本發(fā)明涉及一種可抑制肥大細胞脫顆粒的化合物及其制備方法和用途，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：肥大細胞廣泛分布于皮膚、淋巴組織、子宮、膀胱以及呼吸道和消化道粘膜及粘膜下結(jié)締組織中毛細血管及淋巴管周圍。肥大細胞脫顆粒是很多機體病理反應(yīng)的原因之一，它與腫瘤發(fā)生、血脂清除、血管發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)功能、生殖系統(tǒng)的性周期變化、過敏反應(yīng)等都有不等程度的關(guān)系。肥大細胞不僅在過敏反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，而且在許多疾病的過程中表現(xiàn)出功能的多態(tài)性，如：炎癥反應(yīng)、細胞毒性作用、血管的生長與形成以及免疫調(diào)節(jié)作用等都有肥大細胞的參與。肥大細胞脫顆粒是一復(fù)雜的生物化學過程，且受多種刺激影響。經(jīng)典理論認為變應(yīng)原與肥大細胞表面的IgE分子橋聯(lián)后，使IgE分子發(fā)生變構(gòu)，后者改變了肥大細胞膜的能量代謝和通透性，并促進細胞膜磷脂甲基化過程和鈣離子通道開放。IgE激活的肥大細胞脫顆粒過程主要釋放三種類型的顆粒物質(zhì)來發(fā)揮其生理功能，分別為：1)預(yù)存介質(zhì)，如組胺，β-己糖胺酶(β-hex)、血清素、腫瘤壞死因子(TNF)-α等；2)脂質(zhì)介質(zhì)，主要為前列腺素D2及白三烯類物質(zhì)；3)新合成的介質(zhì)，包括細胞因子及趨化因子。預(yù)存介質(zhì)中的組胺，作為最為人們所熟知的過敏介質(zhì)，在肥大細胞被激活后的幾分鐘內(nèi)即大量釋放，可引起血管擴張，支氣管收縮，血管通透性增加以及平滑肌收縮等一系列與過敏及炎癥相關(guān)的反應(yīng)([J].CellularandMolecularLifeSciences,2011,68(6):965-975)；而以前列腺素及白三烯為代表的脂質(zhì)介質(zhì)的釋放，則是由于細胞內(nèi)鈣流的增加以及MAPK磷酸化引起的，其釋放速度較為迅速，僅次于預(yù)存介質(zhì)的釋放；脂質(zhì)介質(zhì)主要功能為增加機體血管通透性，將免疫效應(yīng)細胞(如白細胞)募集至病灶部位，促進粘液的產(chǎn)生，以及進一步活化神經(jīng)細胞；而新合成的介質(zhì)的釋放，則發(fā)生于肥大細胞被激活的數(shù)小時之后，其可募集免疫效應(yīng)細胞，并進一步促進炎癥的發(fā)生([J].JournalofHistochemistry&Cytochemistry,2014,62(10):698-738)。因此，篩選可抑制肥大細胞活化的化合物具有重要意義。另外，隨著現(xiàn)代工業(yè)化進程的發(fā)展，過敏已成為世界第六大疾病，正給人們帶來持續(xù)性的健康威脅。據(jù)媒體報道，全球約有22％的人群患有過敏性疾病，其中以兒童患者最多，且其患者以每10年23倍的速度持續(xù)增長。由此類推，中國正有兩億多人遭受過敏性疾病的困擾。過敏也可稱作為過敏性疾病，是由環(huán)境中本對人類無害的物質(zhì)引起的免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)([M].LippincottWilliams&Wilkins,2007)。過敏性疾病常見的主要有花粉癥、食物過敏、特應(yīng)性皮炎以及過敏性哮喘等([J].NewEnglandJournalofMedicine,2001,344(1):30-37)。其癥狀主要表現(xiàn)為皮膚紅腫、發(fā)癢，流涕及呼吸急促等。目前臨床上主要使用抗組胺藥和肥大細胞穩(wěn)定劑這兩類藥物用于治療過敏性疾病，而抗組胺藥在用藥后，易出現(xiàn)困倦、嗜睡、精神不集中等癥狀，因此肥大細胞穩(wěn)定劑成為近來研究熱點。肥大細胞穩(wěn)定劑可防止過敏反應(yīng)中肥大細胞脫顆?；蜥尫沤M胺和其它成分或“介質(zhì)”，目前作為肥大細胞穩(wěn)定劑銷售的藥物有色甘酸二鈉，其作用機理是能與敏感的肥大細胞膜外側(cè)的鈣通道結(jié)合，阻止鈣內(nèi)流，抑制肥大細胞脫顆粒，減少組胺、慢反應(yīng)物、白三烯等多種炎性介質(zhì)的釋放，但目前具有類似作用機理的化合物還很有限，本領(lǐng)域還需要繼續(xù)篩選可作為肥大細胞穩(wěn)定劑的新化合物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種可抑制肥大細胞脫顆粒的化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明所述的可抑制肥大細胞脫顆粒的化合物，分子式為C22H26O6，分子量為386.17，具有如下化學結(jié)構(gòu)式：本發(fā)明上述化合物可來源于天然提取物，也可來源于化學合成或來源于以天然提取物為原料的半合成。一種制備本發(fā)明上述化合物的方法，包括如下步驟：a)用75～95vol％乙醇水溶液對辛夷藥材進行回流提取，并過濾和收集濾液；b)用石油醚萃取濾液，并分液和棄去石油醚層，收集水層；c)用乙酸乙酯萃取水層，并分液和棄去水層，收集乙酸乙酯層；d)減壓濃縮乙酸乙酯層，對乙酸乙酯粗提物用MCI柱進行層析分離，流動相依次為乙醇：水＝1:9，2:8，4:6，5:5，6:4，7:3，9:1，根據(jù)薄層層析將流分劃成八部分，記為Fr.E1～E8；e)對記為Fr.E7的流分用LH-20柱進行層析分離，流動相為甲醇，根據(jù)薄層層析將流分劃成十部分，記為Fr.E7A～E7J；f)對記為Fr.E7D的流分用ODS柱進行層析分離，流動相依次為甲醇：水＝40:60，45:55，50:50，55:45，60:4，65:35，70:30，80:20，90:10，100％甲醇，根據(jù)薄層層析將流分劃成十四部分，記為Fr.E7D1～E7D14；g)對記為Fr.E7D10的流分用硅膠柱進行層析分離，流動相依次為二氯甲烷：甲醇＝50:1，40:1，20:1，1:1，根據(jù)薄層層析將流分劃成八部分，記為Fr.E7D10A～E7D10H；h)對記為Fr.E7D10F的流分用半制備液相色譜柱進行分離，流動相為乙腈：水＝48:52，流速為3mL/min，即得到本發(fā)明所述化合物。組成上述流動相中的溶劑比均指體積比。本發(fā)明所述化合物的一種用途，是以所述化合物或該化合物的藥學上可接受的鹽、溶劑化物、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或前體化合物作為活性成分用于制備抑制肥大細胞脫顆粒的藥物。本發(fā)明所述化合物的另一種用途，是以所述化合物或該化合物的藥學上可接受的鹽、溶劑化物、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或前體化合物作為活性成分用于制備肥大細胞穩(wěn)定劑的藥物。本發(fā)明所述化合物的又一種用途，是以所述化合物或該化合物的藥學上可接受的鹽、溶劑化物、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或前體化合物作為活性成分用于制備預(yù)防或/和治療過敏性疾病的藥物。所述過敏性疾病包括特應(yīng)性皮炎、花粉癥、食物過敏和哮喘中的至少一種疾病。本發(fā)明所述藥物的劑型不限，只要是能夠使活性成分有效地到達體內(nèi)的劑型都可以，例如可選自：片劑、膠囊劑、粉末、顆粒劑、糖漿、溶液、懸浮液、注射劑、酊劑、口服液、氣霧劑、口含劑、沖劑、丸劑、散劑等常見劑型或納米制劑等緩釋劑型。本發(fā)明所述藥物中，除了含有主要活性成分之外，還可含有少量的且不影響有效成分的次要成分和/或藥學上可接受的載體，例如：可以含有甜味劑以改善口味、抗氧化劑以防止氧化，以及各種制劑所必要的輔料等。本發(fā)明中所述術(shù)語的定義如下：術(shù)語“藥學上可接受的鹽”是指所述化合物與藥學上可接受的無機酸或有機酸所形成的鹽，所述的無機酸包括但不限于：鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；所述的有機酸包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、1,5-萘二磺酸、亞細亞酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸；所述“藥學上可接受的”是指適用于人而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))，即有合理的效益/風險比的物質(zhì)。術(shù)語“互變異構(gòu)體”是指因分子中某一原子在兩個位置迅速移動而產(chǎn)生的官能團異構(gòu)體，例如：烯醇與相應(yīng)的酮。術(shù)語“立體異構(gòu)體”是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產(chǎn)生的異構(gòu)體，例如：順反異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、構(gòu)象異構(gòu)體等。術(shù)語“前體化合物”是指在體外無活性，但能夠在生物體內(nèi)進行代謝或化學反應(yīng)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明的活性成分，從而發(fā)揮其藥理作用的化合物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著性有益效果：本發(fā)明的研究結(jié)果顯示：本發(fā)明所述化合物可顯著抑制肥大細胞(BMMC)中β-己糖胺酶(β-hex)的釋放，抑制率可達85.57％，具有顯著的抑制肥大細胞脫顆粒的作用，可望作為活性成分用于制備抑制肥大細胞脫顆粒的藥物，進而可作為活性成分用于制備肥大細胞穩(wěn)定劑的藥物和用于制備預(yù)防或/和治療過敏性疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。附圖說明圖1顯示了本發(fā)明所述化合物對PCA模型的過敏性炎癥反應(yīng)的影響；圖2顯示了本發(fā)明所述化合物對組胺誘發(fā)的小鼠毛細血管通透性的影響。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。實施例1：本發(fā)明所述化合物的制備a)用95vol％乙醇水溶液對17.5kg辛夷藥材進行回流提取(提取三次，每次溶劑用量為60L，提取2h)，并過濾和收集濾液；b)用石油醚萃取濾液，并分液和棄去石油醚層，收集水層；c)用乙酸乙酯萃取水層，并分液和棄去水層，收集乙酸乙酯層；d)減壓濃縮乙酸乙酯層，對乙酸乙酯粗提物用MCI柱進行層析分離，流動相依次為乙醇：水＝1:9，2:8，4:6，5:5，6:4，7:3，9:1，根據(jù)薄層層析將流分劃成八部分，記為Fr.E1～E8；e)對記為Fr.E7的流分用LH-20柱進行層析分離，流動相為甲醇，根據(jù)薄層層析將流分劃成十部分，記為Fr.E7A～E7J；f)對記為Fr.E7D的流分用ODS柱進行層析分離，流動相依次為甲醇：水＝40:60，45:55，50:50，55:45，60:4，65:35，70:30，80:20，90:10，100％甲醇，根據(jù)薄層層析將流分劃成十四部分，記為Fr.E7D1～E7D14；g)對記為Fr.E7D10的流分用硅膠柱進行層析分離，流動相依次為二氯甲烷：甲醇＝50:1，40:1，20:1，1:1，根據(jù)薄層層析將流分劃成八部分，記為Fr.E7D10A～E7D10H；h)對記為Fr.E7D10F的流分用半制備液相色譜柱(半制備色譜柱型號：AgilentEclipseXDB-C18，5μm，9.4×250mm)進行分離，流動相為乙腈：水＝48:52，流速為3mL/min，即得到本發(fā)明所述化合物。所述化合物的波譜數(shù)據(jù)如下：分子式：C22H26O6，分子量：386.17，淡黃色蠟狀；HR-EI-MSm/z:386.1725[M]+,(calcdforC22H26O6,386.1729).；UV(MeOH)λmaxnm:207,232,273；IR(KBr)νmaxcm-1:1590,1512,1462,1417,1373,1329,1246,1175,1128,1061,1035,1007,825；1H-NMR(CDCl3,600MHz)δH:3.07(1H,m,H-1),3.11(1H,m,H-5),3.81(3H,s,H-OMe),3.84(3H,s,H-OMe),3.87(6H,s,H-OMe),3.88-3.94(2H,m,H-4a,8a),4.25(1H,dd,J＝9.2,6.6Hz,H-8e),4.29(1H,dd,J＝9.1,6.8Hz,H-4e),4.73(1H,d,J＝5.0Hz,H-2),4.78(1H,d,J＝4.7Hz,H-6),6.57(2H,s,H-10',14'),6.89(2H,d,J＝8.6Hz,H-11,13),7.28(2H,d,J＝8.6Hz,H-10,14)；13C-NMR(CDCl3,151MHz)δC:54.16(C-5),54.63(C-1),55.45(C-15),56.31(C-16,18),60.99(C-17),71.71(C-8),72.21(C-4),85.66(C-6),86.24(C-2),102.91(C-10',14'),114.1(C-11,13),127.47(C-10,14),133.11(C-9),136.99(C-9'),137.55(C-12'),153.56(C-11',13'),159.35(C-12)。實施例2:考察本發(fā)明所述化合物對肥大細胞脫顆粒的影響使用肥大細胞(BMMC細胞)，加入anti-mouse-DNP-IgE過夜后，經(jīng)藥物干預(yù)30min，隨后加入DNP-BSA30min，刺激BMMC細胞發(fā)生脫顆粒，檢測其β-hex釋放量。(1)BMMC細胞培養(yǎng)提取C57BL/6小鼠骨髓，用30ng/LIL-3及10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)四周，檢測肥大細胞純度高于99％后，用10ng/L及10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)，每5天傳代一次。(2)細胞致敏將0.5*106/mLBMMC細胞加入0.1μg/mLanti-mouse-DNP-IgE，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。(3)加藥干預(yù)24h后，加入用HEPES緩沖液稀釋的25μM的本發(fā)明化合物或用HEPES緩沖液稀釋的5μM小白菊內(nèi)酯(肥大細胞穩(wěn)定劑)進行干預(yù)30min。(4)刺激肥大細胞脫顆粒30min后，加入5ng/mLDNP-HSA刺激30分鐘，誘發(fā)脫顆粒。(5)檢測與分析β-hex的釋放取50μL上清液，加入顯色液(p-NAG)50μL，于37℃孵育90min，加入50μL甘氨酸終止反應(yīng)，于405nm處檢測吸光值；然后在細胞中加入50μL1％的triton-100，使細胞中剩余β-hex的全部釋放。同樣取50μL顯色測定剩余β-hex含量；根據(jù)各種所測OD值，按以下公式檢測β-hex釋放率(％)：β-hex釋放率(％)＝上清液OD值/(0.5×上清液OD值+剩余酶孔OD值)×100％。(6)數(shù)據(jù)分析利用軟件SPSS16.0進行數(shù)據(jù)分析，不同干預(yù)組的差異性比較采用t檢驗分析，p<0.05認為組間差異具有統(tǒng)計學意義。(7)實驗結(jié)果本發(fā)明所述化合物對BMMC細胞脫顆粒的具體影響見表1所示。表1對BMMC細胞中β-hex釋放的影響濃度(μM)β-hex的釋放率(％)SEM抑制率(％)模型組32.780.11小白菊內(nèi)酯2512.460.8862.00本發(fā)明所述化合物254.730.4585.57由表1結(jié)果可知：本發(fā)明所述化合物可顯著抑制IgE介導(dǎo)的BMMC細胞中β-hex的釋放，抑制率高達85.57％，可望作為活性成分用于制備抑制肥大細胞脫顆粒的藥物。實施例3：本發(fā)明所述化合物對小鼠被動皮膚過敏的影響B(tài)alb/c小鼠經(jīng)撲爾敏4mg/kg/d或樣品組50mg/kg/d治療4天。在每只小鼠兩只耳廓分別注射小鼠抗天花粉血清0.2mL，注射血清后繼續(xù)給藥或溶劑2天，于末次給藥1h后尾靜脈注射0.5％依文思藍抗原注射液(含1.25mg卵蛋白)0.25mL，30min后處死動物，剪下兩耳廓，置于1mol/L的KOH溶液0.75mL中，于37℃過夜消化，加入3.5mL0.6mol/L的H3PO4溶液和丙酮混合液(5:13，體積比)，離心，取上清液，用分光光度計(640nm)測吸光度。數(shù)據(jù)為mean±SE，n＝10。***P<0.0001。(1)Balb/c小鼠的飼養(yǎng)Balb/c小鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)小鼠實驗飼養(yǎng)室(溫度：22～23℃，濕度：50～70％，工作照度：150～300Lx，動物照度：15～20Lx，噪聲標準<60dB)；試驗前，適應(yīng)環(huán)境2周。(2)Balb/c小鼠的分組Balb/c小鼠50只，按體重隨機分為模型對照組(10只)、本發(fā)明所述化合物組(10只)和撲爾敏陽性對照組(10只)進行藥效學實驗。(3)小鼠抗天花粉血清制備于小鼠兩后足墊分別皮下注射以氫氧化鋁凝膠配制的0.25％天花粉液50μL，致敏14d后將小鼠放血處死，制備小鼠抗天花粉血清，于-20℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?4)藥物處理撲爾敏陽性藥對照組：將撲爾敏藥物溶解于含有10％助溶劑的雙蒸水中，給予4mg/kg/d撲爾敏；本發(fā)明所述化合物組：將本發(fā)明所述化合物溶解于含有10％助溶劑的雙蒸水中，分別給予50mg/kg/d本發(fā)明所述化合物；模型對照組：給予含有10％助溶劑的雙蒸水；治療6天后，分別測定各組不同處理后的耳廓吸光度。詳細測試結(jié)果如圖1所示。由圖1可見：與模型對照Balb/c小鼠組小鼠相比，本發(fā)明所述化合物組可以顯著抑制PCA模型的過敏性炎癥反應(yīng)，***P<0.0001。實施例4：本發(fā)明所述化合物對組胺誘發(fā)的小鼠毛細血管外顯率的影響B(tài)alb/c小鼠50只，雌雄各半，隨機分成6組，包括模型組、撲爾敏組(4mg/kg)、樣品組。灌胃給藥，連續(xù)5d，于末次給藥30min后，腹部皮內(nèi)注射組胺10μg/mL，形成一小皮丘，立即尾靜脈注射0.5％依文思藍0.0lmL/g，30min后處死動物，用直徑0.8cm的打孔器打下兩片藍染皮片，放入3mL生理鹽水-丙酮(3:7，體積比)混合液中，在37℃恒溫水浴鍋中放置24h，浸出液離心，取上清液，用分光光度計(610nm)測吸光度。計算抑制百分率，抑制率(％)＝(模型組吸光度－樣品組吸光度)/模型組吸光度×100％。數(shù)據(jù)為mean±SE，n＝10。***P<0.0001。(1)Balb/c小鼠的飼養(yǎng)Balb/c小鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)小鼠實驗飼養(yǎng)室(溫度：22～23℃，濕度：50～70％，工作照度：150～300Lx，動物照度：15～20Lx，噪聲標準<60dB)；試驗前，適應(yīng)環(huán)境2周。(2)Balb/c小鼠的分組Balb/c小鼠50只，按體重隨機分為模型對照組(10只)、本發(fā)明所述化合物組(10只)和撲爾敏陽性對照組(10只)進行藥效學實驗。(3)藥物處理撲爾敏陽性藥對照組：將撲爾敏藥物溶解于含有10％助溶劑的雙蒸水中，給予4mg/kg/d撲爾敏；本發(fā)明所述化合物組：將本發(fā)明所述化合物溶解于含有10％助溶劑的雙蒸水中，分別給予50mg/kg/d本發(fā)明所述化合物；模型對照組：給予含有10％助溶劑的雙蒸水；治療5天后，于末次給藥30min后，腹部皮內(nèi)注射組胺10μg/mL，形成皮丘，并立即尾靜脈注射0.5％依文思藍0.0lmL/g，30min后處死動物，取兩片藍染皮片萃取，于37℃恒溫水浴鍋中放置24h，檢測吸光度。詳細測試結(jié)果如圖2所示。由圖2可見：在給藥干預(yù)5天后，與模型對照組相比，本發(fā)明所述化合物組可顯著抑制組胺致小鼠毛細血管通透性增高，其抑制率為52.40％，***P<0.0001。當前第1頁1 2 3