖液和醋酸緩沖液進行實驗。依實施例二第三步驟測酶活的方法，取0.5ml的粗酶液分別加入pH3，4，5、6、7的醋酸緩沖液和檸檬酸緩沖液中測酶活，結(jié)果見表1：表1不同pH值和不同緩沖液下gd2129酶活表現(xiàn)pH34567在檸檬酸緩沖液中酶活（U/ml）0.971.842.161.380.92在醋酸緩沖液中酶活（U/ml）1.061.561.711.161.19由表1可看出，粗酶液在檸檬酸緩沖液中的酶活在不同pH時都高于在醋酸緩沖液中的酶活，檸檬酸緩沖液比較適合于土曲霉gd2129。pH5.0為最優(yōu)pH。三、溫度對酶活的影響取粗酶液，依實施例二第三步驟測酶活的方法，以pH5.0的檸檬酸溶液為緩沖液，分別取0.5ml的粗酶液測在其不同溫度下的酶活，結(jié)果如附圖6所示，55℃為最優(yōu)溫度。桂林電子科技大學(xué)<210>1<211>577<212>DNA<213>土曲霉（Aspergillusterreus）GGGTCGGAGTCGGGGTCTTATGGCACCTCCACCCGTGACTATTGTACCTTGTTGCTTCGG60CGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGCGACTCGCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCG120GAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTTTGCAATC180AGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT240GCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGC300GCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGC360TTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGC420ACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGGCG480CCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGG540ATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA577當(dāng)前第1頁1 2 3